通过PCR添加剂解决等位基因扩增不平衡的方法与流程

本发明属于基因扩增领域，涉及一种解决等位基因扩增不平衡的方法，具体涉及一种通过pcr添加剂解决等位基因扩增不平衡的方法。

背景技术：

pcr技术即基于聚合酶链式反应，是一种可以特异放大扩增特定基因片段的技术，可以使基因片段数万倍的增加。其原理的核心是寡核苷酸引物与单链dna模板中的一段互补序列结合杂交，形成部分双链，在dna聚合酶的作用下进行dna合成。而寡核苷酸引物与单链dna模板的结合是基于碱基配对原则：碱基配对遵循g(鸟嘌呤)：c(胞嘧啶)、a(腺嘌呤)：t(胸腺嘧啶)/u(尿嘧啶)的watson-crick碱基配对原则。

人体内每个细胞内有23对染色体，通常基因为双等位基因。进行普通pcr扩增时，两个等位基因一般情况下没有扩增效率的差异。但在复杂基因时，影响pcr扩增效率的因素会导致两个等位基因的扩增效率存在明显扩增差异，即等位基因扩增不平衡，严重时可出现一个等位基因扩增产量极少(扩增失败)，杂合的等位基因被错误的检测为纯合等位基因。例如hla基因就是典型的复杂基因，具有高gc含量、高度同源性，高度多态性等特点。目前，hla基因总数已经超过1万个，这些基因的有效扩增是hla高分辨分型的重要基础。但以上特点决定了hla基因的扩增引物设计特别困难以及扩增难度很高，容易出现hla基因非特异扩增、等位基因丢失或等位基因扩增不平衡等问题，即相应基因扩增效率低或失败(扩增不平衡)使杂合基因位点丢失一个等位基因，分型错误为纯合基因位点。

pcr过程中，两个等位基因的dna双链会发生解链。其中一个等位基因解链时，由于碱基配对，单链dna因自身序列碱基特点可能会形成复杂二级结构；或者由于序列碱基特点使dna双链解链不充分，这些对dna聚合酶延伸产生影响，从而影响pcr的扩增效率；但另外一个等位基因扩增效率却正常。这就导致了两个等位基因扩增效率的差异，即等位基因扩增不平衡。针对以上出现的等位基因扩增不平衡现象，现有技术采用如下策略进行解决：针对扩增效率低的等位基因设计特异性引物，使用特异性扩增的方式解决。

然而现有的解决方案存在着如下弊端：特异性扩增单个等位基因，在面临高度复杂的基因，例如hla基因，有大量的等位基因。有些等位基因会因复杂二级结构或解链不充分等导致扩增不平衡。如果采用发现一个等位基因扩增不平衡，就设计一条特异性引物策略，很快就会面临需要设计大量引物，引物设计极其困难的情况。

技术实现要素：

为了有效的解决等位基因扩增不平衡的问题，本发明提供了一种解决等位基因扩增不平衡的方法。

本发明所提供的解决等位基因扩增不平衡的方法，是针对由于“部分待测等位基因在pcr扩增过程中解链形成复杂二级结构或/和dna双链解链不充分，而其余待测等位基因扩增效率正常”而导致的等位基因扩增不平衡的情况的，具体可包括如下步骤：通过向原有pcr反应体系中加入pcr添加剂，来降低双螺旋dna的稳定性，使二级结构易于打开，dna聚合酶延伸时更加容易通过二级结构区，从而解决所述待测等位基因扩增不平衡的问题；所述原有pcr反应体系为：对所述待测等位基因进行pcr扩增，出现所述待测等位基因扩增不平衡情况时所采用的pcr反应体系。

其中，所述pcr添加剂是pcr反应中的一种增效剂，在pcr反应中传统上起到提高pcr反应的特异性、增加pcr扩增的产量及防止无效扩增等有益效果。

在所述方法中，所述pcr添加剂可为任意pcr添加剂中的任一种或任几种，例如：甜菜碱、甲酰胺、dmso等。

其中，向所述原有pcr反应体系中加入的所述pcr添加剂的量以达到所述待测等位基因扩增平衡，即等位基因扩增效率接近或一致为度。

所述方法中，在pcr扩增体系中，可以以浓度梯度形式，逐步增加所述pcr添加剂的量，一直增加至能使所述待测等位基因扩增平衡，即等位基因扩增效率接近或一致。

在所述方法中，所述待测等位基因可为任意基因，特别是高度复杂的基因，例如hla基因，具体如hla-dqb1基因。

在本发明中，所述待测等位基因具体为基因型分别为dqb1*03:03:02(imgt/hlaaccno:hla00629)和dqb1*06:01:01(imgt/hlaaccno:hla00643)的hla-dqb1基因。

在本发明的第一个实例中，是通过向所述原有pcr反应体系中加入0.4-0.6m的甜菜碱来解决所述待测等位基因(基因型分别为dqb1*03:03:02和dqb1*06:01:01的hla-dqb1基因)扩增不平衡的问题的。

在本发明的第二个实例中，是通过向所述原有pcr反应体系中加入1％-2.5％体积百分含量的甲酰胺来解决所述待测等位基因(基因型分别为dqb1*03:03:02和dqb1*06:01:01的hla-dqb1基因)扩增不平衡的问题的。

在本发明的第三个实例中，是通过向所述原有pcr反应体系中加入1％-5％体积百分含量的dmso来解决所述待测等位基因(基因型分别为dqb1*03:03:02和dqb1*06:01:01的hla-dqb1基因)扩增不平衡的问题的。

对所述基因型分别为dqb1*03:03:02和dqb1*06:01:01的hla-dqb1基因进行pcr扩增时，采用的引物对为由序列表中序列1和序列2所示的两条dna单链组成的引物对。

相应的，所述原有pcr反应体系具体参见实施例1。

对所述基因型分别为dqb1*03:03:02和dqb1*06:01:01的hla-dqb1基因进行pcr扩增时，扩增程序如下：96℃3min；96℃25s，60℃45s，72℃45s，35个循环；72℃5min；12℃保存。

本发明针对由于“部分待测等位基因在pcr扩增过程中解链形成复杂二级结构或/和dna双链解链不充分，而其余待测等位基因扩增效率正常”而导致的等位基因扩增不平衡的情况，提供了通过向原有pcr反应体系中加入一定浓度的pcr添加剂解决等位基因扩增不平衡的方法。实验证明，该方法确实可以有效的解决由于部分待测等位基因在pcr扩增过程中解链形成复杂二级结构或/和dna双链解链不充分，而其余待测等位基因扩增效率正常而导致的等位基因扩增不平衡。

附图说明

图1为对dqb1*03:03:02/dqb1*06:01:01组合样品进行pcr扩增时反应体系中加入不同浓度甜菜碱组的测序结果。

图2为对dqb1*03:03:02/dqb1*06:01:01组合样品进行pcr扩增时反应体系中加入不同浓度甲酰胺组的测序结果。

图3为对dqb1*03:03:02/dqb1*06:01:01组合样品进行pcr扩增时反应体系中加入不同浓度dmso组的测序结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例、通过pcr添加剂解决等位基因扩增不平衡

pcr添加剂是pcr反应中的一种增效剂，常见种类有甲酰胺、甜菜碱、dmso等。本发明研究发现，pcr添加剂可以降低双螺旋dna的稳定性，使二级结构易于打开，有助于dna聚合酶延伸通过二级结构区。对于pcr过程中，两个等位基因中的一个等位基因的单链形成复杂二级结构或dna双链解链不充分，导致两个等位基因扩增效率不一致即扩增不平衡的问题，可以加入一定浓度的类似甜菜碱的pcr添加剂来解决此类问题。

下面以具体实例对这种通过pcr添加剂解决等位基因扩增不平衡问题的方法进行阐述。

等位基因：基因型分别为dqb1*03:03:02(imgt/hlaaccno:hla00629)和dqb1*06:01:01(imgt/hlaaccno:hla00643)的hla-dqb1基因。

1、原有pcr引物、反应体系和反应程序

(1)pcr引物

用于扩增dqb1*03:03:02及dqb1*06:01:01等位基因的引物：

dqb-f：5’-tgattccccgcagaggatttcg-3’(序列1)；

dqb-r：5’-aggggcgacgacgctcacctc-3’(序列2)。

(2)反应体系：

(3)反应程序：

96℃3min；96℃25s，60℃45s，72℃45s，35个循环；72℃5min；12℃保存。

结果显示：采用如上原有pcr引物、反应体系和反应程序对基因型为dqb1*03:03:02/dqb1*06:01:01杂合型的hla-dqb1基因进行pcr扩增时，会产生等位基因扩增不平衡的情况，dqb1*03:03:02/dqb1*06:01:01组合中dqb1*03:03:02的测序峰很低，即出现了扩增不平衡的情况。如图1、图2、图3中“0m”/“0％”所示。

2、改变后的pcr扩增条件

扩增引物和pcr扩增反应程序完全同步骤1。

反应体系改为如下(1)或(2)或(3)：

(1)在步骤1的反应体系基础上，加入终浓度分别为0m、0.2m、0.4m、0.6m、0.8m、1.0m的甜菜碱。

(2)在步骤1的反应体系基础上，加入终浓度分别为0％、1％、1.25％、2.5％、5％的甲酰胺。其中，％表示体积百分含量。

(3)在步骤1的反应体系基础上，加入终浓度分别为0％、1％、5％、10％、12％的dmso。其中，％表示体积百分含量。

结果显示：采用改变后的pcr扩增条件对基因型为dqb1*03:03:02/dqb1*06:01:01杂合型的hla-dqb1基因进行pcr扩增，在不加入pcr添加剂(0m/0％浓度)的情况下，杂合位点dqb1*03:03:02的测序峰很低；随着pcr添加剂浓度的增大，dqb1*03:03:02测序峰相对高度逐渐升高，dqb1*06:01:01测序峰相对高度逐渐降低。在甜菜碱浓度为0.4m-0.6m范围、甲酰胺浓度为1％-2.5％、dmso浓度在1％-5％内，2个等位基因测序峰高无明显差异。分别如图1、图2、图3所示。

<110>北京博奥晶典生物技术有限公司；成都博奥晶芯生物科技有限公司

<120>通过pcr添加剂解决等位基因扩增不平衡的方法

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