防龋转基因植物疫苗及其制备方法与流程

背景技术：

龋病(Dental caries)是人类最常见的口腔疾病之一，与同心血管疾病、癌症并称为人类三大疾病，严重威胁着人们的口腔健康。目前在我国龋病发生率有上升趋势，老年人群患龋率高达98.40％，龋均14.65颗。找到控制龋病的有效措施仍是当前非常紧迫的任务。但龋病又是一种非致死性疾病，在寻找控制龋病的有效免疫措施时，必须充分考虑治疗方案以及使用制剂的高效、安全、价廉物美，以及预防接种方法易于被人群接受。

变异链球菌(Streptococcus mutans)为革兰氏染色阳性的球菌，能够与牙面紧密粘附并定植于牙面，产生酸性代谢产物，引起牙齿脱矿，最终导致龋病发生。变异链球菌是导致人类龋病的一类主要致病菌。变异链球菌壁相关蛋白A(wall-associated protein A gene,wapA)、葡聚糖结合蛋白(glucan-bind proteins,GBPs)、致龋毒力因子的表面蛋白(surface protein antigen,PAc)和葡糖基转移酶(glucosyltranferaes,GTFs)是变异链球菌的重要抗原物质。这些抗原成分参与介导细菌的粘附，在免疫学方面有着极为重要的意义。其中，表面蛋白(PAc)和葡糖基转移酶(GTFs)是变异链球菌中最重要的致龋毒力因子。表面蛋白是变异链球菌的主要粘结素，介导牙面的非蔗糖依赖型粘附。研究认为，表面蛋白(PAc)结构中的A区是主要粘附功能区，可与糖蛋白结合，介导变异链球菌对牙面的初始附着。表面蛋白(PAc)结构中的A区富集T、B细胞表位，是研制防龋疫苗的主要靶点抗原。研究表明，当变异链球菌毒力因子PAc作为抗原免疫动物后，机体的体液免疫和黏膜免疫应答被激发，产生特异性的抗体，初步证明利用PAc免疫动物后，可有效抑制细菌在牙面的粘附，从而降低患龋率。葡糖基转移酶(GTFs)作为另一种主要的致龋毒力因子，可通过蔗糖合成葡聚糖，介导细菌在牙面的蔗糖依赖型粘附。GTFs包含两个免疫活性区，能使变异链球菌与牙面紧密结合，分别是葡聚糖结合区(glucan binding region,GLU)和催化功能区(catalytic region,CAT)。PAc和GTFs是变异链球菌致病的主要毒力因子，在其分子中存在着相应的粘附功能区以及具有免疫原性的T、B细胞抗原决定簇，能诱导产生特异性唾液sIgA抗体，sIgA抗体可以抑制这两种毒力因子的功能，阻止变异链球菌在牙面附着，从而抑制龋病的发生和发展。

IgG抗体也具有抑制龋病的发生和发展的重要作用。

霍乱毒素B亚单位(CTB)是一种较理想的免疫佐剂，它能与抗原呈递细胞(antigen presenting cells，APC)等有核细胞表面神经节苷脂GM1受体特异性结合，具有调节APC反应、T细胞反应和抗体产生的作用，能诱导机体产生强烈的系统和局部粘膜免疫应答，在疫苗的研究中已被广泛的使用。

免疫应答反应主要分为初次应答和再次应答。初次应答时，机体仅产生少量抗体且抗体生成缓慢，而再次应答时机体迅速发生免疫应答，产生大量的抗体。再次免疫应答是由记忆性B细胞(memory B cell,Bm)诱导。Bm是初次免疫应答后克隆消除保留下来的高亲和力细胞，当再次受同一抗原刺激，Bm快速分化成浆细胞，介导迅速的记忆性应答，产生高滴度的抗体，同时维持Bm库的更新。Bm在体液免疫中扮演十分重要的角色，对浆细胞的产生、抗体的生成、记忆持久的免疫保护起关键作用；预示诱导尽可能多的Bm形成是加强转基因植物口服疫苗黏膜免疫效果的有效策略。

无功能糖基转移酶样蛋白(DOCK8)是GTP-交换因子Rho-Rac家族成员之一，其核心功能区是DHR。在静息B细胞遭遇抗原时，DOCK8促进抗原信号存留，促使B细胞进入淋巴结的生发中心，并分化为长效Bm，维持长效免疫。B细胞还通过自身表达的DOCK8分子招募胞内的整合素ICAM-1向Th细胞和B细胞间的免疫突触区域聚集，促进Th细胞活化B细胞第二信号的传导，发挥生物活性作用。预示DOCK8可能是Bm形成及其在体内长期留存的关键。

近年来各种转基因技术的创立和改进，使基因的转移以及转基因植物的再生不再是转基因植物可食疫苗研究的限制因素；基因转入宿主后的高效表达及其遗传稳定性、表达蛋白的抗原性和免疫反应性、口服免疫机制、提高植物表达蛋白的利用率、利用安全筛选标记或删除选择标记的策略、培育安全的转基因植物等问题，是当前转基因植物口服疫苗研究的关键。

转基因植株中实现高效表达和维持稳定遗传主要与植物表达载体、转化方法、外植体以及外界环境因素有关。随着对转基因植物的深入研究发现，大量外源基因并没有得到预期表达，不同转基因个体中外源基因的表达也存在较大差异，这种基因表达差异不仅受到不同强度启动子的调控，而且转录水平的抑制和转录后mRNA积累的抑制也会造成不同程度地基因沉默。

目前，还没有相关文献报道将致龋毒力因子的表面蛋白(PAc)粘附相关肽段和葡糖基转移酶(GTFs)催化功能区基因，以及免疫佐剂CTB和靶向蛋白DOCK8核心功能区基因，番茄果实特异性启动子基因E8和双元穿梭载体pCAMBIA2301质粒用于制备重组质粒，同时利用转基因技术将所获得的重组质粒转化番茄，培育防龋转基因番茄，用于龋病防治的研究。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种新型的防龋DNA序列；进一步地，将该防龋DNA序列转化番茄，培育防龋转基因番茄，以获得防龋转基因植物疫苗，用于龋病防治的研究。

一方面，本发明提供了一种新型防龋DNA序列，该DNA序列包括变异链球菌UA159的致龋毒力因子的表面蛋白A区编码基因PacA和葡糖基转移酶(GTF)催化区编码基因cat，佐剂CTB的编码基因ctxB和靶向蛋白DOCK8核心功能区DHR编码基因，以及番茄果实特异性启动子基因E8。

本发明提供了上述防龋DNA序列的制备方法，包括以下步骤：1)、将上述E8、cat、pacA-ctxB和DOCK8/DHR基因片段来构建融合基因表达质粒E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR，2)、将该融合基因表达质粒E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR插入到pCAMBIA2301双元穿梭载体中，构建pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR重组质粒，3)、将该pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR重组质粒转化感受态细胞E.coli JM109；获得所述防龋DNA序列。

经鉴定及测序，所述防龋DNA序列如SEQ ID No1所示。

单纯的核苷酸序列进入人体后容易被核酸酶降解，较难进入细胞，导致DNA序列的防龋效果降低。

进一步地，本发明将上述防龋DNA序列转化番茄，并培育获得防龋转基因番茄，利用植物系统表达重组蛋白，因此，可作为一种防龋转基因植物疫苗。

再一方面，本发明提供了一种防龋转基因植物疫苗及其制备方法。

利用了上述防龋DNA序列中的番茄果实特异性启动子E8基因能够启动融合蛋白的表达。在一种实施方案中，提供了将上述防龋DNA序列转化番茄，转化方法包括步骤：1)、将上述DNA序列经添加植物信号肽、内质网靶向序列和柔性肽基因修饰后，插入携带番茄果实特异性启动子的植物表达载体中，构建稳定高效的转基因植物表达质粒pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR并转化番茄，2)、将选择性标记基因Km和GUS去除，筛选出不带标记基因、遗传稳定、表达高效的转基因番茄植株。

在一种优选的实施方式中，上述防龋DNA序列转化番茄，转化方法包括步骤：

1)、将所述包含上述防龋DNA序列的重组质粒添加植物信号肽、内质网靶向序列和柔性肽基因进行修饰；

2)、插入携带番茄果实特异性启动子E8的植物表达载体中，构建稳定高效的转基因植物表达质粒pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR；

3)、去除步骤2)所获得的转基因植物表达质粒pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR中真核生物中的标记抗性基因Km和GUS，保留原核生物中的Km基因作为筛选；

4)、将步骤3)得到的表达质粒pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR转化到农杆菌感受态细胞EHA105菌株中；

5)、将步骤4)得到的成功转化的农杆菌采用叶片注射法充分侵染番茄子叶细胞，将大量T-DNA转入番茄子叶细胞内，将农杆菌侵染过的番茄子叶细胞接种到MS培养基中，经过培养后得到转基因番茄植株；

6)、提取培养步骤5)得到的番茄子叶细胞的总RNA；

7)、将步骤6)得到的RNA逆转录为cDNA；

8)、将步骤7)得到的cDNA进行PCR扩增检测；

9)、将步骤6)得到的cDNA进行GUS检测，确认防龋DNA序列的转化情况良好。

检测表明，上述防龋DNA序列转化番茄情况良好，获得转基因番茄植株中表达了大量具有防龋效果的植物蛋白，可用为一种可食用的口服的防龋转基因疫苗。

在一种优选的实施方案中，上述防龋转基因植物疫苗的制备方法，包括步骤：

(1)E8、cat、pacA-ctxB和DOCK8/DHR基因片段的克隆

变异链球菌UA159基因组中富含T、B淋巴细胞表位的致龋毒力因子的表面蛋白A区编码基因PacA和葡糖基转移酶(GTF)催化区编码基因cat，佐剂CTB的编码基因ctxB和靶向蛋白DOCK8核心功能区DHR编码基因，以及番茄果实特异性启动子E8的克隆；克隆所需的引物是根据GeneBank中报道的基因序列(GeneBank accession number M17361、AE014133、AB615200、NM001037793)设计并合成，如表1所示：

表1：cat、PacA-ctxB、DOCK8/DHRAPB和E8基因的引物序列

加框为保护性碱基，下划线为限制性内切酶酶切位点，加粗为柔性肽。

(2)pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR重组质粒的构建：

将步骤(1)中获得的E8、cat、pacA-ctxB和DOCK8/DHR基因片段来构建融合基因表达质粒E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR插入到pCAMBIA2301双元穿梭载体中，构建pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR重组质粒，将上述重组质粒转化感受态细胞E.coli JM109，重组质粒酶切鉴定正确后送测序，获得防龋DNA序列如SEQ ID No1所示。

(3)将防龋DNA序列转化番茄制备防龋转基因植物疫苗

将(2)获得的DNA序列，利用番茄果实特异性启动子E8启动融合蛋白的表达，经添加植物信号肽、内质网靶向序列和柔性肽等基因修饰后，插入携带番茄果实特异性启动子的植物表达载体中，构建稳定高效的转基因植物表达质粒pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR并转化番茄，将选择性标记基因Km和GUS去除，筛选出不带标记基因、遗传稳定、表达高效的转基因植株，从而获得一种新型的防龋转基因植物疫苗。

所述的防龋转基因植物疫苗的制备方法具体如下：

①、去除所获得的防龋转基因植物疫苗pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR中真核生物中的标记抗性基因Km和GUS，保留原核生物中的Km基因作为筛选；

②、将成功去除标记基因Km和GUS的植物载体pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR转化到农杆菌感受态细胞EHA105菌株中；

③、运用农杆菌介导的叶片注射法，用注射器使成功转化的农杆菌充分侵染番茄子叶细胞，将大量的T-DNA转入植物细胞内；

④、将农杆菌侵染过的番茄子叶细胞接种到MS培养基中，经过培养后得到转基因番茄植株。

经GUS检测，确认防龋DNA序列在番茄中的转化情况良好。

实验证实该防龋DNA序列转化番茄后，培育得到的转基因番茄植株，包括该转化番茄植株的果实、茎、叶中，表达了大量的具有防龋效果的植物蛋白，可作为一种防龋转基因植物疫苗；该防龋转基因植物疫苗可刺激机体免疫应答，产生抗体，尤其是能刺激大鼠产生特异性SIgA和IgG抗体，阻断变异链球菌的粘附和菌斑的形成，能够抑制大鼠龋齿的发生，从而预防龋病，尤其是非蔗糖依赖型龋病。

第三方面，本发明的转基因番茄植株中表达了防龋植物蛋白，防龋植物蛋白作为一种可食用的口服防龋转基因疫苗。

本发明还提供了包含本发明所述的防龋转基因植物疫苗的防龋食品以及包含本发明转基因番茄果实的防龋食品。

本发明的优势在于，首次构建包括一种新型的DNA序列，利用转基因技术成功将防龋DNA序列转化番茄，获得了稳定表达的转基因番茄植株。实验证明该转基因番茄植株表达的外源蛋白具有免疫原性；说明该转基因番茄可有效的诱导粘膜免疫反应，能够作为一种新型的可食用的防龋转基因植物疫苗。采用本发明的防龋DNA序列转化得到的防龋转基因番茄安全性高，对环境无明显影响，能表达天然抗原，免疫应答持久，能有效防龋。本发明方法简单，生产成本低廉，易于推广。

附图说明

图1是葡糖基转移酶(GTF)催化区编码基因cat电泳鉴定图；其中，1为cat基因PCR产物；M为BM5000DNA Marker。

图2是致龋毒力因子的表面蛋白A区编码基因PacA和佐剂CTB的编码基因ctxB融合基因PacA-ctxB的电泳鉴定图；其中，1为阴性对照；2为PacA-ctxB基因PCR产物；M为BM2000DNA Marker。

图3是靶向蛋白DOCK8核心功能区DHR编码基因DOCK8/DHR的电泳鉴定图；其中：1为DOCK8/DHR基因PCR产物；M为BM2000DNA Marker。

图4是pCAMBIA-cat酶切电泳鉴定图；其中，1为T-cat单酶切产物；M为BM5000DNA Marker。

图5是pCAMBIA-PacA-ctxB的酶切电泳鉴定图；其中，1为T-PacA-ctxB双酶切产物；M为BM5000DNA Marker。

图6是pCAMBIA-DOCK8/DHR的酶切电泳鉴定图；其中，1为T-DOCK8/DHR三酶切产物；M为BM5000DNA Marker。

图7是重组质粒pCAMBIA-cat-PacA-ctxB电泳鉴定图；其中，1为pCAMBIA-cat-PacA-ctxB PCR产物；M为BM5000DNA Marker。

图8是重组质粒pCAMBIA-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR电泳鉴定图；其中，1为cat扩增产物；2为DOCK8/DHR扩增产物；3为PacA-ctxB扩增产物；M为1kb Ladder DNA Marker。

图9是重组质粒pCAMBIA-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR的酶切电泳鉴定图；其中，1为pCAMBIA-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR酶切产物；2为pCAMBIA-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR重组质粒；M为1kb Ladder DNA Marker。

图10是番茄果实特异性启动子E8序列基因电泳鉴定图；其中：1为E8PCR产物；M为BM5000DNA Marker。

图11是重组质粒pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR结构示意图。

图12是再生番茄苗gus染色结果。

图13显示了SD大鼠采集血液的过程。

图14显示了SD大鼠采集唾液的过程。

图15显示了各组大鼠体重的变化。

图16显示了各组大鼠唾液中的lgA抗体水平OD₄₅₀值变化。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细阐述。但下列实施例不应看作对本发明范围的限制。

本发明用以构建真核表达载体的基本骨架为双元穿梭载体pCAMBIA2301(购自上海迈其生物科技有限公司，序列和物理图谱见该公司的产品目录)；构建过程以及制备过程中，质粒扩增所用的宿主菌为E.coli JM109感受态细胞(购自宝生物工程大连有限公司)；插入的外源基因为：由变异链球菌UA159基因组中提取富含T、B淋巴细胞表位的致龋毒力因子的表面蛋白A区编码基因PacA和葡糖基转移酶(GTF)催化区编码基因cat，佐剂CTB的编码基因ctxB和靶向蛋白DOCK8核心功能区DHR编码基因构建的融合基因表达质粒cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR，以及番茄果实特异性启动子E8序列。

缩写

在本文的实施例中，以下的缩写具有如下的含义：min代表分钟、h代表小时、w代表星期(周)。

实施例1、重组质粒pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR的构建

步骤一、变异链球菌的培养

将冻存的变异链球菌UA159菌株(贵州省高等学校口腔疾病研究特色重点实验室保存)划线培养于BHI平板培养基(商品化平板培养基，购自北京索莱宝生物科技有限公司)上，培养条件为37℃厌氧箱(80％N₂，10％H₂，10％CO₂)，避光复苏4-7天，观察到黑色菌落生长至1mm左右。挑取平板上长出的单菌落接种至LB培养基(购自广东环凯微生物科技有限公司)中，置于厌氧培养箱中培养1-2天，观察到液体变浑浊，有少量菌体沉淀。收集富含变异链球菌UA159的菌液用于后续试验。

步骤二、变异链球菌UA159菌株基因组的获得

使用细菌基因组提取试剂盒(Bacterial DNA Extraction Kit(Solution type)，Biotekecorporation)提取UA159基因组，步骤简述如下：

1、取2ml上述步骤一收集的富含变异链球菌UA159的菌液，10000rpm，离心30s。弃上清，收集菌体，尽可能的吸净上清；

2、加入200μl缓冲液RB重悬洗涤细胞，10000rpm，离心30s，弃上清后再次将菌体重悬于200μl缓冲液RB中；

3、加入50～100μl lysozyme(10mg/ml in 10mMTris-HCl，PH8.0)，颠倒混匀，37℃温育30—60min。10000rpm离心2min，弃上清后将菌体再次重悬于200μl缓冲液RB中；

4、加入200μl结合液CB，立刻剧烈颠倒充分混匀，再加入20μl蛋白酶K(20mg/ml)溶液，充分混匀，70℃放置10min。

5、冷却后加入100μl异丙醇，剧烈颠倒充分混匀；

6、将上一步所得溶液及可能出现的絮状沉淀物移至吸附柱AC中(吸附柱套入收集管中)，10000rpm离心30s，弃废液；

7、加入500μl抑制物去除液IR，12000rpm离心30min，弃废液；

8、加入700μl漂洗液WB，12000rpm离心30s，弃废液；

9、加入500μl漂洗液WB，12000rpm离心30s，弃废液；

10、吸附柱AC放回收集管中，13000rpm离心2min；

11、取出吸附柱AC，放入干净离心管中，在吸附膜中部加100μl洗脱缓冲液EB(洗脱液65-70℃预热)，室温放置3-5min，12000离心1min，获得清液，得到变异链球菌UA159菌株基因组DNA样品溶液。

步骤三、融合基因表达质粒E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR的构建

致龋毒力因子的表面蛋白A区编码基因PacA和葡糖基转移酶(GTF)催化区编码基因cat，佐剂CTB的编码基因ctxB和靶向蛋白DOCK8核心功能区DHR编码基因的克隆以及载体的构建

1、以变异链球菌UA159为模板，以双元穿梭载体pCAMBIA2301为骨架，体外扩增目的基因cat、PacA-ctxB和DOCK8/DHR。根据致龋毒力因子的表面蛋白A区编码基因PacA和葡糖基转移酶(GTF)催化区编码基因cat，佐剂CTB的编码基因ctxB和靶向蛋白DOCK8核心功能区DHR编码基因序列设计并合成如表1所示的引物，并按下述PCR体系及扩增条件克隆cat、PacA-ctxB和DOCK8/DHR基因。

PCR扩增cat、PacA-ctxB、DOCK8/DHR的反应体系如表2所示：

表2、cat、PacA-ctxB、DOCK8/DHR PCR反应体系

cat PCR反应扩增条件为：

PacA-ctxB PCR反应扩增条件为：

DOCK8/DHR PCR反应扩增条件为：

循环结束后，产物经电泳(如图1-图3所示)鉴定大小正确后于12℃保存，长期保存需移至-20℃或-80℃条件。

2、获得的目的基因片段分别进行凝胶电泳回收：cat、PacA-ctxB和DOCK8/DHR目的基因的PCR产物以1％琼脂糖凝胶电泳验证是否获得预期大小的基因。

3、将琼脂糖凝胶回收的试剂盒回收的cat、PacA-ctxB和DOCK8/DHR目的基因片段进行XhoI和PmlI双酶切，去除保护性碱基，酶切体系如表3所示，37℃水浴12-16h。

表3：XhoI和PmlI双酶切体系

4、按照AxyPrepPCR纯化试剂盒的说明方法回收纯化产物，步骤如下：

a、加入PCR产物三倍体积Buffer PCR-A混匀，过柱，12000rpm，1min；

b、柱内加入700μl Buffer W2 10000rpm，1min，重复1次；

c、空离1min，56℃烘箱静置至乙醇挥发，加入ddH₂O(56℃预热)，静置5min，12000rpm，1min，得到cat、PacA-ctxB和DOCK8/DHR目的基因，-20℃备用。

步骤四、cat、PacA-ctxB和DOCK8/DHR目的基因与pCAMBIA载体连接

将步骤三纯化得到的cat、PacA-ctxB、DOCK8/DHR目的基因连接至pCAMBIA载体上，其连接体系如表4所示：

表4：目的基因与载体连接体系

上述连接混合液室温过夜连接，得到连接好的pCAMBIA-cat、pCAMBIA-PacA-ctxB和pCAMBIA-DOCK8/DHR重组质粒。

步骤五、重组质粒转化感受态细胞

将步骤四连接好的重组质粒pCAMBIA-cat、pCAMBIA-PacA-ctxB和pCAMBIA-DOCK8/DHR转入感受态大肠杆菌E.coli JM109细胞中，步骤如下：

1、取-80℃中取出感受态细胞2支，置于冰浴中；

2、向感受态细胞中各加入连接产物10μl，轻轻旋转混匀内容物，冰浴中静置30min；

3、将离心管置于42℃水浴90s，快速转移至冰浴冷却2min，尽量静置；

4、超净台内向离心管中加入500μl无菌、不含抗生素的LB培养基，混匀置于37℃恒温摇床45min，复苏菌液；

5、菌液3000rpm，10min收集菌体，加入50μl重新混匀菌体；

6、超净台内将菌液接种至含有Amp抗性的LB培养基平板中，37℃培养过夜，得到pCAMBIA-cat、pCAMBIA-PacA-ctxB和pCAMBIA-DOCK8/DHR重组质粒的感受态E.coli JM109细胞菌液。

7、挑选单菌落，置于加入500μl抗性液体培养基的1.5ml离心管中，37℃恒温摇床4-6h，观察长势，挑出扩增的菌体进行菌液PCR。

步骤六、挑取单菌落，菌液PCR、酶切鉴定

挑选出步骤五扩增的菌体进行菌液PCR，筛选重组子，菌液PCR反应体系和反应扩增条件同步骤三。

筛选重组子pCAMBIA-cat质粒的酶切体系如表5所示：

表5 pCAMBIA-cat质粒的酶切体系

混匀后置于37℃酶切6h。

筛选重组子pCAMBIA-PacA-ctxB质粒的酶切体系如表6所示：

表6 pCAMBIA-PacA-ctxB质粒的酶切体系

混匀后置于37℃酶切6h。

筛选重组子pCAMBIA-DOCK8/DHR质粒的酶切体系如表7所示：

表7 pCAMBIA-DOCK8/DHR质粒的酶切体系

混匀后置于37℃酶切6h。

酶切产物于1％琼脂糖凝胶电泳检测(如图4-图6所示)，以确定重组产物pCAMBIA-cat、pCAMBIA-PacA-ctxB和pCAMBIA-DOCK8/DHR是否正确，在全自动凝胶成像分析仪上观察电泳结果并保存图像。

步骤七、重组质粒pCAMBIA-cat、pCAMBIA-PacA-ctxB和pCAMBIA-DOCK8/DHR采用凝胶回收DNA

按照AxyPrepPCR纯化试剂盒的说明方法回收纯化产物，步骤如下：

a、加入PCR产物三倍体积Buffer PCR-A混匀，过柱，12000rpm，1min；

b、柱内加入700μl Buffer W210000rpm，1min，重复1次；

c、空离1min，56℃烘箱静置至乙醇挥发，加入ddH₂O(56℃预热)，静置5min，12000rpm，1min，得到pCAMBIA-cat、pCAMBIA-PacA-ctxB和pCAMBIA-DOCK8/DHR目的基因；

d、在紫外分光光度计分别测其在OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值及DNA浓度，-20℃保存。

步骤八、重组质粒pCAMBIA-cat-PacA-ctxB的构建和鉴定

1、利用DNA的黏性末端的特性，将pCAMBIA-cat和pCAMBIA-PacA-ctxB的凝胶回收DNA片段体外连接，其连接体系如表8所示：

表8 cat和PacA-ctxB的连接体系

上述连接混合液16℃过夜连接，得到连接好的cat-PacA-ctxB的重组质粒。

2、对载体pCAMBIA进行XhoI和EcoRI双酶切，酶切体系如表9所示，37℃水浴6h，然后加入去磷酸化酶FastAP3μl，混匀后37℃，1h，75℃金属浴10min以灭活去磷酸化酶。

表9：XhoI和EcoRI双酶切体系

3、按照AxyPrepPCR纯化试剂盒的说明方法回收纯化产物，步骤如下：

a、加入PCR产物三倍体积Buffer PCR-A混匀，过柱，12000rpm，1min；

b、柱内加入700μl Buffer W2 10000rpm，1min，重复1次；

c、空离1min，56℃烘箱静置至乙醇挥发，加入ddH₂O(56℃预热)，静置5min，12000rpm，1min，得到pCAMBIA-cat和pCAMBIA-PacA-ctxB目的基因，-20℃保存。

4、重组质粒cat-PacA-ctxB与载体pCAMBIA的连接反应，其连接体系如表10所示：

表10 cat-PacA-ctxB和载体pCAMBIA的连接体系

上述连接混合液16℃过夜反应12-16h，得到连接好的pCAMBIA-cat-PacA-ctxB的重组质粒。

5、重组质粒转化感受态细胞

将连接好的重组质粒pCAMBIA-cat-PacA-ctxB转入感受态JM109细胞中，转化步骤同步骤五，得到pCAMBIA-cat-PacA-ctxB重组质粒的感受态JM109细胞菌液。

6、将连接好的重组质粒pCAMBIA-cat-PacA-ctxB进行筛选、PCR扩增与酶切鉴定。pCAMBIA-cat-PacA-ctxB重组质粒PCR扩增反应体系同步骤三，PCR反应扩增条件为：

循环结束后，产物经电泳(如图7所示)鉴定大小正确后，所筛得阳性克隆于12℃保存，长期保存需移至-20℃或-80℃条件。pCAMBIA-cat-PacA-ctxB重组质粒酶切鉴定同步骤六所示。

步骤九、重组质粒pCAMBIA-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR的构建和鉴定

1、cat-PacA-ctxB目的基因片段的获取

使用KpnI和XhoI对重组质粒pCAMBIA-cat-PacA-ctxB进行双酶切，酶切体系如表11所示：

表11 XhoI和EcoRI双酶切体系

混匀后置于37℃酶切6h。胶回收的步骤同步骤八，获得基因片段cat-PacA-ctxB，在紫外分光光度计分别测其在OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值及DNA浓度，-20℃保存。

2、对载体pCAMBIA进行KpnI和SalI双酶切，酶切体系如表12所示，混匀后置于37℃酶切6h。然后加入去磷酸化酶FastAP3μl，混匀后37℃反应1h后75℃金属浴10min以灭活去磷酸化酶，经PCR纯化试剂盒纯化(具体过程同步骤八)，-20℃保存。

表12：KpnI和SalI双酶切体系

3、载体pCAMBIA与cat-PacA-ctxB和DOCK8/DHR的连接反应，其连接体系如表13所示：

表13 载体pCAMBIA与cat-PacA-ctxB和DOCK8/DHR的连接体系

上述连接混合液16℃过夜反应12-16h，得到连接好的pCAMBIA-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR的重组质粒。

4、重组质粒转化感受态细胞

将连接好的重组质粒pCAMBIA-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR转入感受态JM109细胞中，转化步骤同步骤五，得到pCAMBIA-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR重组质粒的感受态JM109细胞菌液。

5、对pCAMBIA-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR重组质粒进行PCR鉴定

由于融合基因分子量大，用PCR直接扩增较难，因此选择分别用cat、PacA-ctxB、DOCK8/DHR的引物PCR扩增重组子，体系及循环条件同步骤三，以确定目的基因插入pCAMBIA载体中。

PCR循环结束后，产物经电泳(如图8所示)鉴定大小正确后，所筛得阳性克隆于12℃保存，长期保存需移至-20℃或-80℃条件

6、重组质粒pCAMBIA-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR的酶切鉴定

重组质粒pCAMBIA-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR的酶切鉴定同步骤六，其酶切体系如表14所示：

表14 重组质粒pCAMBIA-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR酶切体系

酶切产物于1％琼脂糖凝胶电泳检测(如图9所示)，以确定是否正确重组pCAMBIA-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR，在全自动凝胶成像分析仪上观察电泳结果并保存图像。

步骤十、重组质粒pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR的构建和鉴定

一、目的基因E8片段的获取

1、番茄果实特异性启动子E8启动融合蛋白基因片段的获取

①.以T-E8为模板，根据番茄果实特异性启动子E8启动融合蛋白基因序列并设计如表1所示引物，并按下述PCR体系及扩增条件体外扩增目的基因E8。

PCR扩增目的基因E8的反应体系如表15所示：

表15 PCR反应体系

E8PCR反应扩增条件为：

循环结束后，产物经电泳(如图10所示)鉴定大小正确后于12℃保存，长期保存需移至-20℃或-80℃条件。

②.使用琼脂糖凝胶回收试剂盒胶回收E8片段，紫外分光光度计测定并计算DNA的浓度。

③.使用HindⅢ和SalⅠ对E8回收片段进行酶切，切去保护碱基，酶切体系见表16，混匀后置于37℃酶切6h。然后加入去磷酸化酶FastAP3μl，混匀后37℃反应1h后75℃金属浴10min以灭活去磷酸化酶，经PCR纯化试剂盒纯化(具体过程同步骤八)，-20℃保存。

表16 HindⅢ、SalⅠ双酶切体系

2、使用HindⅢ和SalⅠ对载体质粒pCAMBIA进行双酶切，酶切体系参照表16，37℃酶切6-8h；胶回收切出的11.6kb线性载体，测定回收产物浓度。

二、E8目的基因与载体质粒pCAMBIA的连接

将上述纯化得到的E8目的基因连接至pCAMBIA载体上，其连接体系同步骤四表4所示，得到连接好的pCAMBIA-E8重组质粒。

三、重组质粒pCAMBIA-E8转化感受态细胞

将上述连接好的重组质粒pCAMBIA-E8转入感受态JM109细胞中，具体方法同步骤五。

四、挑选出上述菌体进行菌液PCR、酶切鉴定，筛选重组子。菌液PCR反应体系和反应扩增条件同步骤三。

筛选重组子pCAMBIA-E8质粒的单酶切体系如表17所示，混匀后置于37℃酶切6h。然后加入去磷酸化酶FastAP3μl，混匀后37℃反应1h后75℃金属浴10min以灭活去磷酸化酶，经PCR纯化试剂盒纯化(具体过程同步骤八)，得到pCAMBIA-E8质粒，-20℃保存。

表17 pCAMBIA-E8质粒XhoⅠ酶切体系

五、目的基因cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR片段的获取

使用XhoⅠ和SalⅠ对步骤九获取的重组质粒pCAMBIA-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR进行双酶切，酶切体系如表18所示，37℃水浴8h，胶回收切出的4.6kb片段cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR，测定回收产物浓度。

表18 pCAMBIA-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR的XhoⅠ和SalⅠ双酶切体系

六、目的基因cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR片段与重组质粒pCAMBIA-E8的连接

将上述纯化得到cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR目的基因连接至重组质粒pCAMBIA-E8载体上，其连接体系同步骤四表4所示，得到连接好的pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR重组质粒。

七、重组质粒pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR转入感受态细胞

将上述连接好的重组质粒pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR转入感受态JM109细胞中，具体方法同步骤五。

八、挑选出上述菌体进行菌液PCR、酶切鉴定，筛选重组子。菌液PCR反应体系和反应扩增条件同步骤三。

重组质粒pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR的酶切鉴定同步骤六，其酶切体系如表18所示，酶切产物于1％琼脂糖凝胶电泳检测，以确定是否正确重组pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR，在全自动凝胶成像分析仪上观察电泳结果并保存图像。

将重组质粒pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR送公司测序。

根据测序结果及载体序列，绘制DNA序列图谱(如图11所示)及全序列如SEQ ID:1所示。

SEQ ID No1所示的序列中，6745-6850位的GGTCAC；10302-1037位的TCTAGA；12622-12627位的GTCGAG分别为Xho I、Xba I和Sal I的酶切位点。

实施例2、防龋转基因番茄的培育

为提高本发明防龋转基因植物疫苗的免疫能力，本发明通过农杆菌介导，将实施例1获得的防龋转基因植物疫苗采用注射法对蕃茄子叶细胞进行浸染，培育得到稳定表达的转化番茄植株。

该防龋转基因植物疫苗的具体培育方法如下所述：

步骤一、无菌苗的培养

1、将挑选好的番茄种子放置于干净的离心管中并加入ddH₂O浸泡番茄种子，将离心管放入50-55℃水浴中30min；

2、用一次性滴管移出离心管中的液体，加入75％酒精浸泡消毒30s，无菌ddH₂O冲洗一次；

3、用20％次氯酸钠浸泡消毒15min，高压灭菌蒸馏水反复冲洗3-5次；

4、将消毒后的种子放置于灭菌纸上吸干种子表面多余的水分；

5、用无菌金属接种铲将番茄种子均匀接种于装有MS固体培养基(购自于北京康倍斯)的锥形瓶中，密封培养(培养条件：暗培养、25℃、3-5d)；

6、待约60％的种子萌发出胚根后转移至光照下培养(培养条件：湿度：40-50％，温度：25±3℃，光照：16h/d，黑暗：8h/d)；

步骤二、重组质粒pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR转化农杆菌EHA105

将重组质粒转入感受态细胞农杆菌EHA105中，步骤如下：

1、取-80℃中取出感受态细胞2支，置于冰浴中

2、超净台内向感受态细胞中各加入实施例1获得的重组质粒pCAMBIA-E8-cat-PacA-ctxB-DOCK8/DHR 10μl，轻轻旋转混匀内容物，依次放于冰上静置15min、-80℃5min、37℃水浴5min和冰上放置5min；

3、超净台内加入无抗生素的YEB液体培养基(购自于青岛拓普生物工程有限公司)，28℃震荡培养2-3h；

4、4℃离心6000rpm，1min，超净台内弃部分上清，预留部分上清轻轻吹打重悬菌块混匀；

5、将混匀的菌液涂布于含卡那霉素的YEB固体培养基的平板上，倒置28℃培养1-2d；

6、待YEB平板上菌落直径约1.5-2mm时，超净台内用无菌牙签挑取单菌落于装有卡那霉素的YEB液体培养基中，28℃震荡培养24h；

7、对E8、cat-PacA-ctxB和DOCK8/DHR的片段进行PCR鉴定。

步骤三、农杆菌转化液的制备

1、将讲述步骤二鉴定后的阳性克隆菌液转接到含卡那霉素和利福平的YEB液体培养基中，28℃震荡培养12h；

2、用含MS液体培养基的悬浮液和含乙酰丁香酮的浸染液4℃悬浮离心10000rpm，1min，收集菌体，所得到的菌体即为转化液；

3、调节OD₆₀₀分别为0.2、0.5和0.7。

步骤四、番茄子叶注射及共培养

1、挑选合适的番茄子叶；

2、用无菌注射器在番茄子叶背面叶脉分支处注射OD₆₀₀分别为0.2、0.5和0.7的转化液；

3、将注射后的番茄子叶放于MS固体培养基中共培养(湿度：40-50％，温度25±3℃，光照：16h/d，黑暗：8h/d)。

步骤五、总RNA的提取

1、将上述步骤四共培养的番茄子叶放于RNAiso Plus液(购自于大连TaKaRa公司)中，-80℃保存24h；

2、取出后的番茄子叶在高通量组织研磨器中研磨，直至番茄子叶组织完全裂解；

3、室温静置5min，4℃离心12000rpm，5min，再静置5min；

4、取上清液至干净的去酶EP管中，加入氯仿，震荡混匀，室温静置5min，4℃离心12000rpm，15min；

5、取上清液至干净的去酶EP管中，加入异丙醇，缓慢颠倒混匀，室温静置10min，4℃离心12000rpm，10min；

6、弃上清，加入无水乙醇与0.1％焦碳酸二乙酯水配成的75％酒精，4℃离心12000rpm，5min；

7、弃上清，将EP管倒置于滤纸上，于空气中干燥2-3min；

8、加入高压灭菌的0.1％焦碳酸二乙酯水于空气干燥过的EP管中，静置30-60min。

紫外分光光度计测定RNA浓度，并记录结果。

步骤六、RNA逆转录cDNA

运用逆转录试剂盒(购自于大连TaKaRa公司，使用方法参照说明书)，将上述步骤五获得的RNA逆转录为cDNA，RNA加入量(μl)计算公式为：500ng/测值。逆转录体系如表19所示：

表19 逆转录体系

注：RNA加入量不应大于所计算的体积

逆转录反应条件：37℃15min，85℃5s，4℃∞。所得逆转录产物-20℃保存。

步骤七、目的基因的PCR扩增检测

将上述步骤六逆转录得到的cDNA中目的基因的进行PCR扩增检测，其扩增检测同实施例1。

步骤八、GUS检测

取2μl步骤六获得的cDNA作为模板，进行GUS片段的PCR鉴定。GUS基因片段鉴定引物序列见表20，反应体系和条件同前。

表20 gus基因片段鉴定引物序列

参照Jefferson等的方法，将待检测番茄植株的叶片、茎段及根须放入配置好的GUS染液中，液体需浸没植物。设立阴性和阳性对照，在37℃水浴染色4h，观察染色情况，检测结果如图12所示。图12显示了再生苗GUS染色结果，阳性对照及再生苗的根、茎、叶都有暗蓝色物质生成。本实验在转基因番茄苗的叶、茎和根中都检测到了GUS基因的存在，说明其他外源基因已转入番茄植株。

实施例3、转基因番茄防龋疫苗免疫SD大鼠的实验研究

1、细菌培养

将保存菌种S.mutans Ingbritt接种于MSB琼脂培养基，95％N₂，5％CO₂，37℃培养48小时。取单菌落干BHI培养基中，95％N2，5％CO₂，37℃培养48小时。调整细菌浓度为1×10⁹CFU/mL，备用。

2、龋齿模型的制备

18天龄SD大鼠18只，雌鼠，断乳后即给于致龋饲料2000#(Navia 1997)(表23)。20天时给予含氯霉素、氨苄青霉素及羧苄青霉素(用量为1克/公斤饲料)的致龋饲料，连续喂养3天。然后用无菌棉签涂拭幼鼠口腔并接种于BHI和MSB培养基中，95％N₂，5％CO₂，37℃培养48小时以观察幼鼠口腔中抗生素灭菌情况。24--26天于牙面上连续接种细菌浓度为1×10⁹CFU/ml S.mutans Ingbritt，每天接种3次，间隔30分钟，每次200μl变形链球菌菌液。接种后以棉拭子采集口腔及磨牙牙合面的细菌标本，检测口腔变形链球菌感染情况。

表21 2000#Keyes致龋饲料构成成分

Table 21 Forage prescription 2000^#of dental caries

3、动物选择和分组

根据课题组前期的实验结果采用大鼠最大胃容量作为灌胃的最大剂量，将18d SD大鼠随机分3大组：A组为实验组1mL/100g剂量喂食表达目的蛋白的转基因番茄汁，5只动物。阴性对照组：以1mL/100g剂量喂食非转基因番茄汁，5只动物。阳性对照组：喂食变异链球菌UA159灭活全菌疫苗(0.4m1/10g)，5只动物。

4、免疫方式及样本采集

4.1免疫时间

共免疫4次，每周免疫一次，连续免疫4周。相同条件下，大鼠单笼饲养，免疫前禁食、禁水12小时，并在免疫前1天及免疫后1、2、3、4、5周采集血液、唾液样本。

4.2血液样本

采用眶后静脉丛采血法收集静脉血约200-400μl血液样本，4℃过夜。次日，用一无菌木制棒将血块轻轻挑起，使之由采血管侧壁脱落，4℃，4000rpm×10min，收集血清，-80℃保存。血液采集见图13。

4.3唾液样本

2％硝酸毛果芸香碱(0.1g/mL)按照0.6mg/100g的剂量对动物进行腹腔注射，大约3分钟后开始收集唾液约300μl-500μl，4℃,12000rpm×10min，收集上清，弃去唾液中杂质后放入-80℃冰箱保存备用。唾液采集见图14。

5、样本检测

5.1交叉连续稀释分析法确定抗原包被的最佳浓度、酶标抗体的最佳工作浓度及待测样品最佳稀释浓度

通过交叉连续稀释分析法来确定抗原包被的最佳浓度、标本最佳稀释浓度以及酶标抗体的最佳工作浓度：PacA唾液最佳包被浓度为5μg/mL；酶标抗体最佳工作浓度过氧化酶标记羊抗大鼠IgA(1:4000)。PacA血清最佳包被浓度为5μg/mL；酶标抗体最佳工作浓度过过氧化酶标记羊抗大鼠IgG(1:10000)；唾液最佳稀释浓度1:6，血清最佳稀释浓度1：40。

SD大鼠的免疫实验结果：

1、体重变化见表22，表23，图15

表22 随时间变化各实验组大鼠体重(n＝6)结果

从表22，图15，大鼠体重整体呈逐渐上升趋势，体重在相同时间点阳性对照组、实验组及阴性对照组比较无统计学差异(P>0.05)。

2、唾液中SIgA型抗体水平的观察见表23，图16。

表23 随时间变化各实验组大鼠唾液中SIgA型抗体(OD₄₅₀，n＝6)值结果

从表23，图16可知，实验组与阳性对照组都在初始免疫后的1周SIgA型抗体水平开始有上升趋势，3-5周上升比较迅速。免疫前各组间差异无统计学意义(P>0.05)；免疫后2周至6周阳性对照组、实验组与阴性对照组之间相同时间点比较差异有统计学意义(P<0.05)；阳性对照组与实验组比较无统计学差异(P>0.05)。

3、血液中IgG型抗体水平的观察

在血清中检测到特异性IgG抗体，且与阴性对照组比较，具有统计学差异。

表达目的蛋白的转基因番茄经口服途径免疫SD大鼠后可诱导其产生特异性SIgA和IgG抗体，由此可得出：该转基因番茄防龋疫苗可诱导动物产生免疫应答，具有较好的免疫原性，能够抑制SD大鼠龋齿的发生。

SEQUENCE LISTING

<110> 遵义医学院

<120> 防龋转基因植物疫苗及其制备方法

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 12627

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tttctccata ataatgtgtg agtagttccc agataaggga attagggttc ctatagggtt 60

tcgctcatgt gttgagcata taagaaaccc ttagtatgta tttgtatttg taaaatactt 120

ctatcaataa aatttctaat tcctaaaacc aaaatccagt actaaaatcc agatcccccg 180

aattaattcg gcgttaattc agtacattaa aaacgtccgc aatgtgttat taagttgtct 240

aagcgtcaat ttgtttacac cacaatatat cctgccacca gccagccaac agctccccga 300

ccggcagctc ggcacaaaat caccactcga tacaggcagc ccatcagtcc gggacggcgt 360

cagcgggaga gccgttgtaa ggcggcagac tttgctcatg ttaccgatgc tattcggaag 420

aacggcaact aagctgccgg gtttgaaaca cggatgatct cgcggagggt agcatgttga 480

ttgtaacgat gacagagcgt tgctgcctgt gatcaccgcg gtttcaaaat cggctccgtc 540

gatactatgt tatacgccaa ctttgaaaac aactttgaaa aagctgtttt ctggtattta 600

aggttttaga atgcaaggaa cagtgaattg gagttcgtct tgttataatt agcttcttgg 660

ggtatcttta aatactgtag aaaagaggaa ggaaataata aatggctaaa atgagaatat 720

caccggaatt gaaaaaactg atcgaaaaat accgctgcgt aaaagatacg gaaggaatgt 780

ctcctgctaa ggtatataag ctggtgggag aaaatgaaaa cctatattta aaaatgacgg 840

acagccggta taaagggacc acctatgatg tggaacggga aaaggacatg atgctatggc 900

tggaaggaaa gctgcctgtt ccaaaggtcc tgcactttga acggcatgat ggctggagca 960

atctgctcat gagtgaggcc gatggcgtcc tttgctcgga agagtatgaa gatgaacaaa 1020

gccctgaaaa gattatcgag ctgtatgcgg agtgcatcag gctctttcac tccatcgaca 1080

tatcggattg tccctatacg aatagcttag acagccgctt agccgaattg gattacttac 1140

tgaataacga tctggccgat gtggattgcg aaaactggga agaagacact ccatttaaag 1200

atccgcgcga gctgtatgat tttttaaaga cggaaaagcc cgaagaggaa cttgtctttt 1260

cccacggcga cctgggagac agcaacatct ttgtgaaaga tggcaaagta agtggcttta 1320

ttgatcttgg gagaagcggc agggcggaca agtggtatga cattgccttc tgcgtccggt 1380

cgatcaggga ggatatcggg gaagaacagt atgtcgagct attttttgac ttactgggga 1440

tcaagcctga ttgggagaaa ataaaatatt atattttact ggatgaattg ttttagtacc 1500

tagaatgcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg 1560

tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc 1620

aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc 1680

tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt 1740

agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc 1800

taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact 1860

caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac 1920

agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag 1980

aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg 2040

gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg 2100

tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga 2160

gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt 2220

ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct 2280

ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg 2340

aggaagcgga agagcgcctg atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac 2400

accgcatatg gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta agccagtata 2460

cactccgcta tcgctacgtg actgggtcat ggctgcgccc cgacacccgc caacacccgc 2520

tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt 2580

ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgaggcaggg 2640

tgccttgatg tgggcgccgg cggtcgagtg gcgacggcgc ggcttgtccg cgccctggta 2700

gattgcctgg ccgtaggcca gccatttttg agcggccagc ggccgcgata ggccgacgcg 2760

aagcggcggg gcgtagggag cgcagcgacc gaagggtagg cgctttttgc agctcttcgg 2820

ctgtgcgctg gccagacagt tatgcacagg ccaggcgggt tttaagagtt ttaataagtt 2880

ttaaagagtt ttaggcggaa aaatcgcctt ttttctcttt tatatcagtc acttacatgt 2940

gtgaccggtt cccaatgtac ggctttgggt tcccaatgta cgggttccgg ttcccaatgt 3000

acggctttgg gttcccaatg tacgtgctat ccacaggaaa gagacctttt cgaccttttt 3060

cccctgctag ggcaatttgc cctagcatct gctccgtaca ttaggaaccg gcggatgctt 3120

cgccctcgat caggttgcgg tagcgcatga ctaggatcgg gccagcctgc cccgcctcct 3180

ccttcaaatc gtactccggc aggtcatttg acccgatcag cttgcgcacg gtgaaacaga 3240

acttcttgaa ctctccggcg ctgccactgc gttcgtagat cgtcttgaac aaccatctgg 3300

cttctgcctt gcctgcggcg cggcgtgcca ggcggtagag aaaacggccg atgccgggat 3360

cgatcaaaaa gtaatcgggg tgaaccgtca gcacgtccgg gttcttgcct tctgtgatct 3420

cgcggtacat ccaatcagct agctcgatct cgatgtactc cggccgcccg gtttcgctct 3480

ttacgatctt gtagcggcta atcaaggctt caccctcgga taccgtcacc aggcggccgt 3540

tcttggcctt cttcgtacgc tgcatggcaa cgtgcgtggt gtttaaccga atgcaggttt 3600

ctaccaggtc gtctttctgc tttccgccat cggctcgccg gcagaacttg agtacgtccg 3660

caacgtgtgg acggaacacg cggccgggct tgtctccctt cccttcccgg tatcggttca 3720

tggattcggt tagatgggaa accgccatca gtaccaggtc gtaatcccac acactggcca 3780

tgccggccgg ccctgcggaa acctctacgt gcccgtctgg aagctcgtag cggatcacct 3840

cgccagctcg tcggtcacgc ttcgacagac ggaaaacggc cacgtccatg atgctgcgac 3900

tatcgcgggt gcccacgtca tagagcatcg gaacgaaaaa atctggttgc tcgtcgccct 3960

tgggcggctt cctaatcgac ggcgcaccgg ctgccggcgg ttgccgggat tctttgcgga 4020

ttcgatcagc ggccgcttgc cacgattcac cggggcgtgc ttctgcctcg atgcgttgcc 4080

gctgggcggc ctgcgcggcc ttcaacttct ccaccaggtc atcacccagc gccgcgccga 4140

tttgtaccgg gccggatggt ttgcgaccgt cacgccgatt cctcgggctt gggggttcca 4200

gtgccattgc agggccggca gacaacccag ccgcttacgc ctggccaacc gcccgttcct 4260

ccacacatgg ggcattccac ggcgtcggtg cctggttgtt cttgattttc catgccgcct 4320

cctttagccg ctaaaattca tctactcatt tattcatttg ctcatttact ctggtagctg 4380

cgcgatgtat tcagatagca gctcggtaat ggtcttgcct tggcgtaccg cgtacatctt 4440

cagcttggtg tgatcctccg ccggcaactg aaagttgacc cgcttcatgg ctggcgtgtc 4500

tgccaggctg gccaacgttg cagccttgct gctgcgtgcg ctcggacggc cggcacttag 4560

cgtgtttgtg cttttgctca ttttctcttt acctcattaa ctcaaatgag ttttgattta 4620

atttcagcgg ccagcgcctg gacctcgcgg gcagcgtcgc cctcgggttc tgattcaaga 4680

acggttgtgc cggcggcggc agtgcctggg tagctcacgc gctgcgtgat acgggactca 4740

agaatgggca gctcgtaccc ggccagcgcc tcggcaacct caccgccgat gcgcgtgcct 4800

ttgatcgccc gcgacacgac aaaggccgct tgtagccttc catccgtgac ctcaatgcgc 4860

tgcttaacca gctccaccag gtcggcggtg gcccatatgt cgtaagggct tggctgcacc 4920

ggaatcagca cgaagtcggc tgccttgatc gcggacacag ccaagtccgc cgcctggggc 4980

gctccgtcga tcactacgaa gtcgcgccgg ccgatggcct tcacgtcgcg gtcaatcgtc 5040

gggcggtcga tgccgacaac ggttagcggt tgatcttccc gcacggccgc ccaatcgcgg 5100

gcactgccct ggggatcgga atcgactaac agaacatcgg ccccggcgag ttgcagggcg 5160

cgggctagat gggttgcgat ggtcgtcttg cctgacccgc ctttctggtt aagtacagcg 5220

ataaccttca tgcgttcccc ttgcgtattt gtttatttac tcatcgcatc atatacgcag 5280

cgaccgcatg acgcaagctg ttttactcaa atacacatca cctttttaga cggcggcgct 5340

cggtttcttc agcggccaag ctggccggcc aggccgccag cttggcatca gacaaaccgg 5400

ccaggatttc atgcagccgc acggttgaga cgtgcgcggg cggctcgaac acgtacccgg 5460

ccgcgatcat ctccgcctcg atctcttcgg taatgaaaaa cggttcgtcc tggccgtcct 5520

ggtgcggttt catgcttgtt cctcttggcg ttcattctcg gcggccgcca gggcgtcggc 5580

ctcggtcaat gcgtcctcac ggaaggcacc gcgccgcctg gcctcggtgg gcgtcacttc 5640

ctcgctgcgc tcaagtgcgc ggtacagggt cgagcgatgc acgccaagca gtgcagccgc 5700

ctctttcacg gtgcggcctt cctggtcgat cagctcgcgg gcgtgcgcga tctgtgccgg 5760

ggtgagggta gggcgggggc caaacttcac gcctcgggcc ttggcggcct cgcgcccgct 5820

ccgggtgcgg tcgatgatta gggaacgctc gaactcggca atgccggcga acacggtcaa 5880

caccatgcgg ccggccggcg tggtggtgtc ggcccacggc tctgccaggc tacgcaggcc 5940

cgcgccggcc tcctggatgc gctcggcaat gtccagtagg tcgcgggtgc tgcgggccag 6000

gcggtctagc ctggtcactg tcacaacgtc gccagggcgt aggtggtcaa gcatcctggc 6060

cagctccggg cggtcgcgcc tggtgccggt gatcttctcg gaaaacagct tggtgcagcc 6120

ggccgcgtgc agttcggccc gttggttggt caagtcctgg tcgtcggtgc tgacgcgggc 6180

atagcccagc aggccagcgg cggcgctctt gttcatggcg taatgtctcc ggttctagtc 6240

gcaagtattc tactttatgc gactaaaaca cgcgacaaga aaacgccagg aaaagggcag 6300

ggcggcagcc tgtcgcgtaa cttaggactt gtgcgacatg tcgttttcag aagacggctg 6360

cactgaacgt cagaagccga ctgcactata gcagcggagg ggttggatca aagtactttg 6420

atcccgaggg gaaccctgtg gttggcatgc acatacaaat ggacgaacgg ataaaccttt 6480

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caatatatcc tgtcaaacac tgatagttta attcccgatc tagtaacata gatgacaccg 6600

cgcgcgataa tttatcctag tttgcgcgct atattttgtt ttctatcgcg tattaaatgt 6660

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taattattac atgcttaacg taattcaaca gaaattatat gataatcatc gcaagaccgg 6780

caacaggatt caatcttaag aaactttatt gccaaatgtt tgaacgatcg gggaaattcg 6840

agctggtcac ctttcacgaa atcggccctt attcaaaaat aacttttaaa taatgaattt 6900

taaattttaa gaaataatat ccaatgaata aatgacatgt agcattttac ctaaatattt 6960

caactatttt aatccaatat taatttgttt tattcccaac aatagaaagt cttgtgcaga 7020

catttaatct gacttttcca gtactaaata ttaattttct gaagattttc gggtttagtc 7080

cacaagtttt agtgagaagt tttgctcaaa attttaggtg agaaggtttg atatttatct 7140

tttgttaaat taatttatct aggtgactat tatttattta agtagaaatt catatcatta 7200

cttttgccaa cttgtagtca taataggagt aggtgtatat gatgaaggaa taaacaagtt 7260

cagtgaagtg attaaaataa aatataattt aggtgtacat caaataaaaa ccttaaagtt 7320

tagaaaggca ccgaataatt ttgcatagaa gatattagta aatttataaa aataaaagaa 7380

atgtagttgt caagttgtct tctttttttt ggataaaaat agcagttggc ttatgtcatt 7440

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tgtatgaata ctaaataatt ttttaggact gactcaaata tttttatatt atcatagtaa 7560

tatttatcta atttttagga ccacttatta ctaaataata aattaactac tactatatta 7620

ttgttgtgaa acaacaacgt tttggttgtt atgatgaaac gtacactata tcagtatgaa 7680

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ctacttttgt ctctttcttg ttcccatttc tctcttagat ttcaaaaagt gaactacttt 7860

atctctttct ttgttcacat tttattttat tctattataa atatggcatc ctcatattga 7920

gatttttaga aattattcta atcattcaca gtgcaaaagc tcgagaagct agcaatgacc 7980

gaagtgacat ctaagcaaga agctgctagt agtcaaacta atcatacagt aacgacaatc 8040

agtagctcta cttcagtagt taatcccaaa gaggttgtaa gtaatcctta tactgttggg 8100

gaaacagctt ctaatggtga aaagctacaa aatcaaacaa ctacagttga caaaacttct 8160

gaagctgctg ctaataatat tagtaaacaa acaaccgaag ctgatacaga tgttattgat 8220

gatagcaatg cagccaatct acaaatattg gaaaaacttc ccaatgtaaa agaaattgat 8280

ggtaagtatt attattatga caataacggc aaagttcgta ctaattttac attaattgct 8340

gatggcaaaa ttttacattt tgatgaaact ggcgcttata ctgatacatc aattgacact 8400

gtaaataaag acatcgtcac aacaagaagt aatctataca aaaaatataa tcaagtttat 8460

gatcgctctg cacagagctt tgagcatgtt gatcattatt tgacagccga aagtccacca 8520

ggcccaccca ggcggaggac caggccgatg gtagatacta aagtagttgg aacacaaact 8580

ggaaatccag cgaccaattt gccagaggct caagggagtg cgagtaagga agctgaacaa 8640

agtcaaaacc aagctggaga gacaaatggt tcaataccag ttgaagtacc taaaactgat 8700

cttgatcaag cagcaaaaga tgctaagtct gctggtgtca atgttgtcca agatgccgat 8760

gttaataaag gaactgttaa aacagctgaa gaagcagtcc aaaaagaaac tgaaattaaa 8820

gaagattaca caaaacaagc tgaggatatt aagaagacaa cagatcaata taaatcggat 8880

gtagctgctc atgaggcaga agttgctaaa atcaaagcta aaaatcaggc aactaaagaa 8940

cagtatgaaa aagatatggc agctcataaa gccgaggttg aacgcattaa tgctgcaaat 9000

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gtagcagcaa ataatgctaa aaatacagaa attgccgctg ccaatgaaga aattagaaaa 9240

cgcaatgcaa cggccaaagc tgaatatgag actaagttag ctcaatatca agctgaacta 9300

aagcgtgttc aggaagctaa tgccgcaaac gaagcagact atcaagctaa attgaccgcc 9360

tatcaaacag agcttgctcg cgttcaaaaa gccaatgcgg atgctaaagc ggcctatgaa 9420

gcagctgtag cagcaaataa tgccaaaaat gcggcactca cagctgaaaa tactgcaatt 9480

aagcaacgca atgagaatgc taaggcgact tatgaagctg cactcaagca atatgaggcc 9540

gatttggcag cggtgaaaaa agctaatgcc gcaaacgaag cagactatca agctaaattg 9600

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caagcagacc ttgccaaata tcaaaaagat ttagcagact atccagttaa gttaaaggca 9840

tacgaatctg agaaggatga gctgcggagg accaggaggc ggaggaccag gccgatgatt 9900

aaattaaaat ttggtgtttt ttttacagtt ttactatctt cagcatacgc acatggaaca 9960

cctcaaaata ttactgattt gtgtgcagaa taccacaaca cacaaatata tacgctaaat 10020

gataagatat tttcgtatac agaatctcta gctggaaaaa gagagatggc tatcattact 10080

tttaagaatg gtgcaatttt tcaagtagaa gtaccaggta gtcaacatat agattcacaa 10140

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gacctgctgt tcgaggagga aatggagcag tgtgctgacc tgtgtcagcg ggtgctccat 10860

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gcactggcat ccttggtagg caaagcacca gacttcaatg aggagcacct gagaaagtcc 11040

ttaaggacca ttctggccta ttcagaagag gacacggcca tgcgggcaac tctttttccc 11100

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agggaattcc aggaggaccc tgagatgctc atggacctca tgtacagaat tgccaagagc 11220

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aagaggaagt gcttcacaga ggccgccatg tgcctggtgc atgcagcagc cttggtggca 11340

gagtacctga gcatgctgga ggaccacagt tacctgcctg tgggcagcgt cagctttcag 11400

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caagtgttct tggctgaaat tccggctgac ccaaaactct accggcatca caacaagctg 12360

aggttatgct tcaaggagtt cataatgcga tgcggtgagg ccgtagagaa gaacaggaga 12420

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cagttgtcac agggcagctg agtcgag 12627