一种高通量配对捕获单细胞/单颗粒的微流控芯片及其应用的制作方法

本发明涉及一种微流控芯片，具体涉及高通量配对捕获单细胞/单颗粒的微流控芯片。

背景技术：

细胞是生命体的组成以及生命活动的最基本单位。传统方法对大量细胞平均信号的分析处理使得信号的平均化模糊了人们对大脑、血液系统、免疫系统，及其组成这些系统的细胞之间异质性(heterogeneity)的认识。随着高通量测序技术的发展，单细胞测序技术已经成为单细胞分析最重要的手段之一，它极大的提高了单细胞分析的效率和准确性。对单细胞基因水平的分析可以揭示细胞(特别是癌细胞)基因组中发生的突变以及结构变异，了解细胞之间对于药物的响应的差异性，找到与这些病变细胞相关的特异性分子，给现代的个性化治疗提供一个重要的手段，可以更好的指导医学工作者对疾病的诊断和治疗，实现真正的疾病个性化治疗。

对单细胞分析来说，其面临的挑战主要有两点，首先是对单细胞分离技术的要求，如何快速高效地分离单细胞；其次是由于单细胞中所含有的分析靶标量太少，因此我们在分析之前需要对其进行信号放大，在这一个过程中，常常会遇到样品丢失或放大偏差性的问题，导致出现大量实验不平行的现象，而且在细胞数目较多时，需要大量的重复操作，极其耗时，导致实验通量无法提升。

微流控芯片把生物和化学等相关领域中的样品制备、反应、分离、检测及细胞培养、分选、裂解等基本操作单元集成或基本集成到一块几平方厘米(甚至更小)的芯片上,由微通道形成网络，以可控流体贯穿整个系统，用来代替常规化学或生物实验室的各种功能的一种技术平台。在微流控芯片中，试剂消耗量从ml和μl级可减少到nl和fl级，可以大大减少昂贵的生化试剂而降低分析成本，且反应时间也从几小时缩短到几秒甚至更短。因此，微流控芯片特别适合于单细胞分析研究。

但是现有的微流控芯片无法实现对少量稀有细胞的单细胞俘获，而且无法同时对大量单细胞进行高通量分析。比如cell文章(macoskoetal.，2015,cell：161，1202-1214)报道的drop-seq的方法，单细胞的俘获是基于泊松分布原理，大部分的液滴没有细胞，只有～1％的液滴含有单个细胞，再结合微球的泊松分布，有效分析目标进一步减少，只能实现对大量实际样品中少量细胞的分析，这样可能会忽略掉样品中一些重要的细胞个体。另外drop-seq的方法只适合分析对象数目较多的样品，对于一些稀有细胞(比如循环肿瘤细胞)，由于其样品中细胞数量太少(10-100/ml血液)，无法用该方法来实现单细胞分析。

为了解决以上问题，我们提出了设计了一种用于高通量捕获单颗粒并可对两个单颗粒配对的微流控芯片。该芯片可以高效的捕获单颗粒，单颗粒的捕获效率高，两个单颗粒的配对效率高。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种高通量配对捕获单细胞/单颗粒的微流控芯片，可以高效率高通量的捕获单颗粒/细胞。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明所述的微流控芯片由捕获层、控制层、载片层组成。捕获层设计有微通道，包括两个颗粒/细胞捕获通道、连接通道。颗粒/细胞捕获通道中含有多个单颗粒/细胞捕获单元，每个单元包括流路、储液腔室、捕获通道三部分，捕获通道的宽度小于待捕获颗粒/细胞的直径，可以捕获单个颗粒/细胞，每个流路还有一个位于前部的颗粒/细胞入口、一个位于末端的油相入口和一个位于末端的颗粒/细胞出口。连接通道连接两个配对的颗粒/细胞捕获单元的储液腔体。

控制层设有微通道，由微通道组成阻隔泵，位于连接通道正下方或上方。隔离泵通道只含有一个入口。

本发明的一个优选的实施方式中，通道的尺寸有具体使用和分析的颗粒和细胞的大小决定。一般的，捕获通道宽度可以是5-500微米，例如：10微米、20微米、50微米、80微米、100微米、200微米、300微米或者400微米；深度可以是5-500微米，例如10微米、20微米、50微米、80微米、100微米、200微米、300微米或者400微米；连接通道的宽度可以是3-100微米，例如5微米、10微米、20微米、50微米、60微米、70微米、80微米或者90微米；连接通道深度可以是3-100微米，例如5微米、10微米、20微米、50微米、60微米、70微米、80微米或者90微米。

本发明的一个优选的实施方式中，所述的颗粒/细胞的直径在5-200μm，可以是微米尺寸的任意微球或细胞，可以是微球与微球的配对，可以是细胞与细胞的配对，可以是微球与细胞之间的配对。

本发明的一个优选的实施方式中，所述的颗粒的直径可以是5-200μm，例如5微米、10微米、15微米、20微米、30微米、70微米、80微米或者90微米。

本发明的一个优选的实施方式中，所述的细胞的直径可以是5-100μm，例如5微米、10微米、15微米、20微米、30微米、70微米、80微米或者90微米。

本发明的微流控芯片所用捕获层和载片的材料也可以是硅片、玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯和聚酯等，驱动层的材料也可以是聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯和聚酯等。

本发明的一个优选的实施方式中，所用捕获层和驱动层的材料可以为聚二甲基硅氧烷pdms，载片材料可以为玻璃。

本发明的一个优选的实施方式中，捕获层和控制层通过热校准可逆键合在一起，之后再与玻片通过等离子体键合。

本发明的一个优选的实施方式中，颗粒通入的流速为0.005ml/h-10ml/h，例如0.01ml/h、0.05ml/h、0.1ml/h、0.2ml/h、0.5ml/h、0.8ml/h、1ml/h以及2ml/h。

本发明的一个优选的实施方式中，隔离泵所充满的物质可以为水溶液、油或者空气，采用控制注射泵的压力，控制隔离泵的压力。

本发明的一个优选的实施方式中，所述的微流控芯片基本工作流程为：

步骤a：在隔离泵入口(3)注满溶液，增加注射泵压力，隔离泵(12)形变，隔膜(18)挤压连接通道最上层，直到连接通道(13)被完全阻断开，从通道入口(1)用注射泵通入颗粒/细胞悬浮液，当单颗粒/单细胞进入捕获单元(8)时，因为流体从流道(10)经过的路径大于从储液腔室(14)，颗粒/细胞会先进入储液腔室(14)，由于捕获通道(16)小于颗粒/细胞，颗粒/细胞被卡在捕获通道(16)前，同时堵住捕获通道(16)，流经储液腔室(14)的流体流速趋近于零，此时后续的颗粒/细胞无法再次进入该储液腔室(14)，只能通过流道(10)进入下一个捕获单元，这样就实现了单颗粒/细胞的捕获。在后续的颗粒/细胞捕获单元中重复该过程，即可实现高通量单颗粒/细胞的捕获。

步骤b：保持连接通道(13)关闭状态，在颗粒/细胞通道入口(2)用注射泵通入颗粒/细胞悬浮液，与步骤a类似可以在并行的另一个颗粒/细胞通道中实现高通量单颗粒/细胞的捕获。具体过程如下：从通道入口(2)用注射泵通入颗粒/细胞悬浮液，当单个颗粒/细胞进入捕获单元(9)时，因为流体从流道(11)经过的路径大于从储液腔室(15)，颗粒/细胞会先进入储液腔室(15)，由于捕获通道(17)小于颗粒/细胞，颗粒/细胞被卡在捕获通道(17)前，同时堵住捕获通道(17)，流经储液腔室(15)的流体流速趋近于零，此时后续的颗粒/细胞无法再次进入该储液腔室(15)，只能通过流道(11)进入下一个捕获单元。在后续的颗粒/细胞捕获单元中重复该过程，即可实现该流道内高通量单颗粒/细胞的捕获。同时实现了两个单颗粒/细胞的高通量配对捕获。

步骤c：分别在两个入口通入下一步各自需要的试剂，洗去通道中残余的颗粒/细胞，同时将原始溶液替换为所需要的溶液。

步骤d：拔去入口(1)管子，关闭出口(7)，在入口(4)用注射泵通入油相，当油相进入捕获单元(8)时，由于捕获通道(16)远小于流道(10)，其毛细阻力较大，因此油相进入流道(10)而不进入捕获通道(16)并将溶液从捕获腔室(14)入口处切断，此时储液腔室的溶液被保留，形成一个油包水的液滴，液滴中含有单颗粒/细胞，从而将单个颗粒/细胞隔离在储液腔室中。当油相流通完整个芯片时，所有的单颗粒/细胞均被隔离在单个油包水液滴中，形成独立的反应单元，且相邻的液滴被油相隔开，不会相会干扰。

步骤e：在拔去入口(1)管子的同时，与步骤d类似，拔去入口(2)管子，在入口(5)用注射泵通入油相，当油相进入捕获单元(9)时，由于捕获通道(17)远小于流道(11)，其毛细阻力较大，因此油相进入流道(11)而不进入捕获通道(17)并将溶液从捕获腔室(15)入口处切断，此时储液腔室的溶液被保留，形成一个油包水的液滴，液滴中含有单颗粒/细胞，这样就实现了在并行的捕获通道中的单颗粒/细胞隔离在单个油包水液滴中，形成独立的反应单元，且相邻的液滴被油相隔开，不会相会干扰。

步骤f：关闭隔离泵(12)，此时连接通道(13)被打开。此时并行通道中包裹颗粒/细胞的配对液滴联通，由于扩散作用，储液腔室(14，15)里面的物质可以相互交换，经过一段时间后可充分反应，这样就实现了高通量配对颗粒/细胞之间的独立反应。

步骤g：将捕获层与控制层剥离开，捕获在腔室中的颗粒/细胞被暴露在芯片的表面，用缓冲溶液将其洗脱下来，进行后续的分析研究。

由于采用了以上技术方案，使本发明具备的有益效果在于：

1.本发明采用微流控技术，具有高通量、易集成、易自动化优点，体积小，消耗试剂少，节约成本。

2.颗粒/细胞捕获效率高，尤其在颗粒/细胞数量较少的时候，可以实现高效率的捕获，颗粒/细胞损失很少，特别适用于稀有样品的分析，比如循环肿瘤细胞(ctc)、干细胞等稀有细胞的分析。

3.单颗粒/细胞捕获效率高，由于颗粒/细胞的捕获原理是基于颗粒/细胞尺寸和流体动力学，在完成单个颗粒/细胞的捕获后，后续的颗粒/细胞不会再次被同一个捕获单元捕获，只能进入后续的捕获单元，因此该芯片单颗粒/细胞捕获效率高，尤其适合单细胞分析。

4.单颗粒/细胞占有率高，在有限颗粒/细胞数目的条件下可以使得绝大多数捕获单元捕获有单颗粒/细胞，能够根据芯片捕获单元的数目控制单颗粒/细胞捕获数目。

5.两个单颗粒/细胞配对效率高，能够实现对所有捕获的靶标进行分析，有效性较高。

附图说明

图1芯片整体结构俯视图，其中1、2是颗粒/细胞入口，3是隔离泵入口，4、5是颗粒/细胞通道油相入口，6、7是颗粒/细胞出口。

图2芯片放大结构示意图，其中8、9是颗粒/细胞捕获单元，10、11是颗粒/细胞流路通道，12是隔离泵通道，13是连接通道。

图3颗粒/细胞配对捕获单元俯视图，其中10、11是颗粒/细胞流路通道，12是隔离泵通道，13是连接通道，14、15是颗粒/细胞捕获单元储液腔室，16、17是颗粒/细胞捕获通道。

图4颗粒/细胞配对捕获单元截面图，其中13是连接通道，14、15是颗粒/细胞储液腔室，12是隔离泵通道，18是间隔薄膜。

图5压力驱动芯片整体结构俯视图，其中21、22是颗粒/细胞入口，23是隔离泵入口，24、25是颗粒/细胞驱动泵入口，26、27是颗粒/细胞出口，28、29是颗粒/细胞通道油相入口。

图6压力驱动芯片放大结构示意图，其中51、52是颗粒/细胞捕获单元，30、31是颗粒/细胞流路通道，34是隔离泵通道，35是连接通道。

图7压力驱动芯片颗粒/细胞配对捕获单元俯视图，其中30、31是颗粒/细胞流路通道，38、39是颗粒/细胞捕获单元储液腔室，40、41是颗粒/细胞捕获单元驱动形变腔室，34是隔离泵通道，32、33是颗粒/细胞驱动泵控制网络通道，36、37是颗粒/细胞捕获通道，35是连接通道。

图8压力驱动芯片颗粒/细胞配对捕获单元截面图，其中35是连接通道，38、39是颗粒/细胞储液腔室，40、41是细胞驱动泵形变腔室，34是隔离泵通道，42、43和44是间隔薄膜，32、33是颗粒/细胞驱动泵控制网络通道。

图9芯片配对捕获单微球/单细胞图，其中左图显示显微镜明场下微球的捕获情况，右图显示显微镜荧光场下与相应微球配对捕获的细胞的捕获情况(其中细胞用钙黄绿素染色)。

图10配对单微球/单细胞液滴形成图，其显示单微球/单细胞可以很好的隔离在各自的储液腔室中。

图11单微球/单细胞捕获效率与配对效率，其显示该芯片对单微球/单细胞有很高的捕获效率，并且配对效率高。

图12液滴的分隔与混合，其中图a中细胞流路形成不含有荧光的液滴，而微球流路形成含有荧光液滴，两个配对液滴可以很好的分隔开；b图显示打开隔离泵后，配对液滴之间可以十分完全的混合，配对液滴之间的荧光趋于一致。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式以微球和细胞的配对捕获为例，并应用于平行的裂解单细胞以及单细胞mrna平行捕获，对本发明做进一步详细说明。

实施例1

如图所示，本发明用于高通量配对捕获单微球和单细胞，该芯片由标准软光刻技术加工，包括捕获层、控制层、载片三部分。捕获层由细胞流道(10)、微球流道(11)、连接通道(13)三部分组成，控制层由隔离通道(12)组成。其中细胞流道含有多个串联的细胞捕获单元(8)，每个单元由流道(10)、储液腔室(14)、捕获通道(16)三部分组成；参见图3，流道(10)包括u形管(在其它实施例中，也可以是弧形或其其它曲折形状)，前一单元的u形管的左臂端连接后一单元的u形管的右臂端，u形管之间的连接部分为直管，储液腔室(14)位于u形的两臂之间，且设有三条通道，第一通道直径大于待捕获的单微球/单细胞，通往u形管右臂，第二通道(捕获通道16)直径小于捕获的单微球/单细胞，通往u型管的左臂；第三通道为连接通道(13)，直径小于捕获的单微球/单细胞，通往微球捕获单元储液腔室(15)。

微球流道含有多个串联的微球捕获单元(9)，微球捕获单元(9)和细胞捕获单元对称设置，每个单元由流道(11)、储液腔室(15)、捕获通道(17)三部分；参见图3，流道(11)包括u形管，前一单元的u形管的左臂端连接后一单元u形管的右臂端，u形管之间的连接部分为直管，储液腔室(15)位于u形的两臂之间，且设有三条通道，第一通道直径大于待捕获的单微球/单细胞，通往u形管右臂，第二通道(捕获通道17)直径小于捕获的单微球/单细胞，通往u型管的左臂；第三通道为连接通道(13)，直径小于捕获的单微球/单细胞，通往细胞捕获单元的储液腔室(14)。

控制层内设有隔离通道(12)；隔离通道(12)位于连接通道(13)下方，垂直于连接通道(13)(在其它实施例中，也可以为一定的夹角)，并由隔膜(18)隔开；隔离通道(12)连接一隔离泵，通过改变隔离通道(12)的压力阻断或连通连接通道(参见图4)；细胞流道含有一个细胞入口(1)和油相入口(4)以及一个出口(7)，微球流道含有一个微球入口(2)和油相入口(5)以及一个出口(6)，隔离通道(12)只含有一个入口(3)。

作为本发明的优选实施方式，所述的细胞流道宽度为60μm，储液腔室直径为100μm，细胞捕获通道宽度为6μm，通道深度为46μm，细胞捕获单元为720个。

作为本发明的优选实施方式，所选用的细胞为a549细胞，细胞直径为10-20μm。

作为本发明的优选实施方式，所述的微球流道宽度为60μm，储液腔室直径为100μm，微球捕获通道宽度为15μm，通道深度为46μm，微球捕获单元为720个。

作为本发明的优选实施方式，所选用的聚苯乙烯微球，直径为40μm。

作为本发明的优选实施方式，所选用的聚苯乙烯微球上含有mrna捕获序列t30，t30可以与带有polya尾巴的mrna杂交。

作为本发明的优选实施方式，控制层中所述的隔离通道宽度为30μm，高度为30μm。

作为本发明的优选实施方式，所述的所有入口均为圆柱形孔，直径为1.00mm。

作为本发明的优选实施方式，所述的捕获层和控制层的材料均为聚二甲基硅氧烷pdms。

作为本发明的优选实施方式，所述的载片的材料为玻璃。

作为本发明的优选实施方式，隔离通道都充满水溶液，通过控制注射泵的驱动的压力，控制隔离泵压力。

作为本发明的优选实施方式，所选用的细胞流速为0.04ml/h。

作为本发明的优选实施方式，所选用的微球流速为0.2ml/h。

作为本发明的优选实施方式，所选用的油相流速为0.1ml/h。

作为本发明的优选实施方式，本发明的具体工作过程为：

步骤a：打开隔离泵，隔离通道(12)压力增大，隔膜(18)向上变形，此时连接通道(13)被关闭，在细胞流道入口(1)用注射泵通入细胞a549悬浮液，当单个细胞进入细胞捕获单元(8)时，首先细胞进入储液腔室(14)，由于捕获通道小于细胞，细胞被卡在捕获通道(16)中，同时堵住捕获通道，此时流经储液腔室(14)的流体流速趋近于零，后续的细胞无法再次进入该细胞储液腔室，只能通过流道(10)进入下一个捕获单元，这样就实现了单细胞的捕获。在后续的细胞捕获单元中重复该过程，即可实现高通量单细胞的捕获。

步骤b：在微球流道入口(2)用注射泵通入微球悬浮液，当单个微球进入微球捕获单元(9)时，首先微球进入储液腔室(15)，由于捕获通道小于微球，微球被卡在捕获通道(17)中，同时堵住捕获通道，此时流经储液腔室(15)的流体流速趋近于零，后续的微球无法再次进入该微球储液腔室，只能通过流道(18)进入下一个捕获单元，这样就实现了单微球的捕获。在后续的微球捕获单元中重复该过程，即可实现高通量单微球的捕获。这样就实现了单细胞单微球的高通量配对捕获。

步骤c：保持连接通道(13)关闭状态，细胞通道入口(1)继续通入pbs溶液，在微球通道入口(2)通入细胞裂解液(0.2％tritonx-100)，将通道中的多余的细胞和微球冲洗出芯片，并且将微球通道溶液替换为细胞裂解液。

步骤d：拔去细胞入口(1)管子，堵住细胞出口(7)，在细胞油相入口(4)用注射泵通入氟油(fc40)，氟油进入细胞捕获单元(8)时，由于捕获通道(16)远小于流道，其毛细阻力较大，因此氟油进入流道(10)而不进入捕获通道(16)，此时细胞储液腔室的溶液被保留，形成一个油包水的液滴，液滴中含有单个细胞，从而将单个细胞隔离在储液腔室中。当氟油流通完整个芯片时，所有的单细胞均被隔离在单个油包水液滴中。

步骤e：拔去微球入口(2)管子，堵住微球出口(6)，在微球油相入口(5)用注射泵通入氟油(fc40)，氟油进入微球捕获单元(9)时，由于捕获通道(17)远小于流道，其毛细阻力较大，因此氟油进入流道(11)而不进入捕获通道(17)，此时微球储液腔室的溶液被保留，形成一个油包水的液滴，液滴中含有单个微球，从而将单个微球隔离在储液腔室中。当氟油流通完整个芯片时，所有的单微球均被隔离在单个油包水液滴中，液滴中含有细胞裂解液。

步骤f：关闭隔离泵(12)，此时连接通道(13)被打开。此时包裹细胞和微球的配对液滴联通，微球腔室中的细胞裂解液可以通过扩散作用进入细胞腔室进行细胞裂解，细胞裂解后其含有的细胞内含物也可以通过扩散作用进入微球腔室，其中细胞内含物中的带有polya尾巴的mrna可以与微球上的t30杂交，经过一段时间后两个配对腔室之间的物质充分交换，可以实现细胞的完全裂解和单细胞mrna的提取，由于配对单微球/单细胞之间被fc40隔离，细胞之间、微球之间没有物理接触，故没有交叉污染，因此可以实现高通量单个微球捕获单个细胞的mrna。。

步骤g：将捕获层揭下，捕获在腔室中的微球或者细胞被暴露在芯片的表面，用缓冲溶液将其洗脱下来，对提取出的单细胞mrna继续进行后续的分析研究。

实施例2：

实施例1中，两个配对液滴之间的物质交换是通过被动的扩散实现的，其交换速度较慢，为了加快两个配对液滴之间的物质交换，在实施例1的基础上增加了两个驱动泵用于控制两个液滴之间的混合，控制液滴在两个配对腔体之间的分配。

下面结合附图和具体实施方式以微球和细胞的配对捕获为例对本发明做进一步详细说明。

如图所示，本发明用于高通量配对捕获单微球和单细胞，该芯片由标准软光刻技术加工，包括捕获层、控制层、载片三部分。捕获层由细胞流道(21)、微球流道(22)、连接通道(35)三部分组成，控制层由隔离通道(34)、细胞驱动网道(32)、细胞驱动泵(40)、微球驱动网道(33)、微球驱动泵(41)组成。

其中细胞流道含有多个细胞捕获单元(51)，每个单元由细胞流道(30)、储液腔室(38)、捕获通道(36)三部分组成，其结构和连接方式同实施例1；微球流道含有多个微球捕获单元(52)，每个单元由微球流道(31)、储液腔室(39)、捕获通道(37)三部分组成；其结构和连接方式同实施例1，连接通道(35)连接细胞捕获单元储液腔室(38)和微球捕获单元储液腔室(39)；

隔离通道(34)层位于连接通道(35)下方，垂直于连接通道(35)，通过改变隔离通道(34)的压力阻断或连通连接通道；细胞驱动泵(40)层位于细胞储液腔室(38)下方，微球驱动泵(41)层位于微球储液腔室(39)下方，通过改变驱动泵的压力，控制细胞储液腔室和微球储液腔室的体积，加快细胞捕获单元和微球捕获单元的物质交换；细胞流道含有一个细胞入口(21)和油相入口(29)以及一个出口(27)，微球流道含有一个微球入口(22)和油相入口(28)以及一个出口(26)，隔离泵只含有一个入口(23)，细胞驱动泵只含有一个入口(25)，微球驱动泵只含有一个入口(24)。

作为本发明的优选实施方式，所述的细胞流道宽度为60μm，储液腔室直径为100μm，细胞捕获通道宽度为6μm，通道深度为46μm，细胞捕获单元为720个。

作为本发明的优选实施方式，所选用的细胞为a549细胞，细胞直径为10-20μm。

作为本发明的优选实施方式，所述的微球流道宽度为60μm，储液腔室直径为100μm，微球捕获通道宽度为15μm，通道深度为46μm，微球捕获单元为720个。

作为本发明的优选实施方式，所选用的聚苯乙烯微球，直径为40μm。

作为本发明的优选实施方式，所选用的聚苯乙烯微球上含有mrna捕获序列t30，t30可以与带有polya尾巴的mrna杂交。

作为本发明的优选实施方式，控制层中所述的隔离泵通道和驱动泵通道宽度为30μm，高度为30μm。

作为本发明的优选实施方式，所述的所有入口均为圆柱形孔，直径为1.00mm。

作为本发明的优选实施方式，所述的捕获层和控制层的材料均为聚二甲基硅氧烷pdms。

作为本发明的优选实施方式，所述的载片的材料为玻璃。

作为本发明的优选实施方式，隔离泵通道和驱动泵通道都充满水溶液，通过控制注射泵的驱动的压力，控制隔离泵和驱动泵压力。

作为本发明的优选实施方式，所选用的细胞流速为0.04ml/h。

作为本发明的优选实施方式，所选用的微球流速为0.2ml/h。

作为本发明的优选实施方式，所选用的油相流速为0.02ml/h。

作为本发明的优选实施方式，本发明的具体工作过程为：

步骤a：增加隔离泵(23)压力，此时连接通道(35)被关闭，在细胞流道入口(21)用注射泵通入细胞悬浮液，当单个细胞进入细胞捕获单元(51)时，首先细胞进入储液腔室(38)，由于捕获通道小于细胞，细胞被卡在捕获通道(36)中，同时堵住捕获通道，此时流经储液腔室(38)的流体流速趋近于零，后续的细胞无法再次进入该细胞储液腔室，只能通过细胞流路(30)进入下一个捕获单元，这样就实现了单细胞的捕获。在后续的细胞捕获单元中重复该过程，即可实现高通量单细胞的捕获。

步骤b：在微球流道入口(22)用注射泵通入微球悬浮液，当单个微球进入微球捕获单元(52)时，首先微球进入储液腔室(39)，由于捕获通道小于微球，微球被卡在捕获通道(37)中，同时堵住捕获通道，此时流经储液腔室(39)的流体流速趋近于零，后续的微球无法再次进入该微球储液腔室，只能通过微球流路(31)进入下一个捕获单元，这样就实现了单微球的捕获。在后续的微球捕获单元中重复该过程，即可实现高通量单微球的捕获。这样就实现了单细胞单微球的高通量配对捕获。

步骤c：保持连接通道(35)关闭状态，细胞通道入口(21)继续通入pbs溶液，在微球通道入口(22)通入细胞裂解液(0.2％tritonx-100)，将通道中的多余的细胞和微球冲洗出芯片，并且将微球通道溶液替换为细胞裂解液。

步骤d：拔去细胞入口(21)管子，堵住细胞出口(27)，在细胞油相入口(29)用注射泵通入氟油(fc40)，氟油进入细胞捕获单元(51)时，由于捕获通道(36)远小于细胞流路，其毛细阻力较大，因此氟油进入细胞流路(30)而不进入捕获通道(36)，此时细胞储液腔室的溶液被保留，形成一个油包水的液滴，液滴中含有单个细胞，从而将单个细胞隔离在储液腔室中。当氟油流通完整个芯片时，所有的单细胞均被隔离在单个油包水液滴中。

步骤e：拔去微球入口(22)管子，堵住微球出口(26)，在微球油相入口(28)用注射泵通入氟油(fc40)，氟油进入微球捕获单元(52)时，由于捕获通道(37)远小于微球流路(31)，其毛细阻力较大，因此氟油进入微球流路(31)而不进入捕获通道(37)，此时微球储液腔室的溶液被保留，形成一个油包水的液滴，液滴中含有单个微球，从而将单个微球隔离在储液腔室中。当氟油流通完整个芯片时，所有的单微球均被隔离在单个油包水液滴中，液滴中含有细胞裂解液。

步骤f：关闭隔离泵(34)，此时连接通道(35)被打开。此时包裹细胞和微球的配对液滴联通，增加微球驱动网路(33)的压力，此时微球形变腔室(41)变大，薄膜(44)凸起，微球储液腔室(39)体积减小，其中的细胞裂解液泵向细胞储液腔室(38)，同时减小细胞驱动网路(32)的压力，此时细胞形变腔室(40)减小，薄膜(42)凹陷，细胞储液腔室(38)体积变大，微球储液腔室(39)的溶液也被泵向细胞储液腔室(38)；当减小微球驱动网路(33)的压力，此时微球形变腔室(41)减小，薄膜(44)凹陷，微球储液腔室(39)体积变大，其中的溶液泵向微球储液腔室(39)，同时增大细胞驱动网路(32)的压力，此时细胞形变腔室(40)变大，薄膜(42)凸起，细胞储液腔室(38)体积变小，细胞储液腔室(38)的溶液也被泵向微球储液腔室(39)；如此循环几次，可以实现细胞储液腔室(38)和微球储液腔室(39)的物质快速交换。微球腔体中的细胞裂解液可以对于之配对的细胞进行裂解，细胞裂解后，其释放的带有的polya尾巴的mrna可以进入微球捕获腔体与微球上的t30杂交，由于配对单微球/单细胞之间被fc40隔离，细胞之间、微球之间没有物理接触，故没有交叉污染，因此可以实现高通量单个微球捕获单个细胞的mrna。

步骤g：将捕获层揭下，捕获在腔室中的微球或者细胞被暴露在芯片的表面，用缓冲溶液将其洗脱下来，进行后续的分析研究。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及详细方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明白，对本发明的任何改进，对本发明选用组分的等效替换、具体方式的选择等，均属于本发明的保护范围和公开范围之内。