本申请要求2015年12月23日提交的美国临时专利申请第62/387,273号的优先权，所述申请以全文引用的方式并入本文中。
关于联邦资助研究或发展的声明
本发明是在政府支持下在由美国国家卫生研究院(nationalinstitutesofhealth)授予的ca097186下进行。政府对本发明享有一定权利。
序列表的参考
创建于或大约创建于2016年12月20日的文件大小为612kb的名为“dn1lk5845.txt(sequencelisting.txt)”的计算机可读文本文件含有此申请的序列表并以全文引用的方式并入本文中。
本公开内容提供使用在肿瘤组织中评价的遗传标记的甲基化状态区分转移性-致死性前列腺癌(pca)与惰性pca的方法和试剂盒。遗传标记包括基因间1、基因间2、基因间3、pi15、fhad1、alkbh5、klhl8和/或atp11a内的cpg甲基化位点。
背景技术：
前列腺癌(pca)为生物学上和临床上异质性疾病，2015年美国预期有220,800名新的病例和27,540例癌症特异性死亡，并且在世界范围内每年有超过300,000例死亡。pca最常具有惰性过程，但20-30％患者的子组发展为癌转移并最终死于pca。迄今，预后的最重要单一预测因子为格里森分数，病理学家通过组织学检查活检组织分配格里森分数。然而，格里森分数经常不准确，尤其在少量肿瘤可用的时候。通过比较诊断性活检与后续前列腺切除术的格里森分数，分别发生14％到51％和9％升级和降级。此外，尽管具有格里森分数3+3＝6的肿瘤风险较低并且具有格里森分数4+4＝8或更高的肿瘤风险较高，但3+4或4+3的肿瘤为异质的并且包括大量肿瘤。因此，研究工作聚焦于发现预后生物标记，所述预后生物标记可以改善用于靶向那些患者最可能受益的疗法的患者分类。
最近的生物标记研究主要聚焦于变化的肿瘤组织基因表达谱，从而引起针对肿瘤侵袭性的mrna标签的测试的研发。肿瘤dna的表观遗传变化也可以提供有价值的预后信息。研究最广泛的表观遗传修饰为dna甲基化，其发生在整个基因组的cpg位点并调节基因表达。迄今，dna甲基化和pca进展的研究限制于与生物化学(即前列腺特异性抗原，psa)复发有关的候选基因的小组。尽管具有生物化学进展的患者有较高风险发生pca相关死亡，但此仍为生物学上异质群组并且大多数将不会死于pca。在根除性前列腺切除术之后具有生物化学复发的患者的研究发现在10年的中值随访之后仅17％到21.5％死于pca。
技术实现要素：
研究原发前列腺癌症的表观基因组广泛的dna甲基化图谱。研究包括具有针对转移性进展和癌症特异性死亡的长期随访的基于群体的根除性前列腺切除术组。本研究的目标为检测区分转移性-致死性pca与惰性pca或非复发性疾病的差异甲基化cpg生物标记。
区分具有转移性-致死性可能性的肿瘤与在诊断之后五年或更多年内不会复发的更加惰性的肿瘤的八种差异甲基化cpg经鉴别并随后在独立患者组中验证。这些表观遗传生物标记改善针对患有临床局部疾病的新诊断的前列腺癌患者进行的预后判定和临床决定。这些cpg标记包括基因间1；基因间2；fhad1；alkbh5；klhl8；atp11a；基因间3；以及pi15。这些cpg标记的甲基化状态的检测组合改善格里森得分的预后辨别。
附图说明
图1.两个前列腺癌(pca)患者群体的特征。
图2.用于弗雷德·哈钦森癌症研究中心(fredhutchinsoncancerresearchcenter；fh)组中的转移性-致死性pca分类的排名靠前的42种dna甲基化生物标记。
图3.在自举样品中选择42种dna甲基化生物标记的次数(n＝100，每个准则)。
图4.用于分类在东弗吉尼亚医学院(easternvirginiamedicalschool；ev)组中的转移性-致死性pca的八种经验证dna甲基化生物标记。
图5.用于预测八种经验证dna甲基化生物标记和格里森分数的转移性-致死性pca的roc曲线。
图6.用于区分将每种cpg与ev组中的格里森分数组合的模型中的转移性-致死性pca的八种经验证dna甲基化生物标记的预测性能。
图7.用于焦磷酸测序的引物。所有引物均在5'-3'取向中列出。
图8.焦磷酸测序结果与hm450结果的相关性。
图9a、9b.(9a)使用通过焦磷酸测序验证的5种cpg标记构建的选择模型。(9b)相比于单独格里森分数，使用5种cpg标记与格里森分数的拟合模型结果。
具体实施方式
前列腺癌(pca)为生物学上和临床上异质性疾病，2015年美国预期有220,800名新的病例和27,540例癌症特异性死亡，并且在世界范围内每年有超过300,000例死亡。pca可能为惰性的(即，在诊断和治疗的5年内不复发，并且即使保持不治疗也可能不会引起问题)或可能复发。这些类型的pca区别于转移性-致死性pca。
目前，预后的最重要单一预测因子为格里森分数，病理学家通过组织学检查活检组织分配格里森分数。然而，格里森分数经常不准确，尤其在少量肿瘤可用的时候。通过比较诊断性活检与后续前列腺切除术的格里森分数，分别发生14％到51％和9％升级和降级。此外，尽管具有格里森分数3+3＝6的肿瘤风险较低并且具有格里森分数4+4＝8或更高的肿瘤风险较高，但3+4或4+3的肿瘤为非均相的并且包括大部分肿瘤。因此，研究工作聚焦于发现预后生物标记，所述预后生物标记可以改善用于靶向那些患者最可能受益的疗法的转移性-致死性pca与惰性pca的分层。
最近的生物标记研究已主要聚焦于变化的基因表达，从而引起针对肿瘤侵袭性的mrna标签的测试的研发。肿瘤dna的表观遗传变化也可以提供有价值的预后信息。表观遗传指代并非由突变引起的基因表达的变化(即基因的序列变化，如核苷酸的损失或获得)。因此，表观遗传为由除突变以外的若干机制引起的基因表达的可逆调节。
研究最广泛的表观遗传修饰为dna甲基化。其它表观遗传变化包括以下各者的变化：dna的三维结构、组蛋白蛋白修饰、微rna抑制性活性、压印、x不活化和长距离染色体相互作用。
dna甲基化发生在整个基因组的cpg位点并调节基因表达。胞嘧啶为构建dna的四种构筑嵌段(即胞嘧啶(c)、硫胺(t)、腺嘌呤(a)和鸟苷(g))的群组中的一种(即核苷酸)。胞嘧啶的化学结构呈六面六边形或嘧啶环形式。胞嘧啶可以沿着单一dna链在线性序列中与鸟苷成对以形成5'-cg-3'或cpg对。“cpg”是指胞嘧啶-磷酸盐-鸟苷化学键，其中磷酸盐将两个核苷酸结合在一起。在哺乳动物中，在70-80％这些cpg对中，胞嘧啶经甲基化。(查特基(chatterjee)等人,《生物化学与生物物理学报(biochemicaetbiophisicaacta)》2012；1819:763-70)。
术语“cpg岛”指代具有高浓度cg二核苷酸对或cpg位点的基因组中的区域。由cpg岛占据的dna的长度通常为300-3000个碱基对。cpg岛可以由各种准则界定，所述准则包括占据dna的至少200个碱基对(bp)的复发性cg二核苷酸对的长度，至少50％的链段的cg含量，和/或所观测到的/所预期的cpg比大于60％。整个基因组估计存在28-30百万个cpg位点。
cpg岛通常发现于基因启动子中。在哺乳动物中，平均40％基因启动子含有cpg岛(法特米(fatemi)等人,《核酸研究(nucleicacidsres.)》2005；33:e176)。基因启动子在人类基因组中尤其富含cg，人类基因组中70％启动子具有高cg含量。尽管cpg岛与基因启动子高度相关，但cpg岛也可存在于基因组的其它区域中(如基因主体或基因间区域中)。
在分散遍及dna的大多数cpg位点中，胞嘧啶核苷酸经甲基化。相比之下，胞嘧啶在位于基因启动子区的cpg岛的cpg位点中更经常地未经甲基化，支持cpg岛中的胞嘧啶的甲基化状态在基因转录活性中的作用。
胞嘧啶的甲基化指代胞嘧啶的嘧啶环的5号位置的甲基或单一碳原子的酶添加，其导致胞嘧啶转化为5-甲基-胞嘧啶。胞嘧啶的甲基化可以通过称为dna甲基转移酶(dnmt)的酶家族实现。当形成时，5-甲基-胞嘧啶倾向于突变或原始胞嘧啶的化学转化以形成胸腺嘧啶。5-甲基-胞嘧啶占正常人类基因组中总核苷酸碱基的1％。
如先前所指示，可以称整个dna的胞嘧啶的甲基化状态间接表明整个基因组的多个基因的相对表现状态。已知基因内，尤其基因的启动子区中的胞嘧啶核苷酸的甲基化为控制总体基因活性，即mrna和蛋白质合成的机制。传统地，胞嘧啶的甲基化与抑制基因转录相关。然而，在某些基因中，已知胞嘧啶的甲基化具有逆效果并且实际上促进基因转录。
迄今，dna甲基化和pca进展的研究已限制于与生物化学复发有关的候选基因的小组。生物化学复发可以通过测量患者的血液样品中的pca标记(即，前列腺特异性抗原，psa)的含量，其中超过某一临限值的psa含量可以表明癌症复发。pitx2和gstp1的启动子区中的cpg的超甲基化与psa复发相关。尽管具有生物化学进展的患者有较高风险发生pca死亡，但此仍为生物学上异质群组并且大多数将不会死于pca。更尤其，在根除性前列腺切除术之后具有生物化学复发的患者的研究发现在10年的中值随访之后仅17％到21.5％死于pca。
对于本公开案而言，研究原发pca中的表观基因组广泛的dna甲基化图谱。研究包括具有针对转移性进展和癌症特异性死亡的长期随访的基于群体的根除性前列腺切除术组。所公开的研究的目标为检测区分患有转移性-致死性pca的患者与患有惰性pca或非复发性疾病的患者的差异甲基化cpg生物标记。随后在验证组中测试所鉴别的最稳固甲基化生物标记。
当前研究的优点包括其较大的样品尺寸、用于生物标记发现的表观基因组广泛的方法，和发现组的基于群体的性质，以及诊断患有临床局部pca并针对临床局部pca治疗的患者的长期随访。独立患者组中的dna甲基化生物标记的验证也至关重要，并且确认这些cpg对于用于预测不良结果的格里森分数而言具有附加价值。
本文中描述的结果表明在手术切除处获得的原发肿瘤组织中检测dna甲基化生物标记可以区分转移性-致死性pca患者与在至少5年后根除性前列腺切除术无复发的那些男性。在42种排名靠前的差异甲基化cpg位点中，随后在独立患者组中验证八种，所述差异甲基化cpg位点将发现组中的患有侵袭性肿瘤的患者分层并超过单独格里森分数提供的预后辨别而改进预后辨别。
在本研究中针对转移性-致死性肿瘤表型所验证的八种差异甲基化cpg位点位于五种基因(alkbh5、atp11a、fhad1、klhl8和pi15)和三个基因间区(在本文中称为“基因间1”；“基因间2”和“基因间3”)种。五种基因涉及调节功能、对低氧之响应、蛋白结合、发育过程和离子传输。汗诺瓦(dhanoa)等人,《人类基因组学(humgenomics)》7:13,2013；迪罗谢(durocher)等人,《欧洲生化学会联合会快报(febslett)》513:58-66,2002；法拉克(falak)等人,《基因组学杂志(physiolgenomics)》46:418-28,2014；密约什(miyoshi)等人,《肿瘤报告(oncolrep)》23:505-10,2010；塔尔哈默(thalhammer)等人,《公共科学图书(plosone)》6:e16210,2011。氧化dna脱甲基酶alkbh5在低氧下上调并且也在精子发生中起作用，其与alkbh3(pca抗原1)属于同一基因家族，在前列腺肿瘤中高度表达并且为pca的可能性治疗靶点。库克(koike)等人,《癌症药靶研究最新进展(currcancerdrugtargets)》12:847-56,2012。在atp11a的先前研究表达中，atp11a属于三磷酸腺苷结合盒转运体的延伸家族，与结直肠癌死亡相关。密约什等人,《肿瘤报告》23:505-10,2010。另一先前研究发现pi15(肽酶抑制剂15)在一些晚期前列腺肿瘤中扩增和过度表达。瓦尼奥(vainio)等人,《前列腺(prostate)》72:789-802,2012。pi15和atp11a的异常dna甲基化与相同病患肿瘤中的这些基因的mrna表达相关。对于pi15而言，相关性在预期方向(即，启动子超甲基化和降低表达)。
方法和试剂盒利用差异甲基化来区分转移性-致死性pca与惰性pca。转移性-致死性pca复发，转移并随后在初始诊断之后导致由pca造成的死亡。惰性pca在诊断和治疗的5年内不会复发或再发。
在特定实施例中，转移性-致死性pca与惰性pca之间的差异甲基化在以下中的一或多种中检测到：基因间1(例如cpg位点：cg01135464)；基因间2(例如cpg位点：cg02223001)；fhad1(例如cpg位点：cg02394978)；alkbh5(例如cpg位点：cg07166550)；klhl8(例如cpg位点：cg16713292)；atp11a(例如cpg位点：cg21513610)；基因间3(例如cpg位点：cg22501793)；以及pi15(例如cpg位点：cg24349665)。在特定实施例中，转移性-致死性pca与惰性pca之间的差异甲基化在所公开的基因和/或基因间区域内的所有cpg位点中检测到。
特定实施例检测基因间1；基因间2；fhad1；alkbh5；klhl8；atp11a；基因间3；以及pi15的差异甲基化。
特定实施例检测基因间1cpg位点与选自以下各者的1、2、3、4、5、6或7种标记组合的差异甲基化：基因间2cpg位点；fhad1cpg位点；alkbh5cpg位点；klhl8cpg位点；atp11acpg位点；基因间3cpg位点；以及pi15cpg位点。
特定实施例检测基因间2cpg位点与选自以下各者的1、2、3、4、5、6或7种标记组合的差异甲基化：基因间1cpg位点；fhad1cpg位点；alkbh5cpg位点；klhl8cpg位点；atp11acpg位点；基因间3cpg位点；以及pi15cpg位点。
特定实施例检测fhad1cpg位点与选自以下各者的1、2、3、4、5、6或7种标记组合的差异甲基化：基因间1cpg位点；基因间2cpg位点；alkbh5cpg位点；klhl8cpg位点；atp11acpg位点；基因间3cpg位点；以及pi15cpg位点。
特定实施例检测alkbh5cpg位点与选自以下各者的1、2、3、4、5、6或7种标记组合的差异甲基化：基因间1cpg位点；基因间2cpg位点；fhad1cpg位点；klhl8cpg位点；atp11acpg位点；基因间3cpg位点；以及pi15cpg位点。
特定实施例检测klhl8cpg位点与选自以下各者的1、2、3、4、5、6或7种标记组合的差异甲基化：基因间1cpg位点；基因间2cpg位点；fhad1cpg位点；alkbh5cpg位点；atp11acpg位点；基因间3cpg位点；以及pi15cpg位点。
特定实施例检测atp11acpg位点与选自以下各者的1、2、3、4、5、6或7种标记组合的差异甲基化：基因间1cpg位点；基因间2cpg位点；fhad1cpg位点；alkbh5cpg位点；klhl8cpg位点；基因间3cpg位点；以及pi15cpg位点。
特定实施例检测基因间3cpg位点与选自以下各者的1、2、3、4、5、6或7种标记组合的差异甲基化：基因间1cpg位点；基因间2cpg位点；fhad1cpg位点；alkbh5cpg位点；klhl8cpg位点；atp11acpg位点；以及pi15cpg位点。
特定实施例检测pi15cpg位点与选自以下各者的1、2、3、4、5、6或7种标记组合的差异甲基化：基因间1cpg位点；基因间2cpg位点；fhad1cpg位点；alkbh5cpg位点；klhl8cpg位点；atp11acpg位点；以及基因间3cpg位点。
特定实施例也可以不包括特定标记。举例来说，在特定实施例中，不包括基因间1cpg位点。在特定实施例中，不包括基因间2cpg位点。在特定实施例中，不包括fhad1cpg位点。在特定实施例中，不包括alkbh5cpg位点。在特定实施例中，不包括klhl8cpg位点。在特定实施例中，不包括atp11acpg位点。在特定实施例中，不包括基因间3cpg位点。在特定实施例中，不包括pi15cpg位点。在特定实施例中，不包括超过1种标记，不包括2种或更多种标记，不包括3种或更多种标记，不包括4种或更多种标记，不包括5种或更多种标记，不包括6种或更多种标记或不包括7种标记。
在特定实施例中，当分析超过一种标记时，所检测的标记的值可以计算为得分。每个值可以在产生得分的演算法内均匀加权，或特定标记的值在获得得分中可以赋予较重权重。举例来说，具有较高auc或pauc和/或甲基化差异得分的标记可以比具有较低auc或pauc和/或甲基化差异得分的标记赋予更重权重。举例来说，在特定实施例中，基因间1、klhl8和/或atp11a可为比小组中的其它标记赋予更重的权重。
标记还可以分组为各类别，并且每个类别获得加权得分。举例来说，用于区分转移性-致死性pca与惰性pca的标记值可以分组成各类别并且加权如下(从最高权重到最低权重)：类别1：基因间1、klhl8和atp11a；类别2：pi15和fhad1；以及类别3：基因间2、alkbh5和基因间3。
任何标记或标记类别可以包括于特定值计算中。举例来说，在特定实施例中，包括类别1。在特定实施例中，包括类别2。在特定实施例中，包括类别3。在特定实施例中，可以包括类别群组，例如类别1和2；1和3；和/或2和3。也可以不包括特定类别。举例来说，在特定实施例中，不包括类别1。在特定实施例中，不包括类别2。在特定实施例中，不包括类别3。
标记(例如甲基化状态)的上调(超)或下调(低)甲基化可以通过检测甲基化状态并比较值与相关参考水平评估。举例来说，一或多种标记的甲基化状态可以指示为值。值可以是由分析样品产生的一或多个数值，并且可以例如通过分析来测量样品中的(一或多个)标记的甲基化状态衍生，或来源于获自提供者，如实验室的数据集，或来源于存储在服务器上的数据集。
在最广泛意义上，值可以是定性或定量的。因此，在检测为定性的情况下，方法和试剂盒提供阅读或评价，例如标记在所分析的样品中是否经甲基化的评估。在其它实施例中，方法和试剂盒提供甲基化的定量检测，即所分析样品中的标记的甲基化的实际量或相对丰度的评价或评估。在这类实施例中，如果方法是检测样品中的两种或更多种不同标记的甲基化的方法，那么定量检测可以是绝对或相对的。因此，当用于定量样品中的标记的甲基化的情形时，术语“量化”可以指代绝对或相对定量。绝对定量可以通过包括具有已知甲基化参数作为一或多个对照标记的样品并参考例如标准化具有已知对照标记的实验性标记的经检测甲基化水平来实现(例如经由产生标准曲线)。或者，相对定量可以通过比较例如相对于彼此两种或更多种不同标记之间的经检测甲基化水平或量以提供两种或更多种标记中的一种的相对定量来实现。针对标记的值的实际测量可以使用所属领域中已知的任何方法测定。
如先前所述，所检测到的标记含量(例如值)可以与一或多个参考水平相比水平。参考水平可以获自一或多个相关数据集。如本文所用的“数据集”为由在所希望的条件下评价样品(或样品群)而产生的一组数值。数据集的值可以例如通过从(一或多个)样品实验上获得测量结果并从这些测量结果构建数据集而获得。如所属领域普通技术人员所理解，参考水平可以基于例如所属领域中已知并且有用的任何数学或统计学公式以从独立数据点(例如平均值、中值、平均值的中值等)的集合到达有意义的总参考水平。或者，参考水平或用于创建参考水平的数据集可以获自如实验室的服务提供者，或获自已储存数据集的数据库或服务器。
来自数据集的参考水平可以来源于由群体获得的先前测量。“群体”是具有相似指定特征的受试者或样品的任何群组。群组可以根据例如临床参数、临床评估、治疗方案、疾病状态、pca的严重程度等。在特定实施例中，群体是患有转移性-致死性pca的受试者的群组。在特定实施例中，群体是患有惰性pca的受试者的群组。
在特定实施例中，基于样品值是否显著不同于参考水平得出结论。如果差值在基于单独机率将预期出现的水平内，那么测量值并非在统计学上显著不同。相比之下，统计学上显著的差异为大于预期仅偶然出现的水平的测量值。可通过所属领域中熟知的任何各种系统和方法确定统计显著性或其缺乏。统计显著性的常用测量值的实例是p值。p值表示获得等于特定数据点的给出结果的机率，其中数据点是仅随机机率的结果。常常认为p值低于0.05的结果为显著的(非随机机率)。
在特定实施例中，基于标记和/或其它数据集组分获得的值可以进行具有经选择参数的分析处理。分析处理的参数可以是本文中所公开的那些参数或使用本文中描述的指南所导出那些参数。用于产生结果的分析处理可以是能够基于甲基化状态检测检测惰性或转移性-致死性pca的任何类型的处理，例如线性演算法、二次演算法、决策树演算法或表决演算法。分析处理可以设定用于判定样品属于给出类别的机率的临限值。机率优选地是至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或更高。检测依赖于对生物样品，如原发pca肿瘤样品进行分析。
接受者操作特性(receiveroperatingcharacteristics；roc)曲线是绘制以下各者的曲线：敏感度(真阳性率)，其在此环境中定义为具有正检验或在y轴上的特定胞嘧啶基因座处具有异常(差异)胞嘧啶甲基化水平的转移性-致死性pca案例的百分比；和假阳性率(1-特异性)，即在x轴上的相同基因座处具有异常(差异)胞嘧啶甲基化的惰性(非复发性)pca案例的数目。特异性定义为在所关注的基因座处具有正常甲基化水平或逆向测试的正常(即非复发性)案例的百分比。假阳性率指代错误地发现具有正检验(即异常或差异甲基化水平)的正常(例如非复发性)受试者的百分比。
roc曲线下的面积(auc)指示在从异常案例中鉴别正常的测试的准确度(汉利和麦克尼尔(hanley&mcneil),《放射学(radiology)》1982；143:29-36)。auc是从曲线到始于x与y轴的相交点的对角线并具有45°倾斜角的roc曲线下的面积(不具有两个群组，例如转移性-致死性相对于非复发性pca案例之间的辨别的测试具有从左下方到右上角的45°对角线)。接受者操作特征(roc)曲线下的面积越大，测试预测所关注的病状的准确度越高。面积roc＝1.0指示完美的测试，其在患有病症(例如转移性-致死性pca)的所有案例中均呈阳性并且在未患病症(例如非复发性pca)的所有正常受试者中呈阴性。因此，曲线越接近左上角，测试的总准确度越高。
标记的甲基化可以使用各种甲基化检测分析评估。“甲基化检测分析”指代可以为可商购的用于区分dna中的甲基化与未甲基化胞嘧啶基因座的分析。用于测量胞嘧啶甲基化的技术包括基于亚硫酸氢盐的甲基化分析。将亚硫酸氢盐添加至dna导致未甲基化胞嘧啶的甲基化并且其最终转化为核苷酸尿嘧啶。尿嘧啶具有与dna序列中的硫胺类似的结合特性。先前甲基化的胞嘧啶在暴露于亚硫酸氢盐时不进行类似化学转化。亚硫酸氢盐分析因此可以用于区分先前甲基化与未甲基化胞嘧啶。
定量甲基化检测分析包括组合的亚硫酸氢盐和限制分析cobra，其使用甲基化敏感性限制性核酸内切酶、凝胶电泳和基于标记杂交探针的检测。(吉翁克(ziong)和莱尔德(laird),《核酸研究(nucleicacidres.)》199725；2532-4)。另一示例性检测分析是用于扩增所关注的dna链段的甲基化特异性聚合酶链反应pcr(mspcr)。这一分析在胞嘧啶的亚硫酸氢钠转化之后进行并且使用甲基化敏感性探针。其它检测分析包括：定量甲基化(quantitativemethylation；qm)分析，其组合pcr扩增与设计成结合于推定的甲基化位点的荧光探针；methylighttm(凯杰(qiagen),加利福尼亚州雷德伍德城)；使用基于荧光的pcr的定量甲基化检测分析(伊兹(eads)等人,《癌症研究(cancerres.)》1999；59:2302-2306)；以及ms-snupe，用于判定cpg位点中的甲基化水平的差别的定量技术。如同其它技术，ms-snupe也需要首先进行亚硫酸氢盐处理，从而在甲基胞嘧啶不受影响的同时使未甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶。对亚硫酸氢盐转化的dna具有特异性的pcr引物用于扩增所关注的标靶序列。扩增的pcr产物经分离并用于定量所关注的cpg位点的甲基化状态。(冈萨尔戈(gonzalgo)及琼斯(jones)《核酸研究(nucleiacidsres)》1997；25:252-31)。
在特定实施例中，使用
随后使用激光刺激结合于用于序列延伸的单碱基的荧光团。通过相比于未甲基化珠粒的来自甲基化珠粒的荧光强度检测每个胞嘧啶基因座处的甲基化水平。胞嘧啶甲基化水平表示为“β”，所述“β”是甲基化珠粒探针信号与胞嘧啶基因座处的总信号强度的比值。
在特定实施例中，分布遍及基因组的特异性胞嘧啶基因座的可靠鉴别已详述于例如文件“cpg基因座鉴别.用于清晰的cpg基因座鉴别并用于针对甲基化的
在特定实施例中，使用焦磷酸测序检测标记甲基化。焦磷酸测序是dna测序方法，其依赖于在合成dna时焦磷酸盐的释放检测(并且因此为“边合成边测序”技术)。为通过焦磷酸测序评估甲基化，可以使dna样品与亚硫酸氢钠一起培育，所述亚硫酸氢钠将未甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶。尿嘧啶的存在在pcr扩增期间将导致胸腺嘧啶合并。因此，在已知编码胞嘧啶的核苷酸位置处包括胸腺嘧啶的测序结果可以解释为未甲基化位点。相比之下，存在于测序结果中的胞嘧啶表明原始dna样品中的位点经甲基化，因为在处理后甲基化保护胞嘧啶免于转化为尿嘧啶。亚硫酸氢盐处理也可以对具有已知甲基化图案的对照样品进行，从而减少或消除假阳性结果。可商购的焦磷酸测序机器包括pyromarkq96(德国希尔登的凯杰)。对于使用焦磷酸测序测量甲基化的方法的更多细节，参见德莱尼(delaney)等人《分子生物学方法(methodsmolbiol.)》20151343:249-264。焦磷酸测序尤其适用于检测基因内的cpg位点的甲基化。
另外，正向或反向dna链指示为处于所评价的胞嘧啶的位置。假设特异性染色体区内的胞嘧啶碱基的甲基化状态经同步(埃卡尔特(eckhart)等人,《自然遗传学(nat.gent.)》2006,38:1379-85)。
也可以评估具有变化的胞嘧啶甲基化的经基因转录的mrna水平的测量。可以使用用于判定mrna的表达水平的任何技术，其包括北方墨点分析、荧光原位杂交法(fish)、rna酶保护分析(rnaseprotectionassays；rpa)、微阵列、基于pcr或可以使用用于测量rna水平的其它技术。
也可以间接使用例如cdna阵列、cdna片段指纹识别、cdna测序、克隆杂交、差异显示、差异筛选、fret检测、液体微阵列、pcr、rt-pcr、使用taqman分析的定量rt-pcr分析、分子信标、微电子阵列、寡核苷酸阵列、聚核苷酸阵列、基因表达的连续分析(sage)和/或减去杂交检测基因的上调(超)或下调(低)甲基化。
可以使用的其它杂交技术描述于例如美国专利第5,143,854号；第5,288,644号；第5,324,633号；第5,432,049号；第5,470,710号；第5,492,806号；第5,503,980号；第5,510,270号；第5,525,464号；第5,547,839号；第5,580,732号；第5,661,028号；以及第5,800,992号以及第wo95/21265号；第wo96/31622号；第wo97/10365号；第wo97/27317号；第ep373203号；以及第ep785280号中。
此外，可以测量差异甲基化的基因的蛋白质产物以间接评估胞嘧啶甲基化水平。由mrna翻译的蛋白质反映与胞嘧啶甲基化变化相关的变化的基因表达的相同现象。因此，蛋白质表达也可以用于将样品生物学上分类为转移性-致死性或惰性pca。
“蛋白质检测”包括全长蛋白、成熟蛋白、前体蛋白、多肽、同功异型物、突变、翻译后修饰蛋白和其变体的检测并且可以以任何合适方式检测。
在特定实施例中，蛋白质标记通过以下检测：使样品与试剂(例如抗体)接触，产生试剂与(一或多种)标记的复合物并检测复合物。用于检测和测量蛋白质水平的特定实施例可以使用包括以下的方法：凝集、化学发光、电化学发光(electro-chemiluminescence；ecl)、酶联免疫分析(enzyme-linkedimmunoassays；elisa)、免疫检定、免疫墨点法、免疫扩散、免疫电泳、免疫荧光法、免疫组织化学、免疫沉淀、质谱法和西方墨点法。此外，参见例如e.马吉奥(e.maggio),《酶免疫检定(enzyme-immunoassay)》(1980),crcpress有限公司,佛罗里达州波卡拉顿；以及美国专利第4,727,022号；第4,659,678号；第4,376,110号；第4,275,149号；第4,233,402号；以及第4,230,797号。
核酸和蛋白质可以连接于芯片，如微阵列芯片。参见例如美国专利第5,143,854号；第6,087,112号；第5,215,882号；第5,707,807号；第5,807,522号；第5,958,342号；第5,994,076号；第6,004,755号；第6,048,695号；第6,060,240号；第6,090,556号；以及第6,040,138号。结合于微阵列上的核酸或蛋白质可以通过以下检测：使用各种激光或基于电荷耦合器(chargecoupleddevice；ccd)的扫描器扫描微阵列，并用软件包，例如imagene(biodiscovery，加利福尼亚州霍桑)、特征提取软件(featureextractionsoftware)(安捷伦(agilent))、scanalyze(eisen,m.1999.《scanalyze用户手册(scanalyzeusermanual)》；加利福尼亚州斯坦福斯坦福大学,calif.版本2.32.)或genepix(axoninstruments)提取特征。
本文中所公开的实施例可以与高通量筛选(highthroughputscreening；hts)一起使用。通常，hts指代每天进行至少100次分析、至少500次分析、至少1000次分析、至少5000次分析、至少10,000次分析或更多次的形式。当计数分析时，可以考虑样品数目或所分析的蛋白质或核酸标记的数目。
一般来说，hts方法涉及样品或核酸或蛋白质标记或两者的逻辑或物理阵列。合适的阵列形式包括液体和固相阵列两种。举例来说，采用液相阵列例如用于核酸杂交、抗体或其它受体结合于配体等的分析可以在多孔或微量滴定板中进行。具有96,384或1536个孔的微量滴定板可以广泛使用，并且甚至可以使用更高数目的孔，例如3456个和9600个孔。一般来说，微量滴定板的选择通过用于样本制备和分析的方法和设备，例如机器人处理和载荷系统来确定。
hts分析和筛选系统可购自例如zymark公司(马萨诸塞州霍普金顿)；airtechnicalindustries(俄亥俄州曼托)；beckmaninstruments有限公司(加利福尼亚州富勒顿)；precisionsystems有限公司(马萨诸塞州内蒂克)等。这些系统通常使全部程序自动化，所述程序包括所有样品和试剂移液、液体分配、定时培育和适合于分析的(一或多个)检测器中的微板的最终读数。这些可配置系统提供hts以及高可挠性度和定制度。这类系统的制造商提供用于hts的各种方法的详细方案。
所公开的试剂盒包括分析样品的本文中所公开的一或多种标记的甲基化状态所需的材料和试剂。材料和试剂可以包括根据本文中描述和/或所属领域的普通技术人员已知的任何方法分析本文中所公开的的标记所需的那些材料和试剂。
各种实施例包括对特定表观遗传基因座进行甲基化检测分析所需的材料和试剂。特定实施例包括分析样品中的标记蛋白的上调或下调甲基化所需的材料和试剂。在特定实施例中，试剂盒包括标记蛋白的抗体和/或还可以包括适体(结合特异性分子的寡核苷酸或肽)、抗原决定基(由抗体、bcr或tcr识别的抗原区)或模拟抗原决定基(设计成模仿抗原决定基的结合特性的分子)。其它实施例另外或或者包括基于与标记核酸的同源性和/或互补性特别分析一或多个标记核酸的寡核苷酸。寡核苷酸序列可以对应于标记核酸的片段。举例来说，寡核苷酸的长度可以为超过200个、175个、150个、100个、50个、25个、10个或少于10个核苷酸。共同地，与标记形成复合物的任何分子(例如抗体、适体、抗原决定基、模拟抗原决定基、寡核苷酸)在本文中都可以称为标记结合剂。
试剂盒的实施例在独立容器中可以含有结合于基质或分别封装有用于结合于基质的试剂的标记粘合剂。在特定实施例中，基质是例如多孔带。在特定实施例中，多孔带的测量或检测区可以包括多个含有标记粘合剂的位点。在特定实施例中，多孔带也可以含有用于阴性和/或阳性对照的位点。或者，对照位点可以位于从多孔带分离的带。任选地，不同检测位点可以含有不同量的标记粘合剂，例如在第一检测位点中较高量并且在后续位点中较小量。在添加测试样品后，显示可检测信号的位点的数目提供存在于样品中的标记量的定量指示。检测位点可以任何可适当检测的形状配置，并且可以例如呈跨越多孔带宽度(或其部分)的棒或点形状。
在特定实施例中，基质可以是固体衬底，如“芯片”。参见例如美国专利第5,744,305号。在特定实施例中，基质可以是溶液阵列；例如xmap(luminex，德克萨斯奥斯汀)、cyvera(illumina，加利福尼亚州圣地亚哥)、raybioantibodyarrays(raybiotech有限公司，佐治亚州诺克罗斯)、cellcard(vitrabioscience，加利福尼亚州山景城)和quantumdots'mosaic(invitrogen，加利福尼亚州卡尔斯巴德)。
特定实施例可以包括对照配制物(阳性和/或阴性)和/或一或多种可检测标记。在特定实施例中，可用于蛋白质检测的可检测标记包括放射性同位素或放射性标记(例如32p和13c)、酶(例如荧光素酶、hrp和ap)、染料(例如若丹明(rhodamine)和花青)、荧光标签或染料(例如gfp、yfp、fitc)、磁珠或生物素。在特定实施例中，可检测标记是荧光素、gfp、若丹明、花青染料、alexa染料、荧光素酶和放射性标记等等。任选地包括用于产生得分的说明的用于进行分析的说明可以包括于试剂盒中；例如书面文字、磁带、vcr或cd-rom。
在特定实施例中，试剂盒包括进行甲基化检测分析所需的材料和试剂。在特定实施例中，试剂盒包括进行杂交分析(例如pcr)所需的材料和试剂。在特定实施例中，试剂盒包括进行免疫检定(例如elisa)所需的材料和试剂。在特定实施例中，材料和试剂明确地不包括设备(例如板阅读器)。在特定实施例中，试剂盒可以不包括通常发现于实验室环境(移液管；试管；蒸馏h2o)中的材料和试剂。
所分析的样品可以是任何合适的生物样品。在特定实施例中，样品获自诊断患有pca的受试者，并且样品包括pca。来自任何含有dna的生物样品的细胞和dna都可用作样品。用于测试的样品可以获自活性或死亡组织以及含有细胞或组织的考古学或法医试样。示例性样品包括原发pca肿瘤样品。
本文中所公开的特定实施例包括：从患有pca的受试者获得样品；对样品进行甲基化检测分析；基于分析测定一或多个值；基于标记的差异甲基化状态区分转移性-致死性pca与惰性pca，如本文中其它地方所描述。
特定实施例也包括通过以下预测或诊断受试者中的转移性-致死性或惰性pca：从疑似患有pca的受试者获得样品；分析样品的本文中所公开的一种或更多种标记的甲基化状态；基于分析测定一或多个标记值；比较一或多个标记值与参考水平；以及根据如通过一或多种标记的上调或下调所测定的标记的甲基化状态预测或诊断受试者中的转移性-致死性或惰性pca，如本文中其它地方所描述。
根据本文中所公开的方法和试剂盒的预测或诊断可以指导治疗方案。举例来说，转移性-致死性pca的生物分类、预测或诊断可以指导更具积极性或实验性的治疗过程。惰性pca的分类、预测或诊断可以指导积极性较小或无需其它治疗过程。所属领域的一般技术人员基于当时受试者的预后和相关标准物和治疗在特定时间将治疗分类为积极性、实验性、中度、最小程度或“无”治疗。举例来说，进行临床试验的治疗是实验性治疗。一旦治疗通过司法管辖权内相关管理机构的批准，那么治疗在司法管辖权中不再为实验性的。
在特定实施例中，pca遗传标记包括一或多种位于基因fhad1(分叉头相关(forkhead-associated；fha)磷酸肽结合结构域1)的cpg甲基化位点。fhad1是编码位于人类基因组的染色体1的基因的蛋白质并且在ncbi中列于基因id：114827下(参见例如seqidno:1)。在特定实施例中，fhad1基因中的cpg位点cg02394978处的差异甲基化测量为pca的遗传标记(即，相比于惰性pca，此cpg处的甲基化水平在转移性-致死性中较低)。
在特定实施例中，pca遗传标记在基因alkbh5(alkb同系物5)中包括一或多个cpg甲基化位点。alkbh5是编码位于染色体17的核酸脱甲基酶的基因并且列于ncbi基因id：54890下(参见例如seqidno:2)。在特定实施例中，alkbh5基因中的cpg位点cg07166550处的甲基化测量为pca的遗传标记(即，相比于惰性pca，此cpg处的甲基化水平在转移性-致死性中较低)。
在特定实施例中，pca遗传标记在基因klhl8(kelch相似家族成员8)中包括一或多个cpg甲基化位点，所述基因klhl8编码涉及泛素化并位于染色体4的接附蛋白。klhl8列于ncbi基因id：57563(参见例如seqidno:3)下。在特定实施例中，klhl8基因中的cpg位点cg16713292处的甲基化测量为pca的遗传标记(即，相比于惰性pca，此cpg处的甲基化水平在转移性-致死性中较低)。
在特定实施例中，pca遗传标记在基因atp11a(atp酶，类别vi，类型11a)中包括一或多个cpg甲基化位点，所述基因atp11a位于染色体13并且列于ncbi基因id：23250(参见例如seqidno:4)下。在特定实施例中，atp11a基因中的cpg位点cg21513610处的甲基化测量为pca的遗传标记(即，相比于惰性pca，此cpg处的甲基化水平在转移性-致死性中较低)。
在特定实施例中，pca遗传标记在基因pi15(肽酶抑制剂)中包括一或多个cpg甲基化位点，所述基因pi15是编码位于染色体13的膜结合atp酶的基因。pi15列于ncbi基因id：51050(参见例如seqidno:5)下。在特定实施例中，pi15基因中的cpg位点cg24349665处的甲基化测量为pca的遗传标记(即，相比于惰性pca，此cpg处的甲基化水平在转移性-致死性中较高)。
在特定实施例中，pca遗传标记在基因间区1中包括一或多个cpg甲基化位点。基因间区1位于染色体17，在称为附近无岛区的区中，意味着其离最近的cpg岛超过4kb。在特定实施例中，基因间区1中的cpg位点cg01135464处的甲基化测量为pca的遗传标记(即，相比于惰性pca，此cpg处的甲基化水平在转移性-致死性中较高)。
在特定实施例中，pca遗传标记在基因间区2中包括一或多个cpg甲基化位点。在特定实施例中，基因间区2中的cpg位点cg02223001处的甲基化测量为pca的遗传标记(即，相比于惰性pca，此cpg处的甲基化水平在转移性-致死性中较高)。
在特定实施例中，pca遗传标记在基因间区3中包括一或多个cpg甲基化位点。基因间区3位于染色体1，在称为岛岸的区中，意味着其离最近的cpg岛接近于或低于2kb。在特定实施例中，基因间区3中的cpg位点cg22501793处的甲基化测量为pca的遗传标记(即，相比于惰性pca，此cpg处的甲基化水平在转移性-致死性中较高)。
本公开案不限于特别提及的基因和相关核酸和蛋白质序列但实际上也涵盖包括与本文中所提及的基因序列80％序列一致性；81％序列一致性；82％序列一致性；83％序列一致性；84％序列一致性；85％序列一致性；86％序列一致性；87％序列一致性；88％序列一致性；89％序列一致性；90％序列一致性；91％序列一致性；92％序列一致性；93％序列一致性；94％序列一致性；95％序列一致性；96％序列一致性；97％序列一致性；98％序列一致性或99％序列一致性的序列。
“序列一致性％”是指如通过比较序列所测定的两个或更多个序列之间的关系。在所属领域中，“一致性”还意味着如通过此类序列串之间的匹配测定的序列之间的序列亲缘关系程度。“一致性”(通常称为“相似性”)可容易地通过已知方法计算，包括以下描述的那些：《计算分子生物学》(computationalmolecularbiology)(莱斯克a.m.(lesk,a.m.)编.)牛津大学出版社(oxforduniversitypress),纽约(ny)(1988)；《生物计算：信息学和基因组计划》(biocomputing:informaticsandgenomeprojects)(史密斯d.w(smith,d.w.)编)学术出版社(academicpress),纽约(ny)(1994)；《序列数据的计算机分析》(computeranalysisofsequencedata),第i部(格里芬a.m.(griffin,a.m.)和格里芬h.g.编)胡马纳出版社(humanapress),新泽西州(nj)(1994)；《分子生物学中的序列分析》(sequenceanalysisinmolecularbiology)(范海涅g.(vonheijne,g.)编)学术出版社(1987)；以及《序列分析引物》(sequenceanalysisprimer)(格里布科夫m.(gribskov,m.)和德弗罗j.(devereux,j.)编)牛津大学出版社(oxforduniversitypress),纽约(1992)。测定序列一致性的优选方法设计成获得所测试序列之间的最佳匹配。在公开可用的计算机程序中可以发现用于测定序列一致性和相似性的方法。序列比对和一致性百分比计算可以使用lasergene生物信息学计算程序组(威斯康星麦迪逊的dnastar公司(dnastar,inc.,madison,wisconsin))的megalign程序进行。也可以使用clustal比对法(希金斯和夏普cabios(higginsandsharpcabios),5,151-153(1989)，用默认参数(空位罚分＝10，空位长度罚分＝10)进行序列的多序列比对。相关程序还包括gcg编程程序组(威斯康星套装9.0版(wisconsinpackageversion9.0),遗传学计算机组(gcg),麦迪逊(madison),威斯康星(wisconsin))；blastp、blastn、blastx(altschul等人,《分子生物学杂志(j.mol.biol.)》215:403-410(1990)；dnastar(威斯康星麦迪逊的dnastar公司)；以及并入史密斯-沃特曼算法(smith-watermanalgorithm)的fasta程序(皮尔逊(pearson),计算机方法基因组研究(comput.methodsgenomeres.),[国际学术会议(proc.int.symp.)](1994),会议日期1992,111-20.编辑:suhai,sandor.出版商:plenum,纽约(newyork),纽约(n.y.)州。在本公开案的内容内，应理解如果使用序列分析软件进行分析，那么分析结果是基于所提到的程序的“默认值”。“默认值”意味着软件初次初始化时最初加载的值或参数的任何集合。
此外，术语“基因”可不仅包括编码序列而且包括调节区，如启动子、增强子和末端区。术语可另外包括从mrna转录物中剪接的所有内含子和其它dna序列，以及由替代剪接位点产生的变体。可以参考完整基因序列的部分，如所属领域的普通技术人员所理解。
包括以下示例性实施例和实例以便说明本公开案的特定实施例。所属领域的技术人员鉴于本公开内容应了解可以对本文所公开的特定实施例作出许多改变并且仍获得同样或类似结果而不脱离本发明的精神和范围。
示例性实施例
1.一种区分转移性-致死性前列腺癌(pca)与惰性pca的方法，包括：
获得肿瘤组织样品；
检测位于选自以下的一或多种表观遗传基因座的胞嘧啶的甲基化状态：基因间1、基因间2、fhad1、alkbh5、klhl8、atp11a、基因间3和pi15；
和
基于检测区分转移性-致死性pca与惰性pca。
2.根据实施例1所述的方法，其中胞嘧啶为cpg对的部分。
3.根据实施例2所述的方法，其中cpg对在cpg岛内。
4.根据实施例1或2所述的方法，其中胞嘧啶在cpg位点：cg01135464；cpg位点：cg02223001；cpg位点：cg02394978；cpg位点：cg07166550；cpg位点：cg16713292；cpg位点：cg21513610；cpg位点：cg22501793；和/或cpg位点：cg24349665内。
5.根据实施例1或2所述的方法，其中胞嘧啶是所选择基因或基因间区内的cpg对内的所有胞嘧啶。
6.根据实施例1到5中任一实施例所述的方法，其中参考水平来源于患有惰性pca的受试者群体。
7.根据实施例6所述的方法，其中相比于所述参考水平在基因间1、基因间2、基因间3和/或pi15处的甲基化状态的上调将样品区分为转移性-致死性pca。
8.根据实施例6所述的方法，其中相比于参考水平在基因间1、基因间2、基因间3和/或pi15处的甲基化状态的统计学上显著差异的缺乏将样品区分为惰性pca。
9.根据实施例7或8所述的方法，其中相比于参考水平在fhad1、alkbh5、klhl8和/或atp11a处的甲基化状态的下调将样品区分为转移性-致死性pca。
10.根据实施例6或8所述的方法，其中相比于参考水平在fhad1、alkbh5、klhl8和/或atp11a处的甲基化状态的统计学上显著差异的缺乏将样品区分为惰性pca。
11.根据实施例1到5中任一实施例所述的方法，其中参考水平来源于患有转移性-致死性pca的受试者群体。
12.根据实施例11所述的方法，其中相比于参考水平在基因间1、基因间2、基因间3和/或pi15处的甲基化状态的下调将样品区分为惰性pca。
13.根据实施例11所述的方法，其中相比于参考水平在基因间1、基因间2、基因间3和/或pi15处的甲基化状态的统计学上显著差异的缺乏将样品区分为转移性-致死性pca。
14.根据实施例11或12所述的方法，其中相比于参考水平在fhad1、alkbh5、klhl8和/或atp11a处的甲基化状态的上调将样品区分为惰性pca。
15.根据实施例11或13所述的方法，其中相比于参考水平在fhad1、alkbh5、klhl8和/或atp11a处的甲基化状态的统计学上显著差异的缺乏将样品区分为转移性-致死性pca。
16.根据实施例1到15中任一实施例所述的方法，其中方法包括检测位于基因间1；基因间2；fhad1；alkbh5；klhl8；atp11a；基因间3；以及pi15的胞嘧啶的甲基化状态。
17.根据实施例1到15中任一实施例所述的方法，其中方法包括检测位于基因间1的胞嘧啶的甲基化状态和位于基因间2；fhad1；alkbh5；klhl8；atp11a；基因间3；以及pi15中的一或多种的胞嘧啶的甲基化状态。
18.根据实施例1到15中任一实施例所述的方法，其中方法包括检测位于基因间2的胞嘧啶的甲基化状态和位于基因间1；fhad1；alkbh5；klhl8；atp11a；基因间3；以及pi15中的一或多种的胞嘧啶的甲基化状态。
19.根据实施例1到15中任一实施例所述的方法，其中方法包括检测位于fhad1的胞嘧啶的甲基化状态和位于基因间1；基因间2；alkbh5；klhl8；atp11a；基因间3；以及pi15中的一或多种的胞嘧啶的甲基化状态。
20.根据实施例1到15中任一实施例所述的方法，其中方法包括检测位于alkbh5的胞嘧啶的甲基化状态和位于基因间1；基因间2；fhad1；klhl8；atp11a；基因间3；以及pi15中的一或多种的胞嘧啶的甲基化状态。
21.根据实施例1到15中任一实施例所述的方法，其中方法包括检测位于klhl8的胞嘧啶的甲基化状态和位于基因间1；基因间2；fhad1；alkbh5；atp11a；基因间3；以及pi15中的一或多种的胞嘧啶的甲基化状态。
22.根据实施例1到15中任一实施例所述的方法，其中方法包括检测位于atp11a的胞嘧啶的甲基化状态和位于基因间1；基因间2；fhad1；alkbh5；klhl8；基因间3；以及pi15中的一或多种的胞嘧啶的甲基化状态。
23.根据实施例1到15中任一实施例所述的方法，其中方法包括检测位于基因间3的胞嘧啶的甲基化状态和位于基因间1；基因间2；fhad1；alkbh5；klhl8；atp11a；以及pi15中的一或多种的胞嘧啶的甲基化状态。
24.根据实施例1到15中任一实施例所述的方法，其中方法包括检测位于pi15的胞嘧啶的甲基化状态和位于基因间1；基因间2；fhad1；alkbh5；klhl8；atp11a；以及基因间3中的一或多种的胞嘧啶的甲基化状态。
25.根据实施例1到15中任一实施例所述的方法，其中方法包括检测位于alkbh5、fhad1、klhl8和pi15中的一或多种的胞嘧啶的甲基化状态并且其中甲基化状态改善格里森分数的预后辨别(例如通过提高roc得分)。
26.根据实施例25所述的方法，其中格里森分数是<＝6，3+4＝7或4+3＝7或8-10格里森分数。
27.根据实施例1到26中任一实施例所述的方法，其中样品获自受试者。
28.根据实施例1到27中任一实施例所述的方法，其中样品是原发pca肿瘤样品。
29.根据实施例1到28中任一实施例所述的方法，其中甲基化状态由平均β差值(例如参见图4)或β差值界定。
30.根据实施例25所述的方法，其中平均β差值或β差值是(+)或(-)。
31.根据实施例1到5、实施例7、实施例9、实施例11、实施例13、实施例15或实施例16到30中任一实施例所述的方法，其中生物分类为转移性-致死性pca指导积极性或实验性治疗。
32.根据实施例1到6、实施例8、实施例10、实施例12、实施例14或实施例16到30中任一实施例所述的方法，其中生物分类为惰性pca指导中度、最小程度或无治疗。
33.根据实施例1到32中任一实施例所述的方法，其中检测包括使用基于亚硫酸氢盐的甲基化分析进行分析。
34.根据实施例1到33中任一实施例所述的方法，其中检测包括使用焦磷酸测序进行分析。
35.一种用于区分转移性-致死性pca与惰性pca的试剂盒，包括用以检测位于选自基因间1、基因间2、fhad1、alkbh5、klhl8、atp11a、基因间3和pi15的一或多种表观遗传基因座的胞嘧啶的甲基化状态的试剂。
36.根据实施例35所述的试剂盒，其中试剂检测作为cpg对的部分的胞嘧啶的甲基化状态。
37.根据实施例36所述的试剂盒，其中试剂检测作为cpg岛内的cpg对的部分的胞嘧啶的甲基化状态。
38.根据实施例35或36所述的试剂盒，其中试剂检测cpg位点：cg01135464；cpg位点：cg02223001；cpg位点：cg02394978；cpg位点：cg07166550；cpg位点：cg16713292；cpg位点：cg21513610；cpg位点：cg22501793；和/或cpg位点：cg24349665内的胞嘧啶的甲基化状态。
39.根据实施例35或36所述的试剂盒，其中试剂检测所选择的基因或基因间区内的所有cpg对内的胞嘧啶的甲基化状态。
40.根据实施例35到39中任一实施例所述的试剂盒，包括参考水平。
41.根据实施例40所述的试剂盒，其中参考水平来源于患有惰性pca的受试者群体。
42.根据实施例41所述的试剂盒，其中相比于参考水平在基因间1、基因间2、基因间3和/或pi15处的甲基化状态的上调将样品区分为转移性-致死性pca。
43.根据实施例41所述的试剂盒，其中相比于参考水平在基因间1、基因间2、基因间3和/或pi15处的甲基化状态的统计学上显著差异的缺乏将样品区分为惰性pca。
44.根据实施例41或42所述的试剂盒，其中相比于参考水平在fhad1、alkbh5、klhl8和/或atp11a处的甲基化状态的下调将样品区分为转移性-致死性pca。
45.根据权利要求41或43所述的试剂盒，其中相比于参考水平在fhad1、alkbh5、klhl8和/或atp11a处的甲基化状态的统计学上显著差异的缺乏将样品区分为惰性pca。
46.根据实施例40所述的试剂盒，其中参考水平来源于患有转移性-致死性pca的受试者群体。
47.根据实施例46所述的试剂盒，其中相比于参考水平在基因间1、基因间2、基因间3和/或pi15处的甲基化状态的下调将样品区分为惰性pca。
48.根据实施例46所述的试剂盒，其中相比于参考水平在基因间1、基因间2、基因间3和/或pi15处的甲基化状态的统计学上显著差异的缺乏将样品区分为转移性-致死性pca。
49.根据实施例46或47所述的试剂盒，其中相比于参考水平在fhad1、alkbh5、klhl8和/或atp11a处的甲基化状态的上调将样品区分为惰性pca。
50.根据实施例46或49所述的试剂盒，其中相比于参考水平在fhad1、alkbh5、klhl8和/或atp11a处的甲基化状态的统计学上显著差异的缺乏将样品区分为转移性-致死性pca。
51.根据实施例35到50中任一实施例所述的试剂盒，其中试剂盒包括用以检测位于基因间1；基因间2；fhad1；alkbh5；klhl8；atp11a；基因间3；以及pi15的胞嘧啶的甲基化状态的试剂。
52.根据实施例35到50中任一实施例所述的试剂盒，其中试剂盒包括用以检测位于基因间1的胞嘧啶的甲基化状态和位于基因间2；fhad1；alkbh5；klhl8；atp11a；基因间3；以及pi15中的一或多种的胞嘧啶的甲基化状态的试剂。
53.根据实施例35到50中任一实施例所述的试剂盒，其中试剂盒包括用以检测位于基因间2的胞嘧啶的甲基化状态和位于基因间1；fhad1；alkbh5；klhl8；atp11a；基因间3；以及pi15中的一或多种的胞嘧啶的甲基化状态的试剂。
54.根据实施例35到50中任一实施例所述的试剂盒，其中试剂盒包括用以检测位于fhad1的胞嘧啶的甲基化状态和位于基因间1；基因间2；alkbh5；klhl8；atp11a；基因间3；以及pi15中的一或多种的胞嘧啶的甲基化状态的试剂。
55.根据实施例35到50中任一实施例所述的试剂盒，其中试剂盒包括用以检测位于alkbh5的胞嘧啶的甲基化状态和位于基因间1；基因间2；fhad1；klhl8；atp11a；基因间3；以及pi15中的一或多种的胞嘧啶的甲基化状态的试剂。
56.根据实施例35到50中任一实施例所述的试剂盒，其中试剂盒包括用以检测位于klhl8的胞嘧啶的甲基化状态和位于基因间1；基因间2；fhad1；alkbh5；atp11a；基因间3；以及pi15中的一或多种的胞嘧啶的甲基化状态的试剂。
57.根据实施例35到50中任一实施例所述的试剂盒，其中试剂盒包括用以检测位于atp11a的胞嘧啶的甲基化状态和位于基因间1；基因间2；fhad1；alkbh5；klhl8；基因间3；以及pi15中的一或多种的胞嘧啶的甲基化状态的试剂。
58.根据实施例35到50中任一实施例所述的试剂盒，其中试剂盒包括用以检测位于基因间3的胞嘧啶的甲基化状态和位于基因间1；基因间2；fhad1；alkbh5；klhl8；atp11a；以及pi15中的一或多种的胞嘧啶的甲基化状态的试剂。
59.根据实施例35到50中任一实施例所述的试剂盒，其中试剂盒包括用以检测位于pi15的胞嘧啶的甲基化状态和位于基因间1；基因间2；fhad1；alkbh5；klhl8；atp11a；以及基因间3中的一或多种的胞嘧啶的甲基化状态的试剂。
60.根据实施例35到59中任一实施例所述的试剂盒，包括用以进行基于亚硫酸氢盐的甲基化分析的试剂。
61.根据实施例35到60中任一实施例所述的试剂盒，进一步包括用以进行焦磷酸测序的试剂。
62.根据实施例35到61中任一实施例所述的试剂盒，包括用以进行甲基化分析的探针和基于硅的阵列。
63.根据实施例62所述的试剂盒，其中探针包括珠粒。
64.根据实施例63所述的试剂盒，其中珠粒使可检测标记结合。
65.根据实施例35到64中任一实施例所述的试剂盒，包括结合于一或多种由基因间1；基因间2；fhad1；alkbh5；klhl8；atp11a；基因间3；以及pi15中的一或多种编码的蛋白质和/或一或多种对应于基因间1；基因间2；fhad1；alkbh5；klhl8；atp11a；基因间3；以及pi15中的一或多种的核苷酸序列的蛋白质和/或核苷酸序列。
66.根据实施例35到65中任一实施例所述的试剂盒，包括dna核苷酸序列和/或rna核苷酸序列。
67.根据实施例66所述的试剂盒，其中蛋白质包括抗体、抗原决定基或模拟抗原决定基。
68.根据实施例35到67中任一实施例所述的试剂盒，包括可检测标记。
69.根据权利要求68所述的试剂盒，其中可检测测标记为放射性同位素、酶、染料、荧光染料、磁珠或生物素。
70.根据实施例35到69中任一实施例所述的试剂盒，包括硫酸氢盐和对亚硫酸氢盐转化的dna具有特异性的pcr引物。
71.根据实施例35到70中任一实施例所述的试剂盒，包括dna断裂酶。
72.根据实施例35到71中任一实施例所述的试剂盒，包括杂交缓冲液。
73.根据实施例35到72中任一实施例所述的试剂盒，包括用于seqidno:1到seqidno:5中的任一个内的cpg对的靶特异性探针。
74.根据实施例35到73中任一实施例所述的试剂盒，包括用于cpg位点：cg01135464；cpg位点：cg02223001；cpg位点：cg02394978；cpg位点：cg07166550；cpg位点：cg16713292；cpg位点：cg21513610；cpg位点：cg22501793；和/或cpg位点：cg24349665内的cpg对的具有靶特异性探针的珠粒。
75.根据实施例35到74中任一实施例所述的试剂盒，包括一或多种核苷酸，所述核苷酸包括seqidno:6到seqidno:29中的一或多个。
76.一种用以改善格里森分数的预后判定的方法或试剂盒，包括实践方法或使用根据实施例1到75中任一实施例所述的试剂盒。
实例.方法.研究受试者.弗雷德·哈钦森(fh)癌症研究中心组.fh组包括510名针对前列腺的临床局部腺癌经受根除性前列腺切除术作为首先疗法的欧美pca患者。这些患者先前纳入基于群体的研究。阿加略(agalliu)等人,《美国流行病学杂志(amjepidemiol)》168:250-60,2008；斯坦福(stanford)等人,《癌症流行病学生物标记和预防(cancerepidemiolbiomarkersprev)》8:881-6,1999。第一研究包括在1993年1月与1996年12月之间诊断的年龄为40到64岁的男性，并且在第二研究中，男性年龄为35到74岁并在2002年1月与2005年12月之间诊断。格里森分数、诊断性psa和肿瘤阶段从seattle-pugetsoundsurveillance、流行病学(epidemiology)和endresultsprogram癌症登记处收集。生命状态和潜在的死亡原因也从癌症登记处获得，并且通过死亡证明书的审核确认死亡原因。pca复发状况从自以下各者前瞻性收集的信息确定：通过2004年到2005年和2010年到2011年的患者完成的随访调查、医疗记录综述和/或视需要医师随访。转移性进展通过正向骨扫描、mrict或活检确认。pca特异性死亡包括具有归因于icd-9编码180.0或icd-10编码c61.9的潜在死亡原因的那些。产生转移瘤或死于pca的患者组合于致死性表型类别中。历经平均8.2年的随访，317名患者没有复发迹象并且113名患者已复发，包括27例转移性-致死性事件；80名男性复发状况未知。对于本发明的分析，比较致死性表型患者与未复发的患者。fh机构审查委员会批准研究并且所有与会者签署知情同意声明。
东弗吉尼亚(ev)医学院组.验证组包括80名诊断患有局部阶段pca的患者，其在ev医学院经受根除性前列腺切除术。所述组包括经历疾病进展为转移性或致死性pca(n＝31)的男性和在诊断之后5年或更多年无复发迹象的患者(n＝49)，所述患者基于诊断年份(1992-2009年)匹配。如fh组中所述鉴别转移性-致死性事件，并且所有患者都是欧美人。ev组中的患者平均随访9.0年以获得结果。
肿瘤组织样品制备和dna提取.福尔马林固定的链烷烃嵌入的前列腺肿瘤组织块从两个组的根除性前列腺切除术试样中获得并用于制备苏木精和曙红染色的切片，其由病理学家检视以证实腺癌的存在和位置。针对每一患者，从富含≥75％肿瘤细胞的显性病变取得两个1mm肿瘤组织核心以进行dna纯化。recoverall总核酸分离试剂盒(recoveralltotalnucleicacidisolationkit)(ambion/appliedbiosciences，德克萨斯州奥斯汀)用于提取dna，所述dna随后用picogreen定量，取等分试样于96孔板并运送到illumina(illumina公司，)以进行dna甲基化图谱分析。
dna甲基化图谱分析.ezdna甲基化试剂盒(ezdnamethylationkit)(zymoresearch，加利福尼亚州欧文)用于亚硫酸氢盐转化肿瘤dna样品。阵列上的对照物用于追踪亚硫酸氢盐转化效率。
数据处理.根据illumina方案通过使用检测p值度量鉴别不合格样品。如果检测到低于95％的阵列上的所述样品的cpg位点具有<0.05检测p值，那么排除样品，从而导致移除31个fh和15ev样品。fh组和ev组中的患者的最终数目分别为327名(303名非复发性，24名转移性-致死性)和65名(41名非复发性，24名转移性-致死性)。另外，排除具有>0.01检测p值的cpg位点。在数据过滤之后，fh组中478,998个cpgs可用并且在ev组中479,103个可用(477,460重叠)。fh和ev组中的复制样品的相关性系数分别为0.96-0.99和0.99。fh和ev中的重复样品的相关性系数为0.99和0.98。
基因表达谱分析.相同患者的肿瘤样品用于使用全基因组
统计分析.使用combat(约翰逊(johnson)等人,《生物统计学(biostatistics)》8:118-27,2007)去除批次影响，并且使用阵列标准化(bioconductorminfi)内的子集分位数使甲基化数据标准化。马克西莫维奇(maksimovic)等人,《基因组生物学(genomebiol)》13:r44,2012。计算甲基化β值和m值，其中β值表示cpg位点处的dna甲基化的百分比。甲基化m值是正态分布的对数转换的β值。m值用于统计学测试并且β值表示患者群组之间的甲基化差异。cpg的基因组注释基于illumina方案。hansen,illumina人类甲基化450kanno.ilmn12.hg19:illumina的450k甲基化阵列的注释.r软件包0.2.1版。使用fh组鉴别用于预后的dna甲基化生物标记。首先，对于所有独立的cpg位点，计算用于预测转移性-致死性与非复发性pca的auc和部分auc(pauc)。随着选择具有低假阳性率的生物标记作为目标，pauc评估固定的高(95％)特异性下的性能。选择基于pauc的前4％标记和基于auc的前1％，获得22,290cpg用于进一步分析。
接着，鉴别生物标记，所述生物标记相比于单独格里森分数展示预测转移性-致死性pca的最大改善。因为格里森分数是使用最广泛的肿瘤侵袭性的测量，所以目标是可以超过格里森分数提供的患者的预后辨别的改善患者的预后辨别的cpg的鉴别。也考虑其它可能的预后分类器，包括诊断年龄、诊断性psa和病理阶段，但这些因素相比于仅具有格里森分数的模型未改善转移性-致死性pca的预测(p>0.05)，并且因此在其它分析中不考虑。
拟合用于转移性-致死性与非复发性pca的逻辑回归模型，其含有格里森分数作为唯一的预测因子。基于所述模型，使用三个选择标准进行前向模型选择：auc、pauc(95％特异性)和p值(沃尔德测试)。对于每个准则，鉴别相比于仅具有格里森分数的基本模型在预测转移性-致死性pca中展示最大改善或为最有效的cpg；随后将经鉴别的生物标记添加至具有格里森分数的模型。继续前向选择，每次选择一种待包括于模型中的其它cpg，直到符合预先指定的停止准则；对于auc，此为auc<0.005的增量；对于pauc，此为pauc<0.0005的增量；并且对于p值，此为>0.05。用自举样品重复100次这整个过程。选择在不同自举组中选择多次的生物标记(当考虑auc时≥3；当考虑pauc时≥3；当考虑p值时≥4)以进行进一步评价。
随后在ev(验证)组中测试在fh组中对转移性-致死性疾病最具预测性的甲基化生物标记。对于每个生物标记，计算用于转移性-致死性与非复发性pca的auc和pauc(95％特异性)。使用10,000个排列计算auc和pauc的p值，并且使用2,000个分层自举复本计算auc和pauc的95％置信区间。也计算似然比测试以相比于仅具有格里森分数的模型比较用格里森分数和cpg生物标记拟合的模型。所有统计分析使用r执行。
结果.相比于任一组中未复发的患者，患有转移性-致死性pca的患者之间的平均年龄无差异(图1)。在两个组中，相对于无复发迹象的男性(所有p值<0.01)，患有致死性表型的男性的格里森分数、病理阶段和诊断下的psa较高。
图2展示在fh组中对转移性-致死性pca最具预测性的42种dna甲基化生物标记。基于这些cpg超过单独格里森分数改善预后辨别的能力鉴别这些cpg(图3)，并且在ev组中验证cpg生物标记的子集(图2，星号)。42种生物标记的一半相比于非复发性疾病展示转移性-致死性pca的较高甲基化(图2)。42种生物标记的患者群组(转移性-致死性对非复发性)之间的平均甲基化差值在1％到22％范围内(平均值＝6.1％)，并且转移性-致死性pca的pauc和auc值分别地在0.0063到0.0181和0.539到0.844范围内。42种生物标记的dna甲基化水平并非强烈相关(所有成对r2<0.5)。
随后在ev组中评价42种排名靠前的生物标记。对于30种cpg，转移性-致死性对非复发性pca之间的甲基化水平的差异在ev中的方向与在fh组中相同。这些生物标记中的八种在ev组中表明显著的auc或pauc(p值<0.05；图4)。生物标记中的一种具有显著的auc和pauc两者(atp11acg21513610)。具有最大平均甲基化差值的cpg为cg01135464。具有最高auc的生物标记为klhl8cg16713292(0.753)，并且最大的pauc对应于atp11acg21513610(0.0085)。随后研究的是这些cpg的甲基化水平在相同基因或基因间区中与相邻cpg的甲基化水平是否相关。对于五种cpg而言，甲基化水平与邻近cpg位点的甲基化水平相关(成对r2>0.5)(atp11a中347种cpg中的79种；fhad1中33种cpg中的1种；pi15中6种cpg种的3种；邻近cg01135464[chr.17,opensea]的2种cpg的2种；以及邻近cg22501793[chr.1,s_shore]的2种cpg中的1种)。图5展示八种生物标记中的每一种单独和与格里森分数组合的roc曲线。
图6展示当与格里森分数组合时用于对转移性-致死性pca进行分类的评价的八种经验证生物标记的性能。在ev组中用于单独格里森分数的auc为0.816。这高于其它研究中所报告的auc并可能反映研究设计，其涉及选择转移性-致死性患者和无复发迹象的患者群组。格里森分数具有0.0101的用于转移性-致死性pca的pauc。随后进行似然比测试，比较仅具有格里森分数的模型与包括格里森分数和八种cpg中的一种两者的模型。这一测试对于以下cpg中的四种显著(p<0.05)：alkbh5(cg07166550)、fhad1(cg02394978)、klhl8(cg16713292)和pi15(cg24349665)，提供其与用于预后辨别患者的格里森分数互补的进一步证据。
在最终分析中，评价肿瘤mrna表达谱。对于涵盖经验证生物标记的五种基因中的两种而言，dna甲基化水平与以下转录水平显著相关：atp11a(皮尔森r2＝-0.29，p＝2.78e-18)和pi15(皮尔森r2＝-0.28，p＝5.77e-08)。atp11acg21513610位于基因体，而cg24349665处于pi15的启动子区中。
标记的技术验证使用焦磷酸测序进行。用于基于焦磷酸测序的dna甲基化分析的引物展示于图7中。首先，比较甲基化分析结果与使用hm450技术获得的结果。焦磷酸测序结果与针对基因内的五种cpg标记的hm450结果高度相关(图8)，表明焦磷酸测序是可用于用以区分转移性-致死性与惰性pca的所公开的方法和试剂盒的技术。模型训练使用fh和ev组进行并使用来自密歇根大学(universityofmichigan)组的样品测试，并且模型中的每种标记的选择阶次基于每个标记的对数似然和lr检验p值，其展示于图8中。接着，用格里森分数构建的前向模型针对所验证的五种cpg进行，并且将所有五种cpg选入模型(图9a)。经拟合的模型结果展示于图9b中。模型加格里森分数的auc为0.89，其高于单独格里森分数的auc(0.87)。这些数据表明标记的效用，并且表明焦磷酸测序是可以用于分析dna甲基化以帮助区分惰性与转移性-致死性pca的技术。
使用两种不同的分析类型-hm450阵列和焦磷酸测序检测并确认本文中所公开的遗传标记的甲基化状态。
所属领域的技术人员将理解，本文所公开的每一实施例可包含其具体陈述的元件、步骤、成分或组分或主要由它们组成或由它们组成。因此，术语“包括(include/including)”应解释为列举：“包含、由……组成或主要由……组成”。如本文所使用，过渡术语“包含(comprise/comprises)”意味包含但不限于并允许纳入甚至呈主要量的未指定元件、步骤、成分或组分。过渡短语“由……组成”不包括任何未指定的元件、步骤、成分或组分。过渡短语“基本上由……组成”将实施例的范围限于指定元件、步骤、成分或组分以及不显著影响实施例的那些。如本文所用，物质效果将造成基于检测本文中鉴别的cpg位点的甲基化状态以检测受试者中的转移性-致死性或惰性pca的能力的统计学上的显著降低。
在核苷酸序列的情形下，“用于检测的试剂”、“标靶特异性探针”和“对……具有特异性”意味着核苷酸序列与具有用以可靠地检测靶向序列内的胞嘧啶的甲基化状态的足够特异性和强度的靶序列(或基于特定分析与标靶序列相关的序列)相互作用。基于本公开案的教示内容和参考大量公开可用的资源和资料库，具有这些特征的特定核苷酸序列可以容易地产生并通过所属领域的一般技术人员鉴别。
除非另外指明，否则本说明书和权利要求书中所用的表示成分量、特性(诸如分子量)、反应条件等的所有数量应理解为在所有情况下都由术语“约”修饰。因此，除非有相反指示，否则在说明书和所附权利要求书中所阐述的数值参数是可取决于试图通过本发明获得的所需特性而变化的近似值。最低限度地，并且不试图限制等效物原则应用于权利要求书的范围，至少应根据所报告的有效数字的数目并且通过应用一般四舍五入技术来解释每个数值参数。当需要进一步阐明时，在结合所陈述数值或范围使用时，术语“约”具有由所属领域的技术人员合理地归属至其的意义，即表示比所陈述值或范围略大或略小，在所陈述值的±20％的范围内；所陈述值的±19％的范围内；所陈述值的±18％的范围内、所陈述值的±17％的范围内；所陈述值的±16％的范围内；所陈述值的±15％的范围内；所陈述值的±14％的范围内；所陈述值的±13％的范围内；所陈述值的±12％的范围内；所陈述值的±11％的范围内；所陈述值的±10％的范围内；所陈述值的±9％的范围内；所陈述值的±8％的范围内；所陈述值的±7％的范围内；所陈述值的±6％的范围内；所陈述值的±5％的范围内；所陈述值的±4％的范围内；所陈述值的±3％的范围内；所陈述值的±2％的范围内或所陈述值的±1％的范围内。
尽管阐述本发明广泛范围的数值范围和参数是近似值，但具体实例中所阐述的数值是尽可能精确报导的。但是，任何数值固有地含有某些由其对应测试测量值中所发现的标准差必然造成的误差。
除非本文另外指示或明显与上下文相矛盾，否则在描述本发明的情形下(尤其在以下权利要求书的情形下)所用的术语“一(a/an)”、“所述”和类似指示物应解释为涵盖单数和复数两者。本文中值范围的叙述仅旨在充当个别地提及处于所述范围内的每个单独值的简写方法。除非本文另外指示，否则每一个个别值并入到本说明书中，如同其在本文中个别地列举一般。除非本文中另有说明或另外与上下文抵触，否则本文所述的所有方法可以按任何适合的顺序进行。本文中提供的任何和所有实例或例示性语言(例如，“诸如”)的使用，仅打算更好地阐明本发明，并且不对以其它方式所要求的本发明范围造成限制。本说明书中的任何语言都不应被解释为指示任何未要求的要素对于实践本发明而言是必需的。
本文所公开的本发明的替代性要素或实施例的分组不应解释为限制。每个群组成员可以个别地或与所述群组的其它成员或本文中所见的其它要素以任何组合形式提及和要求。预期，群组中的一或多个成员可以出于便利性和/或专利性的原因而包括于群组中或由群组删除。当任何这类纳入或删除发生时，本说明书被认为含有所修改的群组，因此满足所附权利要求书中所用的所有马库西(markush)群组的书面描述。
本文中描述了本发明的某些实施例，包括本发明人已知的用于进行本发明的最佳模式。当然，在阅读前文描述之后，这些所描述实施例的变化对于所属领域的技术人员将变得显而易见。本发明人期望熟练的技术人员在适当时采用这类变化，并且本发明人打算以不同于本文中具体描述的其它方式来实践本发明。因此，本发明包括适用法律所允许之随附申请专利范围中所引述的标的物的所有修改及等效物。此外，除非本文中另外指出或另外明显与上下文相矛盾，否则本发明涵盖上述要素以其所有可能的变化形式的任何组合。
此外，在整个本说明书中已参考了很多专利、印刷出版物、期刊文章以及其它书面文本(本文所提到的材料)。参考材料各自关于其所提到的教示内容以全文引用的方式单独并入本文中。
最后，应理解本文所公开的本发明的实施例说明本发明的原理。可以采用的其它修改在本发明的范围内。因此，作为实例而非限制，可以根据本文中的传授内容来利用本发明的替代性配置。因此，本发明不限于如所精确展示和描述的内容。
本文中所示的细节是作为实例并且仅出于说明性论述本发明的优选实施例的目的，并且是为了提供被认为本发明的多个实施例的原理和概念方面的最有用且容易理解的描述而呈现。在这一方面，没有尝试比基础理解本发明所必需的程度更详细地展示本发明的结构细节，本说明书加上图示和/或实例使得所属领域的技术人员很清楚如何在实际中实施本发明的几种形式。
除非在后续实例中清晰且明确地修改或当所述含义的应用使任何构造无意义或基本上无意义时，本发明使用的定义和解释意味且意图控制任何未来的构造。在术语构造将使其无意义或基本上无意义的情况下，定义应取自韦氏辞典(第3版)(webster'sdictionary,3rdedition)或所属领域的技术人员已知的辞典，如《生物化学与分子生物学牛津辞典(oxforddictionaryofbiochemistryandmolecularbiology)》(anthonysmith编，牛津大学出版社，牛津，2004)。