一种可直接对微小核糖核酸(microRNA)进行半定量的探针的制作方法

文档序号:12645203阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种可直接对微小核糖核酸(microRNA)进行半定量的探针,用于对总RNA中的某一种微小核糖核酸(microRNA)进行半定量检测,其特征在于:所述的可直接对微小核糖核酸(microRNA)进行半定量的探针具有一种由人工创造的非天然空间结构,命名为“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”,这是一种新型的核苷酸空间结构,由两个核苷酸相邻的二级结构组成,这种空间结构在特定条件下通过与靶序列的特异性结合,引起探针自身的两个二级结构依次变形,变形为一种“单链-双链-单链-双链”不完整双螺旋结构,且变形过程不可逆,探针初始的“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”不是DNA链置换酶能够催化的空间结构,而变形后的一种“单链-双链-单链-双链”不完整双螺旋结构是DNA链置换酶能够催化的空间结构。

2.根据权利要求1所述的一种可直接对微小核糖核酸(microRNA)进行半定量的探针,其特征在于:所述的“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”,由两个相邻的核苷酸二级结构组成,分别是“多功能茎环结构”和“单侧3’悬端双螺旋结构”,由A、B链两条长度不同的寡核苷酸单链组装而成,A链较长,B链较短。

3.根据权利要求1或2所述的一种可直接对微小核糖核酸(microRNA)进行半定量的探针,其特征在于:所述的“多功能茎环结构”是一种由普通茎环结构衍生出来的新型茎环结构,由A链按照碱基互补原则单独组装而成,含有三个结构域,分别是外环结构、“占位茎杆结构”和线状单链结构;外环结构是由A链中间区域的与靶序列完全互补核苷酸序列组成,空间结构是一条环状闭合单链,它的功能是与靶序列特异性结合,结合后将导致“占位茎杆结构”被破坏,茎环结构消失;“占位茎杆结构”是由A链近5’端的核苷酸序列和与外环结构3’端方向最后一个核苷酸相邻的核苷酸序列为起点,按照碱基互补原则形成的双螺旋结构,“占位茎杆结构”的近5’端的核苷酸占领了下游待结合B链的近3’端的结合位点,导致B链与A链结合后,B链的3’端无位点结合,成为3’悬端,它的功能不仅是维持茎环结构,增强外环结构对靶序列的识别能力,还是形成“单侧3’悬端双螺旋结构”的必需结构;线状单链结构由A链近3’端核苷酸序列形成,是按照碱基互补原则设计成的B链互补序列,空间构象是线状单链,它的功能是固定B链在探针中的位置。

4.根据权利要求1或2所述的一种可直接对微小核糖核酸(microRNA)进行半定量的探针,其特征在于:所述的“单侧3’悬端双螺旋结构”是一种受“多功能茎环结构”调控的单侧3’端核苷酸游离的双螺旋结构,由A链的“占位茎杆结构”、线状单链结构和B链共同组成,B链一级结构的3’端核苷酸结合位点与A链一级结构近5’端核苷酸的结合位点重合,结合在A链的线状单链结构区,若“多功能茎环结构”完整,则“单侧3’悬端双螺旋结构”存在,若“多功能茎环结构”被破坏,则“单侧3’悬端双螺旋结构”将变形为普通双螺旋结构。

5.根据权利要求1所述的一种可直接对微小核糖核酸(microRNA)进行半定量的探针,其特征在于:所述的这种空间结构在特定条件下通过与靶序列的特异性结合,是指在常规核酸杂交缓冲液中,杂交温度在50-65 ℃之间,能够触发核苷酸二级结构发生变形,使探针从初始“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”变形为一种“单链-双链-单链-双链”不完整双螺旋结构的唯一条件,这个唯一条件是探针的“多功能茎环结构”中的外环结构与靶序列发生特异性结合。

6.根据权利要求1所述的一种可直接对微小核糖核酸(microRNA)进行半定量的探针,其特征在于:所述的引起探针自身的两个二级结构依次变形,探针自身的两个二级结构依次变形的顺序,核苷酸二级结构变形起始于“多功能茎环结构”的外环结构与靶序列的特异性结合,二者结合形成的双螺旋导致“占位茎杆结构”这个双螺旋被打开,在“多功能茎环结构”消失的同时暴露了原本由“占位茎杆结构”占领的B链3’端核苷酸结合位点,引起“单侧3’悬端双螺旋结构”的3’悬端与结合位点结合,变为普通的双螺旋结构,整个变形过程不可逆。

7.根据权利要求1所述的一种可直接对微小核糖核酸(microRNA)进行半定量的探针,其特征在于:所述的一种“单链-双链-单链-双链”不完整双螺旋结构,特指在满足特定条件的杂交体系中,“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”与靶序列结合变形的产物,在特定条件下变形的最终产物的空间结构,由A链、靶序列、B链组成;A链的外环结构序列在靠近自身的5’端区域与靶序列形成双螺旋,A链的线状单链结构在自身的3’端与B链形成双螺旋,这两个双螺旋之间的区域和A链的5’端是原“占位茎杆结构”被打开后的单链;故从A链的5’端起,描述该变形产物的空间构象为一种“单链-双链-单链-双链”不完整双螺旋结构。

8.根据权利要求1所述的一种可直接对微小核糖核酸(microRNA)进行半定量的探针,其特征在于:所述的探针初始的“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”不是DNA链置换酶能够催化的空间结构,而变形后的一种“单链-双链-单链-双链”不完整双螺旋结构是DNA链置换酶能够催化的空间结构,所述的DNA链置酶是一种具有5´→3´ 的聚合酶活性,可在互补链存在的情况下,沿着5’→3’方向延伸单链DNA或RNA,生成双链,但没有 5´→3´ 核酸外切酶活性的酶,当延伸方向遇到已结合序列时,在与互补链形成新双链的同事使原结合序列完整的游离,而不会将其剪切成单个核苷酸,这种特性被称为链置换活性;由于“由多功能茎环结构维持的单侧3’悬端双螺旋结构”的3’端是游离的悬端,无互补链,故DNA链置换酶不能催化这种核苷酸空间结构;而对结合了靶序列的一种“单链-双链-单链-双链”不完整双螺旋结构的3’端是与互补链结合的3’端,DNA链置换酶能够催化这种核苷酸空间结构,发生链延伸及链置换反应,生成以A链为模板的完整双螺旋结构,使已结合的靶序列重新游离,能够周而复始的与初始形态的探针结合,不断引发探针变形,直至全部探针变成以A链为模板的完整双螺旋结构。

9.根据权利要求1所述的一种可直接对微小核糖核酸(microRNA)进行半定量的探针,其特征在于:所述的荧光基团与淬灭基团的修饰位置,荧光基团修饰在探针A链的5’端核苷酸上,淬灭基团修饰在5’端的互补位核苷酸或相邻的核苷酸上,也可以将荧光基团与淬灭基团位置互换。

10.根据权利要求1所述的一种可直接对微小核糖核酸(microRNA)进行半定量的探针,其特征在于:所述的所述的一种可直接对微小核糖核酸(microRNA)进行半定量的探针的工作原理是,“靶序列启动的自身信号循环放大反应”:初始结构的探针(无荧光信号)→靶序列的出现→与探针结合后引发探针变形(变形后发出荧光信号,非靶序列不引起探针变形)→链延伸→链置换(初始结构探针不会发生链延伸及链置换反应)→靶序列重新游离→再次引起其它初始形态的探针变形(自身信号循环放大)。

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