一种二氧化硫近红外‑双光子比率荧光探针及其制备方法与流程

本发明涉及一种快速响应二氧化硫(so2)，具有近红外-双光子效应的比率荧光探针及其制备方法，属于有机小分子荧光探针领域。

背景技术：

二氧化硫(so2)长期被视为一种环境污染物，其产生途径大部分是由化石燃料（如煤炭、石油）的燃烧、含硫矿物（如黄铁矿）的冶炼等生成。近年来，大气污染愈演愈烈，“雾霾”这个词已是众所周知，二氧化硫作为雾霾的主要成分之一，在环境中被进一步氧化转变为硫酸，造成酸雨。其衍生物（亚硫酸盐和亚硫酸氢盐）应用广泛。作为还原剂，常应用于医药和有机合成中；作为稳定剂和抗氧化剂，应用于葡萄酒的发酵；作为防腐剂，应用于食品添加剂中。然而，流行病学研究发现长期接触二氧化硫不仅会引起呼吸道疾病，同时也可引发心血管疾病，肺癌及神经系统失调。二氧化硫与空气中的其他气体或颗粒发生反应产生硫酸盐气溶胶，被人体吸入，导致一系列呼吸系统疾病和心血管疾病等，传统中药硫磺蒸熏后残留的二氧化硫及硫酸盐对呼吸道、胃肠道、神经系统等均有不同程度的危害，过量摄入二氧化硫易导致不良反应和急性症状，如潮红，低血压，腹泻，荨麻疹和腹痛。由于环境及药物的成分复杂，且其中so2及其衍生物的含量低，因而急需开发一种灵敏度高、选择性好且成本低的方法，用于快速测定so2含量。

检测so2及其衍生物方法主要有:比色法、化学发光法和色谱法等。其中比色法和化学发光法灵敏度低且选择性差，色谱等方法设备昂贵操作繁琐。与这些方法相比，荧光探针法操作简单、选择性好且灵敏度高，是检测复杂样品中so2及其衍生物的备选技术，此外，结合共聚焦显微镜可实现细胞成像分析，用于生物分子可视化检测。

目前，针对检测二氧化硫的分子荧光探针已有文献报道，但这些常见的荧光探针多有背景干扰、响应时间较长、散射干扰等缺陷，这样有可能影响在复杂生理环境中对二氧化硫检测的应用。

技术实现要素：

为了解决以上技术问题，本发明提出了一种快速检测二氧化硫的荧光探针(nc-so2)，并对该探针进行生物成像。利用本发明检测细胞、斑马鱼内的二氧化硫，对其中的二氧化硫水平进行评估。

本发明所述的快速检测二氧化硫的荧光探针命名为：12-(n,n-二乙胺基)-7-(n,n-二乙胺基)香豆素并[4,3-b]色烯。

化学结构式为：

。

(i)

上述双光子荧光探针的合成方法如下：称量一定量的丙二酸（1）和苯酚（2）置于反应瓶中，0℃下缓慢滴加三氯氧磷（3），滴加完毕后，整个反应体系在115℃下加热搅拌，1.5小时，将反应体系倒入水中，用乙酸乙酯萃取，干燥乙酸乙酯萃取液后，减压蒸除乙酸乙酯，得到浅棕色的油状丙二酸二苯酯（4），该化合物不需要进一步纯化直接进行下一步；量取适量的丙二酸二苯酯（4）和间二乙氨基苯酚（5）于反应瓶，再加入适量甲苯后，整个反应体系加热回流7小时，静置降温，减压过滤，滤饼用少量正己烷洗涤，真空干燥的到浅黄色的固体4-羟基-7-二乙胺基香豆素（6）；氮气氛围中，在15℃以下，将n,n-二甲氨基甲酰胺（dmf）缓慢滴加到适量的三氯氧磷（3）中，向上述溶液中缓慢滴4-羟基-7-二乙胺基香豆素（6）的dmf溶液，60℃下搅拌12小时后，将反应体系倒入冰水中，使用氢氧化钠水溶液调节ph直到有大量固体析出，减压过滤，水洗，干燥后得到4-氯-7-二乙胺基香豆素-3-甲醛（7）；将适量的4-氯-7-二乙胺基香豆素-3-甲醛（7）和间二乙氨基苯酚（5）溶解在适量的乙酸中，整个反应体系在150℃下反应2h，而后加入适量的高氯酸，在慢慢向其中加入蒸馏水，有大量固体析出，减压过滤，水洗，真空干燥，得到12-(n,n-二乙胺基)-7-(n,n-二乙胺基)香豆素并[4,3-b]色烯（8）。简称：nc-so2。

上述探针的制备反应式如下：

机理：

实验证明，本发明所述的快速识别二氧化硫的荧光探针的水溶液，在二氧化硫存在下，所发射的荧光由645nm（近红外）变成了450nm，具有双光子特性，该现象说明探针对二氧化硫有响应，这一现象为生物成像的应用奠定了可靠的理论基础。可以预见能够在二氧化硫的检测中发挥重要作用。

本发明根据亚硫酸氢或亚硫酸盐的亲核性，制备了含有碳碳双键的近红外探针，亚硫酸氢或亚硫酸盐通过亲核加成进攻不饱和ｃ＝ｃ键，释放香豆素荧光，并且识别后的探针具有双光子性能。通过动力学实验证明，该探针识别速度极快，在2秒内已达到平衡状态。此外，该探针成功应用于细胞成像，同时也是首次用于斑马鱼成像，在生物体分析检测中显示出很大的优越性。

附图说明

图1：探针的核磁表征：¹hnmr谱和¹³cnmr谱；

图2：探针在磷酸缓冲液中的吸收光谱图。探针浓度：5µm；

图3：探针所检测不同浓度的亚硫酸氢钠的滴定实验；其中激发波长为380nm；探针的浓度：5µm；

图4：探针在磷酸缓冲液中的选择性。其中激发波长为380nm；探针的浓度：5µm，选择性离子的浓度为2.5mm；

图5：探针的细胞成像应用。激发波长：405nm,发射波段：425-475nm和570-620nm；

图6：探针的斑马鱼成像应用。激发波长：405nm,发射波段：425-475nm和570-620nm。

具体实施方式

下面通过实施例和附图对本发明进行说明，但本发明不受实施例的限制，实施例中的化合物号码对应上述化合物中的号码。

实施例1

化合物丙二酸二苯酯（4）的合成

在0℃下，将11g丙二酸（1）（106mmol）和20g苯酚（2）（212mmol），加入装有12ml的三氯氧磷（3）的烧瓶中，搅拌均匀后，升温到115℃，加热搅拌2小时，将反应体系倒入150ml冰水中，使用乙酸乙酯萃取，用无水硫酸钠干燥乙酸乙酯层后，减压除去乙酸乙酯，得到浅棕色油状的化合物丙二酸二苯酯（4），该产物无需提纯，直接进行下一步反应。

化合物4-羟基-7-二乙胺基香豆素（6）的合成

。

称量13g丙二酸二苯酯（4）（50mmol）于反应瓶，加入50ml甲苯，搅拌下加入8.25g间二乙氨基苯酚（5）（50mmol），加热回流7小时后冷却到室温，有固体析出，减压过滤，使用正己烷洗涤，干燥，乙醇重结晶，得到青色固体4-羟基-7-二乙胺基香豆素（6），产率67%。

¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ11.92(s,1h),8.57(d,j=8.8hz,1h),6.66(dd,j1=9.2hz,j2=2.4hz,1h),6.45(d,j=2.4hz,1h),5.25(s,1h),3.41(q,j=7.2hz,4h),1.12(t,j=6.8hz,6h)。

化合物4-氯-7-二乙胺基香豆素-3-甲醛（7）的合成

。

氮气氛围下，在0℃下，将3mldmf缓慢滴加到3ml三氯氧磷（3）中。维持温度，继续搅拌30分钟后，将上述溶液缓慢滴加到2.33g4-羟基-7-二乙胺基香豆素（6）（10mmol）的dmf溶液（10ml）中。反应体系加热（60℃）搅拌12小时后倒入100ml冰水中，用20%-30%的氢氧化钠水溶液调节ph直至有大量固体析出。减压过滤，水洗，真空干燥。滤饼使用乙醇重结晶得到橙色固体4-氯-7-二乙胺基香豆素-3-甲醛（7），产率：79%。

¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ11.08(s,1h),7.82(d,j=9.6hz,1h),6.93(dd,j1=9.6hz,j2=4.2hz,1h),6.64(d,j=2.8hz,1h),3.53(q,j=7.2hz,4h),1.16(t,j=6.8hz,6h).

化合物12-(n,n-二乙胺基)-7-(n,n-二乙胺基)香豆素并[4,3-b]色烯（8）的合成

。

称量0.28g4-氯-7-二乙胺基香豆素-3-甲醛（7）（1mmol）和0.165g间二乙氨基苯酚（5）（1mmol）于5ml乙酸中，150℃下加热搅拌2小时后，向反应体系中加入2ml70%的高氯酸，然后慢慢向反应体系中滴加蒸馏水，析出大量固体，减压过滤，水洗真空干燥后，粗产物经过柱色谱提纯（使用二氯甲烷和甲醇为淋洗剂），得到蓝紫色固体12-(n,n-二乙胺基)-7-(n,n-二乙胺基)香豆素并[4,3-b]色烯（8），简称：nc-so2。产率：27%。核磁共振图谱如图1。

¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ8.95(s,1h),8.05(t,j=9.2hz,2h),7.40(dd,j1=9.6hz,j2=2.4hz,1h),7.33(d,j=1.8hz,1h),7.06(dd,j1=9.6hz,j2=2.4hz,1h),6.08(d,j=2.0hz,1h),3.75(q,j=6.8hz,4h),3.62(q,j=7.2hz,4h),1.26(m,6h),1.20(t,j=6.8hz,6h);¹³cnmr(100mhz,dmso-d6)δ162.40,158.25,158.02,157.82,157.76,155.70,144.03,134.15,128.39,116.62,116.30,112.18,104.49,100.43,98.88,97.42,77.24,65.33,45.85,12.62。

实施例2

化合物nc-so2二氧化硫荧光探针的吸收光谱测试

配制浓度为1mm的本发明所述检测二氧化硫的荧光探针nc-so2的二甲基亚砜(dmso)的测试母液溶液待用。

测试液中，量取适量的本发明所述检测二氧化硫的荧光探针nc-so2于2个5ml容量瓶中，并加适量dmso，使用磷酸缓冲（pbs，ph=7.4）定容，其中一个加入适量亚硫酸氢钠。使得测试液中，探针的浓度为5μm，测试使用的亚硫酸氢钠的浓度为5μm，其中含体积分数为5%的dmso。进行吸收光谱测试。（结果见图2）

实施例3

不同浓度的亚硫酸氢钠对化合物nc-so2二氧化硫荧光探针的滴定检测。

配制浓度为1mm的本发明所述检测二氧化硫的荧光探针nc-so2的二甲基亚砜(dmso)的测试母液溶液待用。

配制探针终浓度为5μm，含5%dmso溶液的pbs溶液，分别与不同浓度的亚硫酸氢钠（0-10μm）充分作用，进行荧光检测（λex=380nm,λem=450nm，645nm）。得各体系中荧光强度，建立荧光强度与亚硫酸氢钠浓度标准曲线。如图3所示，随着亚硫酸氢钠浓度的增加，450nm处的荧光强度逐渐增加，645nm处的荧光强度逐渐降低，当亚硫酸氢钠浓度达到5μm时，反应体系荧光强度达到饱和状态。

实施例4

化合物nc-so2二氧化硫荧光探针对不同离子和活性小分子、氨基酸的选择性

配制浓度为1mm的本发明所述检测二氧化硫的荧光探针nc-so2的二甲基亚砜(dmso)的测试母液溶液待用。配制浓度为100mm的各种不同离子，氨基酸和活性氧/活性氮溶液作为备用。

在5ml的容量瓶里加入25μl探针母液、225μldmso和500当量的各离子溶液或1000当量的各氨基酸溶液，用磷酸缓冲液定容，摇匀后进行荧光检测（λex=380nm,λem=450nm，645nm），建立荧光强度与各离子的柱状图(结果见图4),测试离子的浓度为2.5mm，氨基酸的浓度为5mm，活性氧活性氮浓度为100μm。测试溶液的荧光发射光谱，由图4可以发现，其他离子(或氨基酸)对探针nc-so2的荧光几乎没有影响。

实施例5

化合物nc-so2二氧化硫荧光探针的细胞成像测试

将适当密度的hela细胞接种到两个灭菌的35mm成像培养皿中，在co2培养箱（温度为37℃，5%co2）中培养，待细胞贴壁后，向培养皿中加入本发明所述检测二氧化硫的荧光探针nc-so2，使其终浓度均为5μm。继续培养0.5h，弃掉培养基，用pbs缓冲液冲洗细胞3次，其中一个加入适量亚硫酸氢钠水溶液，终浓度为5μm，孵育0.5h后，加入本发明所述检测二氧化硫的荧光探针nc-so25μm，弃掉培养基，用pbs缓冲液冲洗细胞3次，随后进行成像实验，如图5所示，只加入探针时，细胞具有很强的红色荧光，加入亚硫酸氢钠后，细胞红色荧光消失，产生强烈的蓝色荧光信号。（结果见图5）。

实施例6

化合物nc-so2二氧化硫荧光探针的斑马鱼成像测试

将脱卵3天的斑马鱼分为两组，分别放入35mm培养皿中。其中一组加入20μm亚硫酸氢钠孵育10min后，加入10μm本发明的探针；另一组加入10μm本发明的探针，分别在28°c下培养30min，pbs缓冲液冲洗3次，共聚焦显微镜下成像。如图6所示，只加入探针时，斑马鱼具有很强的红色荧光，加入亚硫酸氢钠后，细胞红色荧光消失，产生强烈的蓝色荧光信号。（结果见图6）。