一种新型比率型亚硫酸根荧光探针及其制备方法与生物应用与流程

本发明涉及一种新型检测亚硫酸根的荧光探针及其制备方法与生物应用，该探针是一个比率型的并且对亚硫酸根高度识别，属于有机小分子荧光探针领域。

背景技术：

SO₂不仅是一种主要的大气污染物，同时也与动物和人类的健康密切相关。SO₂在生物体内主要以亚硫酸根和亚硫酸氢根形式存在。空气中少量的SO₂能够促使植物叶片的气孔开放从而提高植物的光合作用率。有研究表明，在空气中SO₂的浓度过高时，会显著地影响着植物的生长甚至会降低作物产量。亚硫酸盐还是一种被广泛使用的食品防腐剂，而且在人体内也可通过含硫的氨基酸代谢生成。尽管有研究表明亚硫酸盐能刺激神经系统的兴奋性，但是，当其浓度较高时却能引起呼吸系统疾病。一定量的亚硫酸盐对于那些对它敏感的人群来说，会使他们过敏或是哮喘，从而导致呼吸困难，荨麻疹，肠胃病等。并且，联合国粮农组织/世界卫生组织食品添加剂专家委员会发布声明，人们日常对于亚硫酸根的摄入量需小于0.7mg/kg相对于人的体重。随着现代工业的发展，大量的生矿物质被煅烧加工，进而产生大量的SO₂，从而导致酸雨和很多环境问题。这些对人体，环境的不利影响已经引起越来越多的关注。随着现代生活水平的提高，人们对健康的关注度也日益提高。近年来，生物体内亚硫酸盐的含量作为机体正常运行的重要指标，己经受到越来越多的关注。因此，快速定量检测生物体内亚硫酸盐的浓度具有十分重要的意义。因此，开发有效的对于亚硫酸根在食物定量安全检测和安全监管，临床和环境应用的方法是非常重要的。传统的检测方法有很多，比如有滴定测量法、色谱法、电化学法、毛细管电泳法、流动注射分析法，但上述方法大多涉及了繁琐的操作手续，给实际操作带来一定的困难。

近年来，作为卓越的检测技术，荧光探针因为它的高选择性，高敏感性以及实时成像性，已经越来越引起高度关注，且被广泛应用于各种物质的检测。通常情况下，荧光探针检测物质是依靠于荧光强度的增加或消减，因此探针的浓度，仪器的效率和环境等因素都会影响信号的输出。但是对于比率型荧光探针来说，利用两个不同波长处荧光强度的变化，可以很好地消除这些因素。

目前来说，比率型检测亚硫酸根的荧光探针很少，并且已经报导过得探针大都是基于对醛基的亲核反应，这些探针往往需要较长的反应时间，大大限制了它们的应用。因此，开发新型的比率型荧光探针检测亚硫酸根是非常重要的。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提供一种新型比率型亚硫酸根荧光探针。该探针本身的荧光很强、加入到水或有机溶剂后所得溶液为蓝色，当与亚硫酸根作用后，溶液的颜色逐渐消退，并且显示出绿色荧光。

本发明还提供了上述荧光探针的制备方法，该合成方法简单，制备的产品产率高。

本发明还提供了上述荧光探针在水体系、有机溶剂体系或生物体中的应用。

本发明所采用的技术方案如下：

一种新型比率型亚硫酸根荧光探针，其探针分子式为C₃₀H₃₁N₂O₃⁺，具有式(I)所示的结构：

其化学名称为(E)-4-(2-羧基苯基)-7-(二乙基氨基)-2-(4-(二甲基氨基)苯乙烯基)呫吨鎓，简称CS-NMe。

上述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

(1)将间N-二乙胺基氨基苯酚与邻苯二甲酸酐溶解于甲苯中，于110℃反应20-30h，得白色固体；

(2)将步骤(1)所得白色固体加入到丙酮和98wt％浓硫酸的混合溶液中，于45-55℃反应2-12h，将反应液倒入冰水中，滴入高氯酸，析出固体，将固体用乙醇重结晶得到化合物1，其结构式如下：

3)将化合物1与4-二甲氨基苯甲醛在酸性环境中，于110℃反应5h后，分离提纯得到

式(I)所示化合物。

所述步骤(1)中间N-二乙胺基氨基苯酚与邻苯二甲酸酐的摩尔比为1:1-1.5。

所述步骤(1)中甲苯的用量为每毫摩尔间N-二乙胺基氨基苯酚10-70mL。

所述步骤(2)中丙酮和98wt％浓硫酸的混合溶液中，丙酮和98wt％浓硫酸的体积比为6：2-20。

所述步骤(3)中化合物1与4-二甲氨基苯甲醛的摩尔比为1：1-3。

所述步骤(3)中酸性环境所用的酸为醋酸、醋酸酐、甲磺酸，每毫摩尔化合物1所用酸的体积为10-20ml。

所述步骤(3)中分离提纯的具体方法为：将反应完成后的溶液，旋转蒸馏除去溶剂，将固体用二氯甲烷溶解，用二氯甲烷与甲醇的混合溶剂柱层析分离，得到式(I)所示化合物。

本发明探针合成路线如下：

上述新型检测亚硫酸根的荧光探针应用于水体系、有机溶剂体系或生物体系中。以两个波段荧光增强、减弱，颜色发生明显改变的方式检测亚硫酸根。该荧光探针在水体系、有机溶剂体系或生物体中能够高选择性识别亚硫酸根，该探针本身的荧光在750nm处很强、加入到水或有机溶剂后所得溶液为蓝色，当与过亚硫酸根作用后，溶液的荧光在750nm处逐渐减弱，而在510nm处荧光逐渐著增强、颜色变成浅绿色。

本发明的有益效果如下：

1、本发明的亚硫酸根荧光探针对亚硫酸根检测的选择性高，检测灵敏高，而且现象明显，便于识别。

2、本发明亚硫酸根荧光探针的制备方法简单。

附图说明

图1为本发明实施例5中pH＝7.4时，用激发波长为680nm，在750nm处的荧光强度，不同浓度亚硫酸根条件下亚硫酸根荧光探针的荧光光谱；其中最上面面的曲线为不加入亚硫酸根条件下的荧光曲线，曲线从上往下亚硫酸根的浓度依次增加，最下面的曲线为浓度是30当量(eq)时亚硫酸根的荧光曲线。

图2为本发明实施例5中pH＝7.4时，用激发波长为420nm，在510nm处的荧光强度，不同浓度亚硫酸根条件下亚硫酸根荧光探针的荧光光谱；其中最下面的曲线为不加入亚硫酸根条件下的荧光曲线，曲线从下往上亚硫酸根的浓度依次增加，最上面的曲线为浓度是30当量(eq)时亚硫酸根的荧光曲线。

图3为本发明实施例6中加入不同生物小分子之后的荧光强度变化的对比图。激发波长为680nm，在750nm处的荧光强度对比；1-14分别代表N₃^-，Vc，CH3COO^-，Br^-，NO₃^-，Cl^-，GSH，Hcy，S₂O₃^2-，SO₄^2-，Ala，NO₂^-，S^2-，SO₃^2-等。

图4为本发明实施例6中加入不同生物小分子之后的荧光强度变化的对比图。激发波长为420nm，在510nm处的荧光轻度对比；1-14分别代表N₃^-，Vc，CH3COO^-，Br^-，NO₃^-，Cl^-，GSH，Hcy，S₂O₃^2-，SO₄^2-，Ala，NO₂^-，S^2-，SO₃^2-等。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做进一步说明，但不限于此。实施例中所用原料，如无特殊说明均为常规市购产品。

实施例1

化合物1的制备

将间N-二乙胺基苯酚(0.50g,3.03mmol)与邻苯二甲酸酐(0.49g,3.33mmol)在180mL甲苯中110℃反应24小时得到白色固体，再将白色固体加入到20mL含有6ml丙的98wt％浓硫酸中，50℃反应3小时，固体用乙醇重结晶得到化合物1(0.22g,0.45mmol)。

合成路线如下：

实施例2

新型检测亚硫酸根的荧光探针的制备

反应路线如下：

制备过程，包括步骤如下：

将实施例1中制备的化合物1(0.377g,1.0mmol)与4-二甲氨基苯甲醛(0.178g,1.2mmol)在20ml醋酸中，于110℃反应5h，得到深色溶液，旋转蒸馏除去溶剂，固体用二氯甲烷溶解，用二氯甲烷与甲醇混合溶剂过柱层析分离，得到目标化合物CS-NMe；收率：50％。¹HNMR(400MHz,MeOD)δ8.05(d,J＝15.5Hz,2H),8.00–7.91(m,2H),7.63(d,J＝8.9Hz,5H),7.60–7.54(m,4H),7.39(d,J＝9.4Hz,2H),7.37–7.31(m,2H),7.08(d,J＝2.9Hz,3H),7.05(d,J＝2.4Hz,1H),7.01(d,J＝2.3Hz,2H),6.94(d,J＝15.5Hz,2H),6.74(d,J＝9.0Hz,4H),3.62(q,J＝7.2Hz,9H),3.07(s,12H),1.27(d,J＝7.1Hz,14H).¹³C NMR(101MHz,MeOD)δ166.57,162.66,158.37,154.69,153.53,146.02,134.19,131.86,129.81,129.61,129.24,128.75,122.72,115.47,115.24,113.31,111.87,111.37,95.87,45.21,38.86,11.45。

实施例3

如实施例2所述的亚硫酸根荧光探针的制备方法，不同的是：

其中的4-二甲氨基苯甲醛用量为3mmol，将醋酸替换为醋酸酐，酸的用量为20mL，反应温度为60℃，反应时间为12h。

实施例4

如实施例2所述的亚硫酸根荧光探针的制备方法，不同的是：

其中的4-二甲氨基苯甲醛用量为1mmol，将醋酸替换为甲磺酸，酸的用量为10mL，反应温度为50℃，反应时间为10h。

实施例5

亚硫酸根荧光探针与亚硫酸根的滴定实验

在PBS缓冲液中，加入初始浓度为1mM的荧光探针，使得溶液中荧光探针的浓度为10μM。然后，依次加入不同量的初始浓度为1.00mM的亚硫酸根，使得溶液中亚硫酸根的浓度分别为5μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、100μM、140μM、180μM、250μM、300μM，不加入亚硫酸根作为对照，静置0.5小时使亚硫酸根与荧光探针充分反应。

用荧光光谱仪测试不同亚硫酸根条件下的荧光光谱，荧光光谱用两个不同激发波长激发，其中一个激发波长为420nm，发射波长为510nm，检测波长为510nm，另中一个激发波长为680nm，发射波长为750nm，检测波长为750nm结果分别如图2、图3所示。由图2可知，随着亚硫酸根的浓度增加，在750nm波长下的荧光强度逐渐降低，由图3可知，随着亚硫酸根的浓度的增加，在510nm波长下的荧光强度逐渐增强。说明荧光探针能够对亚硫酸根进行响应。

实施例6

荧光探针检测亚硫酸根的选择性测试

如实施例5所述，在同样测试条件下，向溶液中加入过量的其它生物活性小分子，测试加入不同生物活性小分子之后的荧光光谱，用两个不同激发波长激发，一个波长为420nm，发射波长为510nm，检测波长为510nm，另一个激发波长为680nm，发射波长为750nm，检测波长为750nm，结果如图3，图4所示。由图4可知，常见的生物活性小分子如N₃^-，Vc，CH3COO^-，Br^-，NO3^-，Cl^-，GSH，Hcy，S₂O₃^2-，SO₄^2-，Ala，NO₂^-，S^2-，SO₃^2-等，510nm处荧光强度只有亚硫酸根明显增强，由图3可知，750nm处荧光强度只有亚硫酸根明显减弱，其他生物活性小分子不对检测结果产生干扰，可以证明该荧光探针对亚硫酸根具有较高的选择性。