一株玫瑰黄链霉菌及其应用的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，尤其涉及一株玫瑰黄链霉菌及其应用。
背景技术：
：在农业生产中，化肥的使用提高了农作物的产量，然而也向环境释放了大量的有害物质，污染了土壤、水源以及食品本身，对人类健康及生存环境也构成了极大威胁。同时，为了减少植物病害给农业生产造成的损失，在农业生产中也长期大量施用化学农药，导致农药残留及环境污染，最终危害人类健康并破坏生态平衡，同时也使病原菌对各种化学杀菌剂产生了严重的抗药性。生物防治因其对环境、生态及人类健康安全、无毒等优点得到了世界各国的广泛重视并发挥着越来越重要的作用。因此，为了适应绿色农业以及农业可持续发展的需求，开发替代化学肥料的新肥源及代替化学农药的生物农药成为当务之急。技术实现要素：鉴于限于技术所存在的问题，本发明提供一株玫瑰黄链霉菌及其应用，对植物具有明显的促生作用，同时能够抑制多种病原真菌，具有很好的促生及防治效果，因此具有良好的应用前景。本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一株玫瑰黄链霉菌，其特征在于，该菌株为玫瑰黄链霉菌(Streptomycesroseoflavus)，其保藏号为CGMCCNO.13416。该菌株已于2016年12月02日由中国普通微生物菌种保藏管理中心(ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter,CGMCC)保藏。进一步，该玫瑰黄链霉菌具有SEQIDNO.1所示的序列。本发明还提供一种菌剂，含有上述玫瑰黄链霉菌和/或玫瑰黄链霉菌的发酵液。本发明还提供一种上述菌剂的制备方法，包括以下步骤：1)将权利要求1所述的玫瑰黄链霉菌接种到高氏1号培养基，培养，长出菌块；2)选取步骤1)的菌块接种到发酵培养基中，发酵，获得种子液；3)将步骤2)的种子液接种到发酵培养基中，发酵，得到发酵液。进一步，步骤1)中,培养温度为28℃，培养时间为7天。进一步，步骤2)中,发酵的方式为震荡发酵，转速为170rpm，培养温度为28℃，培养时间为48h；进一步，步骤3)中,接种量为10％，培养温度为28℃，发酵96h，转速为220rpm；进一步，步骤2)和步骤3)中的发酵培养基的配方均为：麦芽糖10％，酵母粉4.0％，葡萄糖4.0％，其余为水。采用上述的配方的培养基以及培养条件有利于菌株正常生长，尽可能保持菌株的活性，从而提高其促生及抑菌代谢产物的产量和稳定。进一步，在步骤3)后，还包括对发酵液离心取上清的步骤。例如：在具体操作时，离心的转速可以为9500rpm，离心的时间可以为10min。本发明还提供一种上述玫瑰黄链霉菌在促进植物生长中的应用。发明人在研究中意外的发现，采用本发明所述的玫瑰黄链霉菌可以显著的促进植物的生长。所述植物可以为但不限于番茄、小麦、辣椒等。本发明还提供一种上述玫瑰黄链霉菌在抑制病原真菌生长中的应用。发明人在研究中意外的发现，采用本发明所述的玫瑰黄链霉菌可以明显抑制病原真菌的生长，尤其是抑制病原真菌的菌丝的生长。所述病原真菌可以为但不限于番茄叶霉菌、玉米弯孢菌、稻曲病菌、鲁保1号、小麦纹枯病菌中的任一种或任几种的混合。附图说明图1为本发明所述玫瑰黄链霉菌的菌落形态图。图2A和图2B分别为本发明所述玫瑰黄链霉菌在不同倍数的电镜条件下的电镜扫描图。图3为本发明的玫瑰黄链霉菌系统发育树分析的结果图。图4为对真菌的抑制作用的试验结果，A代表用无菌水试验，B代表用玫瑰黄链霉菌发酵液试验(把玫瑰黄链霉菌发酵液按照体积比10％的比例加到PDA培养基中)。图5A、图5B和图5C为本发明的玫瑰黄链霉菌对番茄的促生作用试验结果，其中“CK”代表对照组浇灌清水，“100X”代表浇灌稀释100倍玫瑰黄链霉菌发酵液；图5A为15天的实验结果，图5B和图5C为45天的实验结果。图6A为验证本发明的玫瑰黄链霉菌对小麦的促生作用试验的结果(小麦的生长图)，左边的“CK”为对照组清水处理的实验结果，右边的“100X”为玫瑰黄链霉菌发酵液稀释100倍后处理的实验结果。图6B为验证本发明的玫瑰黄链霉菌对小麦的促生作用试验结果(小麦的根系生长情况)，左边的“CK”为对照组清水处理的实验结果，右边“100X”为玫瑰黄链霉菌发酵液稀释100倍后处理的实验结果。图7A至图7C为玫瑰黄链霉菌对辣椒的促生作用试验结果，其中“CK”代表对照组浇灌清水，“100X”代表浇灌稀释100倍玫瑰黄链霉菌发酵液。图7A为15天的生长结果，图7B为45天的生长结果,图7C为45天的生长结果。具体实施方式以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。本发明提供一株玫瑰黄链霉菌，对番茄、辣椒及小麦有明显的促生作用，同时能够抑制多种病原真菌，具有很好的促生及防治效果，因此具有良好的应用前景。下面对于本发明的技术方案进行具体的介绍。本发明所提供的菌株为玫瑰黄链霉菌(Stremptomycesroseoflavus),是张克诚研究员从青海省祁连山地区分离获得的，已于2016年12月2日保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.13416，命名为NKZ-259。其具有以下生物学特征。下面通过具体实施例对本发明的方案进行具体介绍。实例1玫瑰黄链霉菌(StremptomycesroseoflavusNKZ-259)的分离与纯化本发明的玫瑰黄链霉菌(StremptomycesroseoflavusNKZ-259)是从青海省祁连山土壤中采用稀释平板法和平板划线法分离获得的，分离纯化的方法为：称取土样1g，放入盛有99ml无菌水的带有玻璃珠的三角瓶中，振荡摇匀30min，然后用移液枪从三角瓶中吸取1ml，加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混和均匀，以此类推分别制成10-2、10-3、10-4不同稀释度的土壤溶液。取100μL土壤溶液涂布于高氏1号培养基平板上，每个稀释度做3个重复，28℃培养3d。挑取单菌落于高氏1号培养基平板上划线，定时观察菌落生长情况，然后采用平板划线法，纯化芽孢杆菌菌株，分别制作斜面标号保存于4℃冰箱。高氏1号培养基的配方(g/L)：可溶性淀粉20.0，硝酸钾1.0，磷酸氢二钾0.5，七水合硫酸镁0.5，氯化钠0.5，七水合硫酸亚铁0.01，琼脂17。称取后，加热搅拌溶解于蒸馏水中，分装三角瓶，121℃高压灭菌，倒平板。实例2玫瑰黄链霉菌(StreptomycesroseoflavusstrainNK-259)抑菌活性测定1、平板对峙试验将17种病原真菌(分别为番茄叶霉菌、玉米弯孢菌、棉花枯萎病菌、桃根霉、黑腐病菌、稻曲病菌、杨树溃疡病菌、玉米小斑病菌、苹果轮纹病菌、葡萄黑腐病菌、苹果腐烂病菌、鲁保1号、烟草赤星病菌、玉米大斑病菌、小麦赤霉、稻瘟菌、小麦纹枯病菌，均来自中国农业科学院植物保护研究所农用抗生素研究组)在PDA上培养5天，然后用手术刀切小块菌块转接到PDA培养基(中文全称为马铃薯葡萄糖琼脂培养基，英文名称为PotatoDextroseAgarMedium)中央，在离病原菌等距离的两侧分别放入无菌牛津杯，然后分别加入玫瑰黄链霉菌NKZ-259的发酵液(28℃发酵96h)和无菌水，25℃培养养3-9天，观察NK-259发酵液对病原真菌生长的抑制效果。结论：玫瑰黄链霉菌NKZ-259对上述17种病原真菌中的五种具有抑制作用，如图4A所示，分别是番茄叶霉菌、玉米弯孢菌、稻曲病菌、鲁保1号、小麦纹枯病菌。2、对菌丝生长的影响将玫瑰黄链霉菌NKZ-259接种到高氏1号培养基上，28℃培养7天，然后用手术刀切1cm2的菌块接种到发酵培养基中，震荡发酵96h(28℃，220rpm)。然后将发酵液离心(10000r/min，4℃)，取上清液，用0.22μm滤膜过滤除菌得到无菌发酵液。采用菌丝生长速率法，检测玫瑰黄链霉菌NKZ-259发酵液对5种供试病原真菌(番茄叶霉菌、玉米弯孢菌、稻曲病菌、鲁保1号、小麦纹枯病菌)菌丝生长的影响。在无菌条件下，取制备好的发酵液10mL和融化的PDA培养基90mL混匀，在无菌培养皿中制成含发酵液的平板培养基，以不加发酵液的培养基为对照，在每个培养基表面放入1个直径5mm的供试病原真菌菌饼，每个处理3次重复，25℃恒温培养7d后，十字交叉法测量菌落直径，计算菌丝生长抑制率：菌丝生长抑制率＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100％。实验结果如图4B所示。表1病原真菌菌丝生长抑制率(％)番茄叶霉病菌48.72±2.32玉米弯孢菌60.48±1.66稻曲病菌63.11±2.73鲁保1号40.00±1.13小麦纹枯病菌26.90±1.69结论：由表1可以看出，玫瑰黄链霉菌NKZ-259菌株无菌发酵液对上述5种供试病菌菌丝生长都有明显的抑制作用，如图4B所示，抑制率分别为48.72％、60.48％、63.11％、40.00％、26.90％。实例3玫瑰黄链霉菌(StremptomycesroseoflavusNKZ-259)的形态观察菌落形态观察：在高氏1号培养基上接种培养NKZ-259菌株，28℃，倒置培养7天后观察菌落形态，发现菌落呈淡粉色，有少量白色气生菌丝(如图1所示)；电子显微镜镜观察：用手术刀从培养基上切取少量菌丝，放入2-4％戊二醛固定液中固定1-2天，0.1MpH7.2PBS缓冲液洗，用1％OsO4固定后1-2小时，再用重蒸水冲洗30分钟，随后用30％、50％、70％、80％、90％、95％、100％乙醇梯度脱水，每级15-20分钟，样品脱水后用醋酸异戊酯处理，CO2临界点干燥，干燥好的样品粘贴在样品台上，用离子溅射仪表面喷金，喷金后样品在扫描电镜下扫描，观察芽孢形态拍照并记录。通过培养和观察发现孢子丝直或柔曲，孢子呈卵圆形或椭圆形，表面光滑。(如图2A和图2B所示)。实例4玫瑰黄链霉菌(StreptomycesroseoflavusstrainNKZ-259)的16srRNA基因序列鉴定将菌株接种于YEME培养基中，摇床培养(28℃，220rpm)48h小时后，取500μL菌液到EP管中，离心，弃上清，收集菌体，提取DNA，然后进行PCR验证。用于PCR扩增的引物如下：正向引物F：5'-GCAGTCGAGCGGACAGAT-3'；反向引物R：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'。PCR反应体系如下:2×TaqPCRmastermix12.5μL，正向F引物10.5μL，反向R引物0.5μL，菌液模板DNA1μL，ddH2O10.5μL，总体系25μL。PCR扩增条件为:94℃5min；94℃1min；51℃30s；72℃1min，35个循环；72℃10min。电泳采用琼脂糖凝胶电泳，核酸染料为EB，Maker为DL2000。最后将PCR纯化产物送上海生工生物工程有限公司进行测序。所得序列NCBIGeneBank核酸数据库中相关序列进行比对分析。用正向引物F和反向引物R进行16SrRNA进行PCR扩增，得到大约1.4kb的片段，如SEQIDNO.1所示。通过比对该序列与玫瑰黄链霉菌16SrRNA基因在相应区域核苷酸序列相似性为100％。将获得的菌NKZ-25916srRNA序列同GenBank中已有的20条不同种的新霉素属16srRNA序列进行比较，其中选择差异较大的组外序列为天蓝色链霉菌(StreptomycescoelicolorA3)。通过DNAMANversion6.0(LynnonBiosoft)对核苷酸和相应氨基酸序列进行分析对比，用Bioedit对全长核苷酸序列进行编辑整理。MEGA(version4.1)进行ClustalW多序列比对和系统进化分析；通过neighbour-joining的方法构建进化树，bootstrap设置为1000次重复。结果表明，获得的菌NKZ-259其系统发育分析与玫瑰黄链霉菌strainMen-myco-93-63处于同一分支，说明其亲缘关系较近，结合形态结构和生理生化特性，发明人将该菌株鉴定为玫瑰黄链霉菌(Streptomycesroseoflavus)(如图3所示)。实例5玫瑰黄链霉菌(StreptomycesroseoflavusstrainNKZ-259)的发酵过程培养基配方：麦芽糖10％，酵母粉4.0％，葡萄糖4.0％，其余为水。配方中的百分数均为质量百分数。发酵过程：(1)将玫瑰黄链霉菌NKZ-259用无菌牙签涂布接种到高氏1号培养基上，置于28℃培养7天；(2)用手术刀切1cm2的菌块接种到发酵培养基中，震荡发酵48h(28℃，170rpm)；(3)按照体积比为10％的接种量将第二步的种子液接种到发酵培养基中，震荡发酵96h(发酵温度为28℃，转速为220rpm)。实例6玫瑰黄链霉菌(StreptomycesroseoflavusstrainNKZ-259)促生效果测定(1)番茄促生试验方法：试验采用穴盘种植，于营养土中进行，营养土与蛭石按9:1的比例配置基质，将其置于穴盘中。每穴撒2-3粒番茄种子，用少量的营养土覆盖种子，浇灌适量的水，并用保鲜膜覆盖，待苗出土长出2片子叶时去掉保鲜膜。试验分为两组，试验组使用稀释100倍的NKZ-259发酵液灌根，对照组浇灌清水，每个处理20株苗，3次重复。于温室中25℃，相对湿度为60％的环境下培养，生长大约7天，番茄苗长出2片真叶时，开始灌浇菌液，之后每隔10天灌根一次，其他时间浇灌清水。在灌根3次后，也就是番茄苗生长到45天时，小心将番茄苗挖出，洗去根部泥土，测其生长指标：根长、株高、鲜重、干重。表2菌株NKZ-259发酵液浸种对番茄生长的促进作用由表2以及图5A、图5B和图5C，可以看出菌株NKZ-259发酵液灌根对番茄苗具有明显的促进生长的作用，发酵液灌根后的番茄苗与对照组相比生长迅速，叶片浓密，茎部粗壮，尤其是根系发达，根长增加显著，与对照组相比根长增加了39.23％，株高增加了5.62％，鲜重增加了11.70％，干重增加了31.82％。(2)小麦浸种试验首先分别用NKZ-259的发酵液和清水浸泡小麦种子24h，然后分别播种于玻璃培养皿中，培养皿底部铺两层滤纸，每皿放置15粒种子，重复3次。将发酵液稀释100倍，每天浇灌发酵液和清水，保证滤纸湿润，在温室25℃，相对湿度为60％的环境下培养，15天后，测量小麦的根长、株高、鲜重、干重。表3菌株NKZ-259发酵液浸种对小麦生长的促进作用由表3以及图6A和图6B可知，浸种试验表明菌株NKZ-259发酵液可以明显促进小麦的生长，发酵液浸种后的小麦苗比对照组根长增加32.50％，株高增加了23.79％，鲜重增加了46.93％，干重增加了37.03％。发酵液浸种后的小麦真叶比对照组出现的早，叶片大，叶柄粗，根系发达，生长更均一、旺盛。(3)辣椒促生试验方法：试验采用穴盘种植，于营养土中进行，营养土与蛭石按9:1的比例配置基质，将其置于穴盘中。每穴撒2-3粒辣椒种子，用少量的营养土覆盖种子，浇灌适量的水，并用保鲜膜覆盖，待苗出土长出2片子叶时去掉保鲜膜。试验分为两组，试验组使用稀释10倍的NKZ-259发酵液灌根，对照组浇灌清水，每个处理20株苗，3次重复。于温室中25℃，相对湿度为60％的环境下培养，辣椒苗长出2片真叶时，开始灌浇发酵液，之后每隔10天灌根一次，其它时间浇灌清水。在灌根3次后，也就是辣椒苗生长到约45天时，小心将辣椒苗挖出，洗去根部泥土，测其生长指标：根长、株高、鲜重、干重。表4菌株NKZ-259发酵液浸种对辣椒生长的促进作用由上表4以及图7A、图7B和图7C可知,菌株NKZ-259发酵液灌根对辣椒苗具有明显的促进生长的作用，发酵液灌根后的辣椒苗与对照组相比根系发达，生长迅速，叶片浓密，茎部粗壮，其株高比对照组增加了16.92％，根长增加了44.15％，鲜重增加了63.08％，干重增加了38.89％。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。<110>中国农业科学院植物保护研究所<120>一株玫瑰黄链霉菌及其应用<160>1<210>1<211>1413<212>DNA<213>人工序列<220><221>16srRNA基因<400>1tgcagtcgaacgatgaagcccttcggggtggattagtggcgaacgggtgagtaacacgtg60ggcaatctgcccttcactctgggacaagccctggaaacggggtctaataccggataacac120tctctctcgcatgggagagggttgaaagctccggcggtgaaggatgagcccgcggcctat180cagctagttggtgaggtagaagctcaccaaggcgacgacgggtagccggcctgagagggc240gaccggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaa300tattgcacaatgggcgaaagcctgatgcagcgacgccgcgtgagggatgacggccttcgg360gttgtaaacctctttcagcagggaagaagcgaaagtgacggtacctgcagaagaagcgcc420ggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggcgcaagcgttgtccggaattat480tgggcgtaaagagctcgtaggcggcttgtcacgtcggttgtgaaagcccggggcttaacc540ccgggtctgcagtcgatacgggcaggctagagttcggtaggggagatcggaattcctggt600gtagcggtgaaatgcgcagatatcaggaggaacaccggtggcgaaggcggatctctgggc660cgatactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagt720ccacgccgtaaacggtgggaactaggtgtgggcgacattccacgtcgtccgtgccgcagc780taacgcattaagttccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaaggaattg840acgggggcccgcacaagcggcggagcatgtggcttaattcgacgcaacgcgaagaacctt900accaaggcttgacatacaccggaaagcatcagagatggtgccccccttgtggtcggtgta960caggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacg1020agcgcaacccttgtcccgtgttgccagcaagccccttcgggggtgttggggactcacggg1080agaccgccggggtcaactcggaggaaggtggggacgacgtcaagtcatcatgccccttat1140gtcttgggctgcacacgtgctacaatggccggtacaatgagctgcgataccgcgaggtgg1200agcgaatctcaaaaagccggtctcagttcggattggggtctgcaactcgaccccatgaag1260tcggagtcgctagtaatcgcagatcagcattgctgcggtgaatacgttcccgggccttgt1320acacaccgcccgtcacgtcacgaaagtcggtaacacccgaagccggtggcccaacccctt1380gtgggagggagctgtcgaaggtgggactggcga1413当前第1页1 2 3