一氧化氮供体型β‑榄香烯衍生物及其制备方法和用途与流程

本发明属于β-榄香烯衍生物的制备技术领域，具体涉及一氧化氮供体型β-榄香烯衍生物及其制备方法和用途。

背景技术：

β-榄香烯是从温莪术(C.Wenchowensis)的根茎中分离出来的具有抗肿瘤活性的倍半萜烯化合物，其分子式为C₁₅H₂₄，结构式如下式(1)：

以β-榄香烯为主要成分的乳剂已于2008年被卫生部批准为国家二类抗癌新药进入二期临床研究，这种新的抗肿瘤天然产物在各种肿瘤中逐步表现出很强的临床治疗作用。目前，在临床上主要用于恶性浆膜腔积液、肺癌、消化道肿瘤、脑瘤以及其它浅表性肿瘤的化疗，对食管癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、膀胱癌等亦有一定疗效。研究表明，榄香烯类化合物几乎不产生副作用，对肾、肝的功能都不产生药物诱导毒性，特别是对脊髓没有抑制作用。(张殊佳，周鹏段，华鑫，袁韩。化学通报.2010,6:499.)

但是，由于β-榄香烯属于挥发油类，不溶于水，生物利用度很低，严重限制了它的临床应用。因此，如何提高其水溶性一直备受关注。现有技术中，以通过合成β-榄香烯衍生物从而提高水溶性的工作为主。如贾卫民在其论文《抗癌新药β-榄香烯及其衍生物的合成、结构和构效研究》中合成了双取代的酯、醇、醚和叠氮衍生物并对β-榄香烯的构效关系进行了系统研究。结果表明，β-榄香烯的抗癌活性和三个孤立双键及整个骨架结构密切相关，其衍生物的抗癌活性随水溶性增大而增强。又如中国专利申请200710037160.3公开了β-榄香烯二胺类衍生物及其合成方法。中国专利申请02121674.6公开了β-榄香烯氮杂环衍生物及其合成方法。中国专利申请200710181826.2公开了β-榄香烯氨基酸衍生物及其合成方法。

一氧化氮(NO)气体分子在不同条件下具有促瘤和抗瘤的作用，这种双重作用取决于NO的生成浓度、时间和效应部位。持续低浓度的NO可以促进细胞的生长，高浓度的NO则通过产生细胞毒性而发挥抗肿瘤活性。呋咱氮氧化物在体内能够持续释放较高浓度的NO(Kerwin J.F.,Heller.M.Med.Res.Rev.1994,14:23.)。为获得性能优异的新型抗肿瘤活性化合物，通过分子设计的方法，选择性地在β-榄香烯结构中引入NO释放单元，使β-榄香烯衍生物兼具优异的水溶性和较高的生物利用度，从而进一步扩充其临床应用。值得注意的是，目前现有技术中并未见将NO供体与β-榄香烯结合制备衍生物的相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的之一是提供一类NO供体与β-榄香烯结合的一氧化氮供体型β-榄香烯衍生物及其可药用盐。

本发明的另一个目的是提供制备上述一氧化氮供体型β-榄香烯衍生物及其可药用盐的方法。

本申请的又一个目的是提供一种包含上述一氧化氮供体型β-榄香烯衍生物及其可药用盐的药物组合物。

本申请的再一个目的是提供上述一氧化氮供体型β-榄香烯衍生物及其可药用盐在制备抗肿瘤药物中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明的一个技术方案提供了一类NO供体与β-榄香烯结合的一氧化氮供体型β-榄香烯衍生物及其可药用盐，其中，一氧化氮供体型β-榄香烯衍生物具有如下通式M：

或者溶剂化物，或者其对映异构体或非对映异构体，且其中，X为O；或同时含有酯基和胺基的基团，即同时含有-COO-和-NH-基团；

R¹代表不含或任选地含有一个至三个取代基的C_1-10烷基，C_6-12环烷基，C_6-12芳基，C_2-10烯基，C_2-10炔基或C_2-10醚基；

R²代表不含或任选地含有一个至三个取代基的C_1-10烷基，C_6-12环烷基，C_6-12芳基，C_2-10烯基，C_2-10炔基或C_4-22的醚基；其中，所述的烷基、环烷基、芳基、烯基、炔基和醚基包括直链的或带支链的烷基、直链的或带支链的环烷基、直链的或带支链的芳基、直链的或带支链的烯基、直链的或带支链的炔基和直链的或带支链的醚基。

优选地，X为O，所述一氧化氮供体型β-榄香烯衍生物的通式如下式(I)；

所述取代基任意代表胺基、卤原子、羧基、C_1-3烷氧基、C_1-3卤代烷基、硝基或羟基；

优选地，X为同时含有酯基和胺基的基团，所述一氧化氮供体型β-榄香烯衍生物的通式如下式(II)；

其中，R³代表不含或任选地含有一个至三个取代基的C_1-10烷基，C_6-12环烷基或C_6-12芳基；所述烷基、环烷基和烷基包括直链的或带支链的烷基、直链的或带支链的环烷基、直链的或带支链的芳基。

所述取代基任意代表胺基、卤原子、羧基、C_1-3烷氧基、C_1-3卤代烷基、硝基或羟基；所述取代基是指R¹、R²、R³的中C_1-10烷基，C_6-12环烷基或C_6-12芳基上含有的取代基；

进一步优选地，R¹代表不含或任选地含有一个取代基的C_1-5烷基，C_6-8环烷基，C_6-10芳基，C_2-6烯基，C_2-6炔基或C_2-6醚基；

R²代表不含或任选地含有一个取代基的C_1-6烷基，C_6-8环烷基，C_6-10芳基，C_2-6烯基，C_2-6炔基或C_4-8醚基；

R³代表不含或任选地含有一个取代基的C_1-5烷基，C_6-8环烷基或C_6-10芳基；

所述取代基任意优选为-NH₂、-F、-Cl、-Br、-I、-COOH、-OCH₃、-CF₃、-NO₂或-OH。

更进一步优选地，R¹代表不含或任选地含有一个-NH₂的C_1-5烷基，不含取代基的C_6-8环烷基，C_6-8芳基，C_2-4烯基，C_2-4炔基或C_2-4醚基；

R²代表任选地不含取代基的C_1-6烷基，C_4-6炔基或C_4-6醚基；

R³代表任选地含有一个-COOH或-NH₂的C_1-5烷基，不含取代基的C_6-8芳基。

又进一步优选地，R¹代表任选地含有一个-NH₂的C_2-3烷基，不含取代基的C_2-5烷基，C_6-8芳基，C_2-4烯基或C_2-4醚基；例如：-(CH₂)₂-，-(CH₂)₃-，-CH₂C(CH₃)₂CH₂-，-CH(NH₂)CH₂-，-CH(NH₂)(CH₂)₂-，-C₆H₄-，-CH＝CH-或-CH₂OCH₂-；最优选为-(CH₂)₂-或-CH(NH₂)CH₂-；

R²代表任选地不含取代基的C_1-6烷基，C_4-6炔基或C_4-6醚基；例如：-(CH₂)₂-，-(CH₂)₃-，-(CH₂)₄-、-(CH₂)₆-、-CH₂CH(CH₃)-，-(CH₂)₂CH(CH₃)-，-(CH₂)₂O(CH₂)₂-或-CH₂CH≡CHCH₂-；最优选为-(CH₂)₂-、-CH₂CH≡CHCH₂-、-(CH₂)₂O(CH₂)₂-；

R³代表任选地含有一个-COOH的C_2-4烷基，含有一个-NH₂的C_2-4烷基，不含取代基C_1-5烷基，不含取代基的C_6-8芳基；例如：-CH(NH₂)(CH₂)₃-、-CH(COOH)CH₂-，-CH(COOH)(CH₂)₂-，-CH₂-，-(CH₂)₂-，-(CH₂)₃-，-CH(CH₃)-，-(CH₃)CH(CH₂CH₃)-或-CH(CH₂Ph)-；最优选为-CH₂-，-(CH₂)₂-，-(CH₂)₃-，-CH(CH₃)-，-CH((CH₃)CH(CH₂CH₃))-或-CH(CH₂Ph)-。

本申请所述的“β-榄香烯衍生物的可药用盐”是指常规的有机酸或无机酸的加成盐，其保留了β-榄香烯衍生物的生物有效性和特性。所述酸为盐酸，氢溴酸，氢碘酸，硫酸，磷酸，硝酸，乙酸，酒石酸，水杨酸，甲磺酸，苯磺酸，对甲苯磺酸，邻苯二甲酸，丁二酸，己二酸，丙酮酸，羟基丁酸，柠檬酸，苹果酸，乳酸，富马酸，马来酸和琥珀酸中的一种；优选为盐酸，氢溴酸，氢碘酸，富马酸，马来酸，甲磺酸，柠檬酸和酒石酸中一种。

本发明的另一个技术方案提供了上述一氧化氮供体型β-榄香烯衍生物及其可药用盐的制备方法，其中，通式M所示结构化合物的制备包括下列步骤：

将如下式(Ⅲ)或(Ⅳ)所示结构的化合物与13-β-榄香醇，或与13-β-榄香醇氨基酸酯经催化酯化反应制得通式M所示结构化合物；

其中，所述R¹代表不含或任选地含有一个至三个取代基的C_1-10烷基，C_6-12环烷基，C_6-12芳基，C_2-10烯基，C_2-10炔基或C_2-10醚基；

R²代表不含或任选地含有一个至三个取代基的C_1-10烷基，C_6-12环烷基，C_6-12芳基，C_2-10烯基，C_2-10炔基或C_4-22的醚基；

Y代表-OH或-Cl。

优选地，所述Y代表-OH，所述式(Ⅳ)由以下反应制得：

优选地，所述Y代表-Cl，可由含羟基的式(Ⅳ)与草酰氯反应制得酰氯中间体，然后将酰氯中间体与13-β-榄香醇，或与13-β-榄香醇氨基酸酯经催化酯化反应制得通式M所示结构化合物。

优选地，制备中间体1的操作具体如下：

a.将苯硫酚溶于5M NaOH水溶液，加入氯乙酸，回流2h，调节pH值至1-2，过滤得固体1；其中，苯硫酚、NaOH和氯乙酸的摩尔比为＝1:2:1.1；

b.将步骤a所得固体1溶于冰醋酸，所得固体1的冰醋酸溶液的浓度为1.0-1.5mol/L，然后加入质量分数为30％的H₂O₂水溶液，搅拌3h后缓慢滴加发烟硝酸，在冰水浴条件下1h内滴完，然后升温至100℃，继续反应3h，冷却至室温，过滤得固体2，即中间体1；其中，所述固体1与H₂O₂的摩尔比为1:2；所述固体1与发烟硝酸的摩尔比为1:6。

优选地，制备所述式(Ⅲ)的操作具体如下：

将所述中间体1溶于四氢呋喃，依次加入二羟基化合物R₂(OH)₂和5M NaOH水溶液，搅拌1h后，萃取，柱层析得3-苯磺酰基-4-羟基醚-1,2,5-噁二唑-2-氧化物，即式(Ⅲ)；其中，中间体1的四氢呋喃溶液的摩尔浓度为0.1-0.5mol/L；所述中间体1：二羟基化合物和NaOH的摩尔比为1:(3-6):(1.2-2)；优选为1:(4-6):(1.3-2)；更优选为1:(5-6):(1.5-2)；例如1:5:1.5。

优选地，Y为-OH，制备所述式由(Ⅳ)结构的化合物的具体操作如下：

将式(Ⅲ)所示结构的3-苯磺酰基-4-羟基醚-1,2,5-噁二唑-2-氧化物溶解，依次加入二酸酐化合物、DMAP、三乙胺，室温搅拌2-4h后过滤，纯化即得(3-苯磺酰基-4-氧-1,2,5-噁二唑-2-氧化物)二酸单酯化合物，即式(Ⅳ)。

进一步优选地，溶解式(Ⅲ)所示结构的3-苯磺酰基-4-羟基醚-1,2,5-噁二唑-2-氧化物所用溶剂可以为二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃和N,N-二甲基甲酰胺中的一种；更进一步优选为二氯甲烷；

所述式(Ⅲ)：二酸酐：DMAP：三乙胺的摩尔比为1:(1.1-2)：(0.1-0.5):(1.3-3)；更进一步优选为1:(1.2-2)：(0.1-0.3):(1.3-2)；最优选为：

1:(1.2-1.5)：(0.1-0.3):(1.3-1.8)；如1：1.2：0.1:1.5。

优选地，Y为-OH，通式M所示结构化合物由式(Ⅳ)所示结构的化合物与13-β-榄香醇经催化酯化反应制得，具体步骤为：将式(Ⅳ)化合物和13-β-榄香醇，溶于二氯甲烷，加入EDCI和DMAP室温搅拌6-10h，反应结束后，萃取，柱层析即得产物；其中，所述式(Ⅳ)化合物、13-β-榄香醇、EDCI和DMAP的摩尔比为(1-3):1:(1.1-3):(0.1-0.5)，进一步优选为(1.2-2):1:(1.1-2):(0.1-0.3)，更优选为(1.2-1.5):1:(1.2-1.8):(0.1-0.3)，如1.2:1:1.2:0.1。

优选地，Y为-OH，通式M所示结构化合物由式(Ⅲ)所示结构的化合物与13-β-榄香醇氨基酸酯经催化酯化反应制得，具体步骤为：

将式(Ⅲ)化合物、13-β-榄香醇氨基酸酯溶于二氯甲烷，加入EDCI和DMAP，室温搅拌6-10h，反应结束后，萃取，柱层析即得产物；其中，所述式(Ⅲ)化合物、13-β-榄香醇氨基酸酯、EDCI和DMAP的摩尔比为(1.1-3):1:(1.1-3):(0.1-0.5)；优选为(1.2-1.5):1:(1.2-2):(0.1-0.3)。更优选为(1.2-1.5):1:(1.2-1.5):(0.1-0.3)，如1.2:1:1.2:0.1。

优选地，Y为-OH，通式M所示结构化合物由式(Ⅳ)所示结构的化合物与13-β-榄香醇氨基酸酯经催化酯化反应制得，具体步骤为：将式(Ⅳ)化合物、13-β-榄香醇氨基酸酯溶于二氯甲烷，加入EDCI和HOBt，室温搅拌4-8h，反应结束后，萃取，柱层析即得产物；其中，所述式(Ⅳ)化合物、13-β-榄香醇氨基酸酯、EDCI和HOBt的摩尔比为(1.1-3):1:(1.1-3):(1.1-3)；优选为(1.2-1.5):1:(1.2-2):(1.2-2)。更优选为(1.2-1.5):1:(1.2-1.5):(1.2-1.5)，如1.2:1:1.2:1.2。

优选地，Y为-Cl，通式M所示结构化合物由式(Ⅳ)所示结构的化合物与13-β-榄香醇氨基酸酯经催化酯化反应制得，具体步骤为：

将式13-β-榄香醇氨基酸酯、DMAP和三乙胺溶于二氯甲烷，室温搅拌下缓慢地滴加式(Ⅳ)化合物的二氯甲烷溶液，滴毕继续反应1-3h，反应结束后，萃取，柱层析即得产物；其中，所述式(Ⅳ)：13-β-榄香醇氨基酸酯：DMAP：三乙胺的摩尔比为(1.1-3):1：(0.1-0.5):(1.3-3)；更进一步优选为(1.2-2)：1:(0.1-0.3):(1.3-2)；最优选为：(1.2-1.5)：1:(0.1-0.3):(1.3-1.8)；如1.2：1：0.1:1.5。

其中，13-β-榄香醇氨基酸酯由13-β-榄香醇和Boc-氨基酸催化酯化制得的中间体再经有机酸或无机酸,优选为有机酸三氟乙酸脱保护制得,具体步骤为：

1)13-β-榄香醇和Boc-氨基酸溶于二氯甲烷，加入EDCI和DMAP，室温搅拌4-10h，反应结束后，萃取，柱层析制得中间体13-β-榄香醇Boc-氨基酸酯；其中，所述式13-β-榄香醇、Boc-氨基酸、EDCI和DMAP的摩尔比为(1.1-5):1:(1.1-3):(0.1-0.5)；优选为(1.2-3):1:(1.2-2):(0.1-0.3)；更优选为(1.2-2):1:(1.2-1.5):(0.1-0.3)，如1.2:1:1.2:0.1；

2)13-β-榄香醇Boc-氨基酸酯溶于二氯甲烷，加入三氟乙酸，室温搅拌1-3h，反应结束后，萃取，柱层析即得产物13-β-榄香醇氨基酸酯；其中，所述13-β-榄香醇Boc-氨基酸和三氟乙酸的摩尔比为1:(5-20)；优选为1:(10-15)。

优选地，所述Boc-氨基酸选自Boc-L-天冬氨酸、Boc-L-谷氨酸，Boc-甘氨酸、Boc-L-苯丙氨酸、Boc-L-异亮氨酸、Boc-L-亮氨酸、Boc-L-缬氨酸、Boc-L-丙氨酸、Boc-L-脯氨酸、Boc-L-丝氨酸、Boc-L-半胱氨酸、Boc-L-苏氨酸、Boc-L-蛋氨酸、Boc-L-色氨酸、Boc-L-赖氨酸、Boc-L-精氨酸、Boc-L-组氨酸和Boc-β-丙氨酸中的一种；

进一步优选为Boc-L-天冬氨酸、Boc-甘氨酸、Boc-L-苯丙氨酸、Boc-L-异亮氨酸、Boc-L-丙氨酸、Boc-L-脯氨酸、Boc-L-丝氨酸和Boc-β-丙氨酸中的一种。

优选地，所述的13-β-榄香醇的制备方法如下：

将β-榄香烯溶于二氯甲烷和乙酸混合溶液中，冰水浴条件下向混合溶液中加入含有活性氯的次氯酸钠溶液，反应4-8h后分液，萃取，合并并浓缩有机相得粗品，将所述粗品溶解后，搅拌下加入无水醋酸钠，于90-120℃反应5-8h后进行抽滤，萃取，合并并浓缩有机相得黄色液体，将黄色液体溶解后，加入氢氧化钠或氢氧化钾回流2-4h，过滤，浓缩滤液后柱层析即得。

进一步优选地，所述的13-β-榄香醇的制备步骤中所述二氯甲烷和乙酸的体积比为(1-5):1；

所述次氯酸钠溶液中次氯酸钠与β-榄香烯的摩尔比为(1.1-2):1。

本申请的又一个技术方案提供了一种含有上述一氧化氮供体型β-榄香烯衍生物及其可药用盐的药物组合物，其包括通式M所示结构的化合物或其可药用盐，及可药用载体。

本申请的又一个技术方案提供了上述一氧化氮供体型β-榄香烯衍生物及其可药用盐在制备抗肿瘤药物中的应用。

与现有技术相比，本申请具有如下有益效果：

在β-榄香烯结构中引入含有极性基团的呋咱氮氧化物，一方面提高了β-榄香烯衍生物的水溶性；另一方面，呋咱氮氧化物作为一氧化氮释放单元可释放出NO，与β-榄香烯起协同抗肿瘤作用；而且丰富了抗肿瘤药物β-榄香烯衍生物的分子库。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步阐述。这些实施例仅是出于解释说明的目的，本发明的保护范围并不受其限制。

中间体13-β-榄香醇的制备

将100mmolβ-榄香烯溶于20mL二氯甲烷和乙酸混合溶液中(V:V＝2:1)，冰浴条件下缓慢滴入含有180mmol活性氯的次氯酸钠溶液，冰浴反应4h后分液，水层以二氯甲烷萃取3次，合并二氯甲烷浓缩得淡黄色液体粗品，液体粗品溶于15mL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌下加入200mmol无水醋酸钠，于100℃反应7h；反应液以200目硅胶抽滤，滤液中加入15mL饱和食盐水，然后用石油醚萃取3次，合并并浓缩石油醚得黄色液体，以8mL甲醇和8mL氯仿的混合溶液溶解黄色液体，加入200mmol氢氧化钾回流反应2h。过滤，滤液浓缩后以石油醚：乙酸乙酯＝10:1(V:V)柱层析，得到无色液体产物，总产率为15％。

所述13-β-榄香醇的结构表征结果如下：

¹H NMR(CDCl₃,300MHz)δ:1.01(s,3H),1.41-1.67(m,6H),1.71(s,3H),1.97-2.05(m,2H),4.13(s,2H),4.59(s,1H),4.82(t,J＝1.7Hz,1H),4.88(s,1H),4.91-4.94(m,2H),5.05(d,J＝1.3Hz,1H),5.81(dd,J₁＝17.8Hz,J₂＝10.5Hz,1H).

¹³C NMR(CDCl₃,300MHz)δ:153.7,150.0,147.4,112.1,109.9,107.9,65.1,52.7,41.4,39.8,39.7,33.2,27.2,24.7,16.5.

实施例1

13-O-(4-氧代丁酸-(3-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧)乙酯)-β-榄香烯的制备方法如下：

1)3，4-二苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物(中间体1)的制备

将苯硫酚(50ml,0.50mol)加入装有机械搅拌的反应瓶中，室温搅拌下加入5M NaOH水溶液200mL，15min后加入氯乙酸(53g,0.55mol)，反应液中有大量白色沉淀析出；升温至140℃后加热回流2h，反应液变澄清，冷却后呈白色糊状；在冰浴条件下缓慢滴加6N HCl调pH至1，过滤，干燥后得粗品，粗品用H₂O重结晶，得白色固体68g(收率97％):mp.60-62℃。

2)3-苯磺酰基-4-羟乙基醚-1,2,5-噁二唑-2-氧化物(式(Ⅲ))的制备

将乙二醇(1.12mL,20mmol)和3,4-二苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-2-氧化(733mg,4.0mmol)溶于10mL四氢呋喃中，滴入5M NaOH水溶液(6.0ml,30mmol)，反应1h后将反应液倾入20mL H₂O中，用乙酸乙酯萃取三次，每次20mL，有机层合并后用饱和食盐水洗一次，用无水Na₂SO₄干燥，过滤，滤液浓缩，柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝4：1)，得白色固体0.58g(收率50％):mp.161-163℃；MS(ESI)m/z:287.0[M+H]⁺,304.1[M+NH₄]⁺。

3)(3-苯磺酰基-4-氧-1,2,5-噁二唑-2-氧化物)丁二酸单乙酯化合物(式(Ⅳ))的制备

将3-苯磺酰基-4-羟乙基醚-1,2,5-噁二唑-2-氧化物(0.58g,2.0mmol)溶于10ml二氯甲烷中，加入丁二酸酐(0.24g,2.4mmol)，依次加入DMAP(24mg,0.1mmol)和三乙胺(0.42ml,3.0mmol),室温搅拌2h，反应液用质量浓度为10％的盐酸洗涤，无水Na₂SO₄干燥，过滤，滤液浓缩,柱层析(二氯甲烷：甲醇＝40:1)，得白色固体0.70g(收率91％)。

¹H NMR(CDCl₃,300MHz)δ2.71(s,4H),4.52(t,J＝7.8Hz,2H),4.62(t,J＝7.8Hz,2H),7.60(t,J＝7.5Hz,2H),7.74(t,J＝7.5Hz,1H),8.06(t,J＝8.1Hz,2H)；MS(ESI)m/z:387.0[M+H]⁺,404.1[M+NH₄]⁺。

4)13-O-(4-氧代丁酸-(3-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧)乙酯)-β-榄香烯的制备

将1mmol 13-β-榄香醇溶于10mL无水二氯甲烷中，依次加入1.2mmol 3-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧丁二酸单乙酯、1.2mmol EDCI和0.1mmolDMAP，常温反应4h。反应液以10％盐酸洗涤3次后浓缩二氯甲烷层得淡黄色液体；然后以石油醚：乙酸乙酯＝4:1(V:V)柱层析，得到无色液体产物，产率为84％。

所述13-O-(4-氧代丁酸-(3-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧)乙酯)-β-榄香烯的结构表征结果如下：

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.13–8.01(m,2H),7.77(t,J＝7.5Hz,1H),7.64(t,J＝7.7Hz,2H),5.81(dd,J＝17.8,10.5Hz,1H),5.05(s,1H),5.01(s,1H),4.93(d,J＝3.3Hz,1H),4.88(d,J＝1.2Hz,1H),4.82(s,1H),4.66–4.57(m,5H),4.56–4.50(m,2H),2.72(s,4H),2.10–1.95(m,2H),1.71(s,3H),1.69–1.55(m,3H),1.53–1.40(m,3H),1.00(s,3H).

¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ171.53,171.38,158.18,149.50,147.70,146.88,137.51,135.19,129.20,128.14,111.77,110.43,109.56,68.35,65.93,60.92,52.10,41.21,39.28(2),32.48,28.49,28.40,26.51,24.33,16.07.

实施例2

13-O-(4-氧代丁酸-(3-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧)丁酯)-β-榄香烯的制备方法基本同实施例1，区别在于，将实施例1的步骤2)中的乙二醇替换为丁二醇。

本实施例制得无色液体产物，产率为85％。

所述13-O-(4-氧代丁酸-(3-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧)丁酯)-β-榄香烯的结构表征结果如下：

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.12–8.01(m,2H),7.77(dd,J＝10.7,4.3Hz,1H),7.63(t,J＝7.7Hz,2H),5.81(dd,J＝17.8,10.5Hz,1H),5.05(s,1H),5.01(s,1H),4.93(d,J＝3.4Hz,1H),4.88(d,J＝1.0Hz,1H),4.82(s,1H),4.61(s,2H),4.58(s,1H),4.46(t,J＝6.2Hz,2H),4.20(t,J＝6.2Hz,2H),2.76–2.62(m,4H),2.08–1.91(m,4H),1.90–1.75(m,3H),1.71(s,3H),1.69–1.55(m,3H),1.53–1.41(m,3H),1.00(s,3H).

¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ171.77,171.52,158.42,149.50,147.72,146.88,137.52,135.16,129.20,128.05,111.77,110.41,109.56,70.44,65.88,63.41,52.10,41.21,39.28(2),32.50,28.61,28.53,26.52,24.69,24.49,24.34,16.07.

实施例3

13-O-(4-氧代丁酸-(3-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-6-氧)己酯)-β-榄香烯的制备方法基本同实施例1，区别在于，将实施例1的步骤2)中的乙二醇替换为己二醇。

本实施例制得无色液体产物，产率为87％。

所述13-O-(4-氧代丁酸-(3-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-6-氧)己酯)-β-榄香烯的结构表征结果如下：

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.06(d,J＝7.5Hz,2H),7.76(t,J＝7.5Hz,1H),7.62(t,J＝7.9Hz,2H),5.81(dd,J＝17.7,10.5Hz,1H),5.05(s,1H),5.01(s,1H),4.93(d,J＝4.5Hz,1H),4.88(s,1H),4.82(s,1H),4.60(s,2H),4.58(s,1H),4.42(t,J＝6.5Hz,2H),4.12(t,J＝6.5Hz,2H),2.72–2.61(m,4H),2.09–1.96(m,2H),1.94–1.82(m,2H),1.71(s,3H),1.69–1.57(m,6H),1.51–1.42(m,6H),1.00(s,3H).

¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ172.19,171.92,158.93,149.90,148.17,147.26,138.07,135.50,129.55,128.42,112.17,110.86,109.94,71.33,66.26,64.45,52.57,41.67,39.71,39.64,32.94,29.09,29.01,28.37,28.23,26.95,25.36,25.18,24.70,16.51.

实施例4

13-O-(4-氧代丁酸-(3-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧)乙氧基乙酯)-β-榄香烯的制备方法基本同实施例1，区别在于，将实施例1的步骤2)中的乙二醇替换为二乙二醇。

本实施例制得无色液体产物，产率为82％。

所述13-O-(4-氧代丁酸-(3-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧)乙氧基乙酯)-β-榄香烯的结构表征结果如下：

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.14–8.03(m,2H),7.77(t,J＝7.5Hz,1H),7.63(t,J＝7.7Hz,2H),5.81(dd,J＝17.8,10.5Hz,1H),5.04(s,1H),5.00(s,1H),4.93(d,J＝3.6Hz,1H),4.88(s,1H),4.82(s,1H),4.65–4.52(m,5H),4.30(t,J＝4.7Hz,2H),3.92(t,J＝4.4Hz,2H),3.80(t,J＝4.7Hz,2H),2.69(s,4H),2.08–1.96(m,2H),1.71(s,3H),1.69–1.56(m,3H),1.54–1.41(m,3H),1.00(s,3H).

¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ171.79,171.48,158.41,149.51,147.72,146.87,137.51,135.18,129.19,128.08,111.76,110.38,109.55,70.03,68.86,67.84,65.83, 63.19,52.08,41.17,39.27(2),32.48,28.55,28.43,26.50,24.35,16.06.

实施例5

13-O-(4-氧代丁酸-(3-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧)-2-丁炔酯)-β-榄香烯的制备方法基本同实施例1，区别在于，将实施例1的步骤2)中的乙二醇替换为1,4-丁炔二醇。

本实施例制得无色液体产物，产率为76％。

所述13-O-(4-氧代丁酸-(3-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧)-2-丁炔酯)-β-榄香烯的结构表征结果如下：

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.08(d,J＝7.9Hz,2H),7.77(t,J＝6.8Hz,1H),7.64(t,J＝7.1Hz,2H),5.82(dd,J＝17.2,10.7Hz,1H),5.10(s,2H),5.05(s,1H),5.02(s,1H),4.93(d,J＝3.8Hz,1H),4.88(s,1H),4.83(s,1H),4.77(s,2H),4.62(s,2H),4.59(s,1H),2.71(s,4H),2.09–1.95(m,2H),1.71(s,3H),1.64–1.54(m,3H),1.53–1.41(m,3H),1.01(s,3H).

¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ171.65,171.35,157.86,149.91,148.14,147.27,137.81,135.64,129.64,128.57,112.20,110.95,109.97,83.74,78.61,66.39,58.52,52.59,52.04,41.70,39.73,39.66,32.96,28.90,28.74,26.97,24.70,16.53.

实施例6

13-O-(2-甲酰苯甲酸-(3-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧)丁酯)-β-榄香烯的制备方法基本同实施例1，区别在于，将实施例1的步骤2)中的乙二醇替换为丁二醇，将实施例1的步骤3)中的丁二酸酐替换为邻苯二甲酸酐。

本实施例制得无色液体产物，得到无色液体产物，产率为81％。

所述13-O-(2-甲酰苯甲酸-(3-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧)丁酯)-β-榄香烯的结构表征结果如下：

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.16–7.99(m,2H),7.86–7.77(m,1H),7.77–7.65(m,2H),7.67–7.53(m,4H),5.82(dd,J＝17.8,10.5Hz,1H),5.15(s,1H), 5.07(s,1H),4.94(d,J＝3.4Hz,1H),4.89(d,J＝1.0Hz,1H),4.84(s,3H),4.59(s,1H),4.48(t,J＝5.9Hz,2H),4.41(t,J＝5.9Hz,2H),2.16–1.88(m,6H),1.71(s,3H),1.70–1.56(m,3H),1.55–1.42(m,3H),1.01(s,3H).

¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ167.23,166.53,158.42,149.47,147.52,146.87,137.53,135.15,131.96,131.10,130.87,130.58,129.20,128.55,128.28,128.03,111.78,110.79,109.59,70.43,66.77,64.39,52.10,41.22,39.26(2),32.53,26.52,24.80,24.43,24.35,16.07.

实施例7

13-O-(S-3-氨基-4-氧代丁酸-(3-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧)丁酯)-β-榄香烯的制备方法如下：

1)中间体1、式(Ⅲ，3-苯磺酰基-4-羟丁基醚-1,2,5-噁二唑-2-氧化物)的制备方法基本同实施例1，区别在于，将实施例1的步骤2)中的乙二醇替换为丁二醇；

2)将1mmol 13-β-榄香醇溶于10mL无水二氯甲烷，依次加入5mmol Boc-L-天冬氨酸、1.2mmol EDCI和0.1mmol DMAP，常温搅拌下反应8h；反应液以10％盐酸洗涤3次，浓缩二氯甲烷层得中间体粗品，柱层析纯化中间体粗品后将其溶于10mL无水二氯甲烷，依次加入1.1mmol 3-苯磺酰基-4-羟丁基醚-1,2,5-噁二唑-2-氧化物、1.2mmol EDCI和0.1mmol DMAP，常温反应4h，反应液以10％盐酸洗涤3次，浓缩二氯甲烷层，柱层析纯化后加入0.1ml三氟乙酸常温反应1h，减压浓缩反应液，所得产物粗品以二氯甲烷：甲醇＝50:1(V:V)柱层析纯化，得到淡黄色液体产物，产率为42％。

所述13-O-(S-3-氨基-4-氧代丁酸-(3-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧)丁酯)-β-榄香烯的结构表征结果如下：

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.12–8.00(m,2H),7.77(t,J＝7.5Hz,1H),7.63(t,J＝7.7Hz,2H),5.81(dd,J＝17.8,10.5Hz,1H),5.05(s,1H),5.03(s,1H),4.93(d,J＝3.1Hz,1H),4.88(d,J＝1.4Hz,1H),4.83(s,1H),4.64(s,2H),4.58(s, 1H),4.46(t,J＝6.1Hz,2H),4.21(t,J＝6.2Hz,2H),3.95–3.85(m,1H),2.92–2.71(m,2H),2.05(s,2H),2.03–1.90(m,4H),1.89–1.77(m,2H),1.71(s,3H),1.68–1.56(m,3H),1.54–1.42(m,3H),1.00(s,3H).

¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ173.28,170.63,158.42,149.41,147.46,146.83,137.50,135.16,129.20,128.04,111.79,110.77,109.61,70.41,66.43,63.55,52.10,50.77,41.25,39.24(2),38.25,32.50,26.51,24.69,24.47,24.34,16.07.

实施例8

13-O-(4-(3-氧代乙胺)-4-氧代丁酸-(3-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧)丁酯)-β-榄香烯的制备方法如下：

1)3-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧丁二酸单丁酯(式Ⅳ))的制备同实施例2；

2)将1mmol 13-β-榄香醇溶于10mL无水二氯甲烷中，依次加入1.2mmolBoc-β-甘氨酸、1.2mmol EDCI和0.1mmol DMAP，常温反应6h后反应液以10％盐酸洗涤3次，浓缩二氯甲烷层，柱层析浓缩物，然后加入0.1ml三氟乙酸常温反应1h，减压浓缩反应液，将浓缩所得中间体溶于10mL无水二氯甲烷中，依次加入1.2mmol 3-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧丁二酸单丁酯、1.2mmol EDCI和1.2mmol HBOt，常温反应4h，反应液以10％盐酸洗涤3次后浓缩二氯甲烷层，最后以石油醚：乙酸乙酯＝2:1(V:V)柱层析纯化浓缩物，得到淡黄色液体产物，产率为45％。

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.06(d,J＝7.3Hz,2H),7.76(t,J＝7.4Hz,1H),7.63(t,J＝7.6Hz,2H),6.19(s,1H),5.81(dd,J＝17.8,10.6Hz,1H),5.05(s,1H),5.03(s,1H),4.93(d,J＝3.3Hz,1H),4.88(s,1H),4.83(s,1H),4.65(s,2H),4.58(s,1H),4.46(t,J＝6.1Hz,2H),4.19(t,J＝6.2Hz,2H),4.08(d,J＝5.0Hz,2H),2.70(t,J＝6.4Hz,2H),2.58(t,J＝6.5Hz,2H),2.06–1.91(m,4H),1.87–1.81(m,2H),1.71(s,3H),1.68–1.55(m,3H),1.53–1.40(s,3H),1.00(s,3H).

¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ172.68,171.46,169.60,158.86,149.84,147.69,147.22,138.01,135.55,129.60,128.45,112.22,111.54,110.00,70.91,66.95,63.81,52.56,41.61,41.37,39.69,39.63,32.96,30.51,29.26,26.97,25.14,24.89,24.71,16.52.

实施例9

13-O-(4-(3-氧代丙胺)-4-氧代丁酸-(3-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧)丁酯)-β-榄香烯的制备方法基本同实施例8，区别在于，将步骤(2)中Boc-甘氨酸替换为Boc-β-丙氨酸。

本实施例制得淡黄色液体产物，产率为37％。

所述13-O-(4-(3-氧代丙胺)-4-氧代丁酸-(3-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧)丁酯)-β-榄香烯的结构表征结果如下：

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.14–7.99(m,2H),7.77(t,J＝7.5Hz,1H),7.64(t,J＝7.7Hz,2H),6.24(s,1H),5.81(dd,J＝17.8,10.5Hz,1H),5.04(s,1H),5.02(s,1H),4.93(d,J＝3.1Hz,1H),4.88(d,J＝1.4Hz,1H),4.83(s,1H),4.61(s,2H),4.58(s,1H),4.46(t,J＝6.2Hz,2H),4.18(t,J＝6.2Hz,2H),3.54(dd,J＝11.9,6.0Hz,2H),2.68(t,J＝6.7Hz,2H),2.59(t,J＝5.9Hz,2H),2.48(t,J＝6.7Hz,2H),2.06–1.91(m,4H),1.90–1.78(m,2H),1.71(s,3H),1.70–1.54(m,3H),1.53–1.40(m,3H),1.01(s,3H).

¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ172.33,171.85,170.76,158.43,149.43,147.62,146.85,137.51,135.16,129.20,128.04,111.79,110.63,109.60,70.46,65.87,63.32,52.11,41.23,39.26(2),34.39,33.52,32.51,30.34,28.87,26.52,24.72,24.47,24.33,16.07.

实施例10

13-O-(4-(S-α-甲基)氧代乙胺-4-氧代丁酸-(3-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧)丁酯)-β-榄香烯的制备方法基本同实施例8，区别在于，将步骤(2)中Boc-甘氨酸替换为Boc-L-丙氨酸。

本实施例制得淡黄色液体产物，产率为51％。

所述13-O-(4-(S-1-甲基)氧代乙胺)-4-氧代丁酸-(3-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧)丁酯)-β-榄香烯的结构表征结果如下：

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.06(d,J＝7.6Hz,2H),7.76(t,J＝7.4Hz,1H),7.63(t,J＝7.7Hz,2H),6.28(d,J＝6.9Hz,1H),5.81(dd,J＝17.7,10.6Hz,1H),5.05(s,1H),5.02(s,1H),4.93(d,J＝3.6Hz,1H),4.88(s,1H),4.82(s,1H),4.70–4.57(m,4H),4.46(t,J＝6.1Hz,2H),4.19(t,J＝6.0Hz,2H),2.73–2.63(m,2H),2.55(t,J＝6.5Hz,2H),2.03–1.93(m,4H),1.86–1.80(m,2H),1.70(s,3H),1.67–1.52(m,3H),1.49–1.41(m,6H),1.00(s,3H).

¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ172.59,172.53,170.85,158.74,149.72,147.67,147.09,137.88,135.47,129.51,128.31,112.10,111.16,109.88,70.81,66.76,63.67,52.47,48.03,41.55,39.58,39.51,32.84,30.47,29.16,26.87,25.01,24.77,24.60,18.15,16.42.

实施例11

13-O-(4-(S-1-(S-2-丁基)-2-氧代乙胺)-4-氧代丁酸-(3-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧)丁酯)-β-榄香烯的制备方法基本同实施例8，区别在于，将步骤(2)中Boc-甘氨酸替换为Boc-L-异亮氨酸。

本实施例制得淡黄色液体产物，产率为65％。

所述13-O-(4-(S-1-(S-2-丁基)-2-氧代乙胺)-4-氧代丁酸-(3-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧)丁酯)-β-榄香烯的结构表征结果如下：

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.13–7.99(m,2H),7.77(t,J＝7.5Hz,1H),7.64(t,J＝7.7Hz,2H),6.25(d,J＝8.6Hz,1H),5.81(dd,J＝17.8,10.5Hz,1H),5.07(s,1H),5.03(s,1H),4.93(d,J＝3.4Hz,1H),4.88(d,J＝0.9Hz,1H),4.83(s,1H),4.72–4.61(m,3H),4.58(s,1H),4.45(t,J＝6.2Hz,2H),4.19(t,J＝6.2Hz,2H),2.81–2.64(m,2H),2.64–2.54(m,2H),2.11–1.78(m,7H),1.71(s,3H),1.67–1.53(m,3H),1.53–1.37(m,3H),1.32–1.11(m,2H),1.01(s,3H),0.96–0.88(m,6H).

¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ172.31,171.26,170.62,158.42,149.43,147.27,146.81,137.51,135.17,129.20,128.03,111.79,111.27,109.60,70.46,66.45,63.37,56.01,52.15,41.00,39.26(2),37.51,32.45,30.34,28.90,26.46,24.70,24.57,24.46,24.34,16.06,14.98,11.18.

实施例12

13-O-(4-(S-1-苄基)-2-氧代乙胺)-4-氧代丁酸-(3-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧)丁酯)-β-榄香烯的制备方法基本同实施例8，区别在于，

将步骤(2)中Boc-甘氨酸替换为Boc-L-苯丙氨酸。

本实施例制得淡黄色液体产物，产率为58％。

所述13-O-(4-(S-1-苄基)-2-氧代乙胺)-4-氧代丁酸-(3-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧)丁酯)-β-榄香烯的结构表征结果如下：

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.09–7.98(m,2H),7.76(t,J＝7.5Hz,1H),7.62(t,J＝7.7Hz,2H),7.35–7.18(m,3H),7.16–7.07(m,2H),6.17(d,J＝7.7Hz,1H),5.81(dd,J＝17.8,10.5Hz,1H),5.03(s,2H),4.99–4.80(m,4H),4.71–4.52(m,3H),4.45(t,J＝6.2Hz,2H),4.17(t,J＝6.2Hz,2H),3.22–3.06(m,2H),2.70–2.60(m,2H),2.51(t,J＝6.6Hz,2H),2.05–1.91(m,4H),1.88–1.72(m,2H),1.71(s,3H),1.69–1.55(m,3H),1.54–1.39(m,3H),1.00(s,3H).

¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ172.21,170.78,170.35,158.43,149.44,147.09,146.83,137.53,135.29,135.17,129.21,128.82,128.08,128.04,126.64,111.84,111.42,109.62,70.47,66.65,63.38,52.75,52.06,41.02,39.23(2),37.41,32.47,30.18,28.73,26.47,24.71,24.46,24.36,16.07.

实施例13

13-O-(4-(2-氧代-S-环戊胺)-4-氧代丁酸-(3-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧)丁酯)-β-榄香烯的制备方法如下：

1)3-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧丁二酸单丁酯(式(Ⅲ))的制备同实施例2；

2)将1.5mmol的3-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧丁二酸单丁酯溶于10mL无水二氯甲烷中，依次加入2mmol草酰氯和1滴DMF，常温反应1.5h后浓缩反应液，制得酰氯中间体；

3)将1mmol 13-β-榄香醇溶于10mL无水二氯甲烷中，依次加入1.2mmolBoc-L-脯氨酸、1.2mmol EDCI和0.1mmol DMAP，常温反应6h后反应液以10％盐酸洗涤3次，浓缩二氯甲烷层，柱层析浓缩物，然后加入0.1ml三氟乙酸常温反应1h，减压浓缩反应液，将浓缩所得中间体溶于10mL无水二氯甲烷中，依次加入1.5mmol三乙胺，0.1mmol DMAP和步骤(2)中制得的酰氯中间体，常温反应2h，反应液以10％盐酸洗涤3次后浓缩二氯甲烷层，最后以石油醚：乙酸乙酯＝2:1(V:V)柱层析纯化浓缩物，得到淡黄色液体产物，产率为45％。

所述13-O-(4-(2-氧代-S-环戊胺)-4-氧代丁酸-(3-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧)丁酯)-β-榄香烯的结构表征结果如下：

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.06(d,J＝7.4Hz,2H),7.76(t,J＝7.2Hz,1H),7.63(t,J＝7.7Hz,2H),5.81(dd,J＝17.7,10.5Hz,1H),5.04(s,1H),4.99(s,1H),4.92(d,J＝4.0Hz,1H),4.88(s,1H),4.82(s,1H),4.69–4.63(m,1H),4.61–4.52(m,3H),4.45(t,J＝6.1Hz,2H),4.18(t,J＝6.0Hz,2H),3.68–3.54(m,2H),2.83–2.54(m,4H),2.26–2.14(s,1H),2.07–1.90(m,7H),1.85–1.79(m,2H),1.70(s,3H),1.67–1.53(m,3H),1.52–1.39(m,3H),1.00(s,3H).

¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ172.85,171.84,169.95,158.82,149.90,148.05,147.25,138.03,135.53,129.59,128.41,112.15,110.80,109.90,70.92,66.52,63.60,58.72,52.60,46.78,41.66,39.71,39.66,32.96,29.13,29.05,28.76,26.99,25.11,24.87,24.66,24.58,16.51.

药效学试验

1体外抗肿瘤活性评价试验

1.1实验设备与试剂

仪器 超净工作台(苏州艾可林净化设备有限公司)

恒温CO₂培养箱(日本SANYO)

酶联免疫检测仪(美国BIO-RAD)

倒置生物显微镜(日本OLYMPUS)

试剂 青、链霉素混合液(江苏凯基生物技术股份有限公司)

胰蛋白酶消化液(江苏凯基生物技术股份有限公司)

PBS(江苏凯基生物技术股份有限公司)

Calf Serum(杭州四季青生物工程材料有限公司)

DMEM(GIBCO)

MTT(BIOSHARP)

DMSO(SIGMA)

细胞株 人胃癌细胞SGC-7901(江苏凯基生物技术股份有限公司)

人宫颈癌细胞HeLa(江苏凯基生物技术股份有限公司)

人恶性胶质瘤U87(江苏凯基生物技术股份有限公司)

1.2实验方法

1)取对数生长期的受试细胞，经消化、计数，以5×10⁴个/mL的浓度接种于96孔培养板内，每孔内100μL(每孔4×10³个细胞)，于37℃，5％CO₂培养箱中培养24小时；

2)用10％Calf Serum/DMEM完全培养基稀释待测药物至不同浓度，每孔加入100μL相应的含药培养基，同时设立阴性对照组，溶媒对照组，阳性对照组；于37℃继续培养72h；

3)每孔加入20μL MTT(5mg/mL)溶液后于37℃继续培养4h后，弃去上清液，每孔加入150μL DMSO溶解，室温振荡10分钟后在酶标仪490nm处测量每个孔的吸光度值(OD值)，设A1(含200μL DMSO)为空白对照孔，以顺铂(CP)为阳性对照孔；利用下列公式(1)求得肿瘤细胞生长抑制率；所求结果代入IC₅₀计算软件SPSS17.0，求出IC₅₀值，其IC₅₀结果如表1所示。

式(1)

1.3试验结果

表1实施例1-13的衍生物对3种人类癌细胞株抗增殖活性的IC₅₀值(μM)

体外抗肿瘤活性评价显示，通过对β-榄香烯进行结构修饰，所得衍生物对受试细胞系表现出了较好的抑制活性，所有衍生物活性均明显强于榄香烯母核，并且大多化合物的活性强于阳性药顺铂。

2.一氧化氮体外释放试验

2.1实验设备与试剂

仪器 酶联免疫检测仪(美国BIO-RAD)

卧式恒温摇床(金坛市城西春兰仪器厂)

试剂 磷酸二氢钾(货号10017628，国药集团化学试剂有限公司)

磷酸氢二钾(货号20032118，国药集团化学试剂有限公司)

磺胺(货号30172216，国药集团化学试剂有限公司)

N-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐(货号80088013，国药集团化学试剂有限公司)

85％磷酸(货号10015408，国药集团化学试剂有限公司)

亚硝酸钠(货号10020028，国药集团化学试剂有限公司)

L-半胱氨酸(货号62007234，国药集团化学试剂有限公司)

DMSO(SIGMA)

2.2溶液的配制

1)pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)：50mM KH₂PO₄和50mM Na₂HPO₄溶于500mL蒸馏水中混匀；

2)空白溶液：10mL DMSO和190mL PBS混合；

3)Griess试剂：磺胺(sulfanilamide)4.0g、N-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐0.2g和10mL 85％的H₃PO₄溶于90mL蒸馏水中，搅拌至澄清溶液；

4)L-半胱氨酸溶液：半胱氨酸精确称量后，加入一定量的PBS，配制成200μM的溶液；

5)受试化合物溶液：受试化合物精确称量，用DMSO溶解并稀释至浓度为1mM，然后用PBS稀释，使其浓度为200μM；

2.3标准曲线的测定

用空白溶液分别配制亚硝酸钠标准溶液浓度:0，0.78,1.56,3.13,6.25,12.5,25,50,100μmol/L，各个浓度每次取150μL，分别加入50μL的Griess试剂混匀，在37℃恒温摇床中孵化30min小时后，酶标仪于540nm处测定各管吸光度，分别减去空白溶液读数后回归得标准曲线方程。

2.4试验方法

将配好的受试化合物溶液和L-半胱氨酸溶液各取2.5mL混合，在37℃恒温摇床中孵化120min，每个15min各取混合液150μL，分别加入50μL的Griess试剂混匀，在37℃恒温摇床中再孵化30min后，酶标仪于540nm处测定各管吸光度，分别减去空白溶液读数后将数值代入标准曲线，即求得NO释放量。

2.5试验结果

记录并统计实施例1-13制得的β-榄香烯衍生物于不同时间点的NO体外释放结果(如下表2)。

表2实施例1-13制得的β-榄香烯衍生物的NO体外释放结果

由表2数据可以看出，实施例1-13制得的β-榄香烯衍生物均具有优异的体外NO释放活性。

3体内抗肿瘤活性试验

3.1试验材料

雄性ICR小鼠5周,体重18-22g由上海灵畅生物科技有限公司提供

H22小鼠肝癌细胞 由江苏凯基生物技术股份有限公司提供

3.2试验方法

取ICR小鼠32只，收集培养的H22肝癌细胞，计数，调整使细胞悬液浓度为1.0×10⁷个/mL，于裸小鼠右侧腋窝皮下每只接种0.1mL细胞悬液；将接种后的小鼠随机分为4组，每组8只，分别记为模型组、β-榄香烯组、试验组(实施例1和实施例7)；所有小鼠均在接种第二天开始以尾静脉注射方式给药，每天1次，持续21次，给药21天后处理小鼠，通过手术剥离瘤块，称重。计算肿瘤抑制率(％)，用SPSS17.0对结果进行分析，组间用t检验进行统计学分析处理，其计算公式如下式(2)

式(2)

其中，β-榄香烯组和试验组溶液的配制方法如下：受试化合物用DMF溶解并配制成浓度为60mg/mL的母液，再将母液用溶媒(生理盐水：DMF：Tween80＝88:10:2)稀释至6mg/ml；

模型组是对小鼠注射同体积的溶媒；

β-榄香烯组是对小鼠注射β-榄香烯60mg/kg；

试验组是分别对小鼠注射由实施例1,实施例7制得的β-榄香烯衍生物60mg/kg。

3.3试验结果

各组小鼠体外抗肿瘤活性试验结果如下表3，

表3实施例1，实施例7制得的β-榄香烯衍生物体内抗肿瘤活性试验结果

由表3的数据明显可以看出，本申请实施例1,实施例7制得的β-榄香烯衍生物具有优异的体内抗肿瘤活性，在相同给药量的情况下，活性明显优于β-榄香烯；肿瘤生长抑制率可超过61％。

上述实施例仅作为说明的目的，本发明的范围并不受此限制。对本领域的技术人员来说进行修改是显而易见的，本发明仅受所附权利要求范围的限制。