本发明属于细胞培养基
技术领域：
，具体涉及一种人体外周血淋巴细胞培养基及其制备方法。
背景技术：
：人体外周血液中的小淋巴细胞，几乎都处在GI期(GO期)，一般情况下是不再分裂的，在培养液中加入植物凝血素PHA时，这种小淋巴细胞受刺激转化为淋巴母细胞，随后进入有丝分裂，这样经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得部分有丝分裂细胞。这种方法已为临床医学、病毒学、药理学、遗传毒性学等方面广泛应用。目前，影响人体外周血淋巴细胞生长的原因有：(1)病毒或微生物感染：当细胞放置于体外培养时，与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物质的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存的基本条件；(2)培养温度不恒定：维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度，如果温度有偏离，细胞的正常代谢会受到影响，甚至导致细胞死亡。(3)营养物质缺乏：充足的营养物质时细胞正常代谢生长的最重要前提，如在细胞长期培养过程中，一些营养物质会被细胞代谢消耗，若供应不足会导致细胞生长减慢，影响细胞各项功能，甚至会导致细胞凋亡，因此，在细胞培养过程中需要及时补加营养物质来满足细胞生长所需。(4)气体环境：氧气和二氧化碳是维持细胞生存的必要条件之一，氧气的功能是参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需要的各种成分；二氧化碳的主要功能是维持细胞培养体系的pH。(5)pH不稳定：适宜的pH环境是细胞生长的重要前提，而在细胞培养过程中产生的代谢物会影响pH变化，从而影响细胞生长。因此开发一种适宜细胞生长的培养基，是解决上述问题的关键。传统的培养基一般是在合成培养基中添加血清，但血清来源复杂，难以确保质量均一，同时血清中可能含有病毒等对细胞生长有害的因子。并且，在细胞培养过程中，只能通过操作无菌和环境无菌来确保无菌的环境。中国专利(CN101550408B)公开了一种人体外周血淋巴细胞培养基，其包括：RPMI1640液体培养基77-81.9％、牛血清10-14.9％、PHA4-6％、非硫酸化糖胺聚糖2-5％、CPPs2-5％和双抗0.05-0.1％。该培养基具有淋巴细胞转换率与淋巴细胞分裂指数高，试剂稳定性好的优势。但是在培养基中采用青霉素、链霉素虽然能够有效抑制微生物和病毒的感染，但是在一定程度上也会影响细胞的生长。培养集中添加有牛血清，则会存在血清带来的各种风险。因此，目前仍需要开发一种效果优良的人外周淋巴细胞培养基。技术实现要素：针对现有细胞培养基存在容易被病毒或微生物感染、营养物质缺乏和pH不稳定等问题，本发明提供了一种人体外周血淋巴细胞培养基及其制备方法，能够有效抑制微生物和病毒的作用，能够促进细胞增殖，缩短细胞培养周期，具有淋巴细胞转化率与淋巴细胞分裂指数高，试剂稳定性好的优势。本发明通过以下技术方案实现：一种人体外周血淋巴细胞培养基，主要包含以下成分及其浓度：RPMI1640培养基50-56g/L，Ham’s12培养基20-30g/L，牛血清1-2g/L，透明质酸3-4.5g/L，酪蛋白磷酸肽3-4.5g/L，植物凝血素4.5-5.5g/L，枸杞多糖85-95mg/L，黄岑苷1-5g/L和乳酸链球菌素0.1-0.7g/L。优选地，所述人体外周血淋巴细胞培养基由以下成分及其浓度组成：RPMI1640培养基55g/L，Ham’s12培养基27g/L，牛血清1.68g/L，透明质酸3.75g/L，酪蛋白磷酸肽4.12g/L，植物凝血素5.32g/L，枸杞多糖89.3μg/mL，黄岑苷4.2g/L和乳酸链球菌素0.58g/L。黄岑苷(C21H18O11，CASNo.21967-41-9)属于黄酮类化合物，研究表明黄岑苷具有抑菌作用，并且黄岑苷具有有效抑制细胞凋亡的作用。乳酸链球菌素(Nisin)是乳酸链球菌产生的一种多肽物质，由34个氨基酸残基组成，分子量约为3500Da。研究证明，乳酸链球菌素可抑制大多数革兰氏阳性细菌，并对芽孢杆菌的孢子有强烈的抑制作用。本发明培养基中添加一定浓度的黄岑苷和乳酸链球菌素，能够起到有效地抑菌效果，并且能够促进细胞的转化。研究表明，枸杞多糖与PHA协同能够促进人体外周血淋巴细胞的增殖，本发明经过大量实验筛选得到的枸杞多糖和PHA最佳协同作用浓度为89.3μg/mL与5.32g/L。优选地，所述人体外周血细胞培养基制备方法，分为以下步骤：(1)准确称取RPMI1640和Ham’s12培养基干粉后置于消毒容器内，添加超纯水稀释后搅拌混匀，得溶液I；(2)采用巴氏消毒法将牛血清溶解后低温处理后加入溶液I中，得溶液II；(3)将PHA、透明质酸，酪蛋白磷酸肽，枸杞多糖，黄岑苷，乳酸链球菌素加入溶液II，充分混匀后置负压过滤灭菌，即得。本发明培养基与现有培养基相比具有能够有效抑制微生物和病毒的作用，能够促进细胞增殖，缩短细胞培养周期，具有淋巴细胞转化率与淋巴细胞分裂指数高，试剂稳定性好的优势。具体实施例以下结合实施例及试验例对本发明技术方案进行说明。原料来源：RPMI1640培养基5，Ham’s12培养基购于北京索莱宝科技有限公司；枸杞多糖，购于上海将来实业股份有限公司；乳酸链球菌素，购于奇泓生物科技有限公司。实施例1一种人体外周血淋巴细胞培养基一种人体外周血淋巴细胞培养基，由以下成分及其浓度组成：RPMI1640培养基55g/L，Ham’s12培养基27g/L，牛血清1.68g/L，透明质酸3.75g/L，酪蛋白磷酸肽4.12g/L，植物凝血素5.32g/L，枸杞多糖89.3μg/mL，黄岑苷4.2g/L和乳酸链球菌素0.58g/L。上述培养基的制备方法为：(1)准确称取RPMI1640和Ham’s12培养基干粉后置于消毒容器内，添加超纯水稀释后搅拌混匀，得溶液I；(2)采用巴氏消毒法将牛血清溶解后低温处理后加入溶液I中，得溶液II；(3)将PHA、透明质酸，酪蛋白磷酸肽，枸杞多糖，黄岑苷，乳酸链球菌素加入溶液II，充分混匀后置负压过滤灭菌，即得。实施例2一种人体外周血淋巴细胞培养基一种人体外周血淋巴细胞培养基，由以下成分及其浓度组成：RPMI1640培养基50g/L，Ham’s12培养基20g/L，牛血清1g/L，透明质酸3-g/L，酪蛋白磷酸肽3g/L，枸杞多糖85mg/L，植物凝血素4.5g/L，黄岑苷1g/L和乳酸链球菌素0.1g/L。上述培养基制备方法与实施例1类似。实施例3一种人体外周血淋巴细胞培养基一种人体外周血淋巴细胞培养基，由以下成分及其浓度组成：RPMI1640培养基56g/L，Ham’s12培养基30g/L，牛血清2g/L，透明质酸4.5g/L，酪蛋白磷酸肽4.5g/L，枸杞多糖95mg/L，植物凝血素5.5g/L，黄岑苷5g/L和乳酸链球菌素0.7g/L。上述培养基制备方法与实施例1类似。对比例1一种人体外周血淋巴细胞培养基一种人体外周血淋巴细胞培养基，由以下成分及其浓度组成：RPMI1640培养基55g/L，Ham’s12培养基27g/L，牛血清1.68g/L，透明质酸3.75g/L，酪蛋白磷酸肽4.12g/L，植物凝血素5.32g/L，枸杞多糖89.3μg/mL和乳酸链球菌素4.78g/L。上述培养基制备方法与实施例1类似。与实施例1的区别在于，未添加黄岑苷，而乳酸链球菌素的添加量为实施例1中黄岑苷和乳酸链球菌素之和。对比例2一种人体外周血淋巴细胞培养基一种人体外周血淋巴细胞培养基，由以下成分及其浓度组成：RPMI1640培养基55g/L，Ham’s12培养基27g/L，牛血清1.68g/L，透明质酸3.75g/L，酪蛋白磷酸肽4.12g/L，植物凝血素5.32g/L，枸杞多糖100μg/mL，黄岑苷4.2g/L和乳酸链球菌素0.58g/L。上述培养基制备方法与实施例1类似。与实施例1的区别在于，枸杞多糖浓度为100μg/mL。试验例1培养基质量测试测试培养基：实施例1-3制备得到的培养基以及对比例1-2制备得到的培养基。测试内容：(1)无菌检测使用平板法检测，取羊血琼脂平板1块和沙保弱琼脂平板1块，平衡至室温。取上述测试培养基为样品经4000rpm离心15min后从样品管底部吸取样品，每块平板100μL，用接种针划线。将平板放入37℃培养箱中，培养48h后观察结果为阴性，样品合格。(2)内毒素检测使用凝胶法检测，取上述测试培养基为样品经稀释后，同阴性对照、阳性对照、供试品阳性对照分别加入经无菌检查用水复融后的鲎试剂中，每种平行两管。结果为阴性对照管为阴性，阳性对照管为阳性，供试品阳性对照管为阳性且样品管为阴性，样品合格。(3)支原体检测为PCR法检测将上述测试培养基为样品进行沸水浴10min后经12000rpm离心3min后使用，采用25μL体系对待测样品、阳性对照、阴性对照进行PCR扩增；扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪上观察检测结果。检测结果为阴性，样品合格。试验例2细胞培养基淋巴细胞转换率与淋巴细胞分裂指数比较试验对象：实施例1-3及对比例1-2制备得到的培养基试验内容：采血、接种和培养：用2.5％碘酒、75％酒精消毒瓶盖，用酒精灯火焰过烤，无菌条件下抽取患者外周血0.5-1mL，每瓶培养基加20滴左右，轻摇均匀，尽量避免培养物与瓶盖接触；置36℃培养箱中培养72小时，每隔12小时左右轻摇1次，以促进细胞生长增殖；细胞培养：收获前2小时左右加秋水仙素，最终浓度为0.02μg/mL培养液，摇匀后置培养箱中继续培养，以抑止细胞在分裂中期。从培养箱中取出培养瓶终止培养，摇匀后移至10mL尖底离心管中，尽量收集培养细胞。2000rpm离心8分钟。淋巴细胞转换率的检测与计算方法：淋转率＝转化淋巴细胞数/1000x100％。即每1000个细胞中转化淋巴细胞的百分数。淋巴细胞分裂指数检测与计算方法：分裂指数＝分裂细胞数/(1000-分裂细胞数)x100％。即每1000个细胞中的分裂细胞数比上未分裂细胞数的百分数。结果：数据比较，检测结果如表1示：表1不同细胞培养基淋巴细胞转换率与淋巴细胞分裂指数比较检测指标实施例1实施例2实施例3对比例1对比例2淋巴细胞转化率≥63％≥59％≥61％6-8％24-37％分裂指数≥7.5％≥7.1％≥7.0％0％1-3％由表1可知，实施例制备得到的培养基中淋巴细胞转化率、分裂指数均高于对比例，并且实施例1制备得到的培养基效果最好，为最佳实施例。当前第1页1 2 3