本发明涉及一种利用微生物转化制备香兰素的方法，特别涉及一种芽孢杆菌(bacillussp.)dlf-15161制备香兰素的方法。
背景技术：
香兰素(vanillin)，又名香草醛、香荚兰素，化学名称为3-甲氧基-4羟基苯甲醛，分子量为152.15。香兰素具有浓郁的奶香气，可作为香味剂或矫味剂应用于食品、日化及烟草行业中，是世界上产量最大的香料品种。香兰素也是一种重要的医药中间体，此外还可用于植物生长促进剂、催熟剂等。
目前市场上供应的香兰素有三种：化学法合成的香兰素、天然提取香兰素和微生物转化制备的香兰素。其中化学合成的香兰素约占据市场份额的90％，市场价格为12～15美元/公斤，合成的路线包括很多种，可以通过松柏苷、丁子香酚、对羟基苯甲醛、对甲苯酚、邻苯二酚、木质素及愈创木酚等原料合成，化学方法制得的香兰素其香型单一，易掺杂质，产品的安全性不确定，且在合成过程中污染严重。天然提取的香兰素是从香荚兰中提取，然而香荚兰的种植区域有限，产量受气候影响大，实际每年的产量只有20～50吨，得到的香兰素价格非常昂贵，价格高达4000美元/公斤，使其限制了天然香兰素的广泛应用。微生物转化法是以细胞或酶作为生物催化剂来制备合成目标产物的方法。与化学催化剂相比，生物催化剂具有更强的专一性和催化活性，反应条件温和，反应过程更容易控制等优点。利用微生物转化法制备的香兰素与植物中提取的天然香兰素在香味效果及安全性方面基本等同，符合美国食品药物管理局(fda)对天然香精的使用安全要求，被称为生物香兰素(biologicvanillin)。微生物转化法制备的香兰素的前体包括阿魏酸、木焦油醇、丁香酚、异丁香酚、葡萄糖等，其中阿魏酸是一个很有应用前景的底物。阿魏酸来源广泛且价格低廉，多以麸皮、谷壳等廉价的农副产品生产制得。因此，可以预见以阿魏酸为底物生物合成香兰素具有巨大的潜力。
以阿魏酸为底物，利用生物转化制备合成香兰素的微生物菌种有很多，包括土壤丝菌、凝结芽孢杆菌、植生拉乌尔菌、桑肠杆菌、拟无枝酸菌、西唐氏链霉菌、黑曲霉和朱红密孔菌等，但目前的研究中多采用微生物发酵的方式，即微生物培养与微生物转化同时进行。然而，高浓度的底物和产物都对微生物生长具有较强的抑制作用，最终导致微生物生长速率慢、发酵周期较长、目标产物产量低、转化率低；虽然也有采用流加底物的方式进行发酵培养，最终获得的产量浓度较高，但通常需要更长的发酵时间。
本发明利用一株芽孢杆菌dlf-15161，通过预先培养得到微生物湿菌体，以湿菌体作为生物催化剂进行转化阿魏酸合成香兰素，避免微生物受到高浓度底物和产物的抑制作用，缩短微生物的培养时间，因此总体上可以降低生物催化剂的成本，提高生产效率。
技术实现要素：
本发明目的是提供一株芽孢杆菌dlf-15161(bacillussp.dlf-15161)，以及用其进行微生物全细胞转化阿魏酸合成香兰素。
本发明采用的技术方案是：
芽孢杆菌dlf-15161(bacillussp.dlf-15161)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏日期2016年11月24日，保藏编号cctccno:m2016674。
一种利用芽孢杆菌dlf-15161制备香兰素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
第一步，以发酵培养后的芽孢杆菌dlf-15161湿菌体为催化剂，以阿魏酸为底物，所述催化剂、底物与水或缓冲液构成转化体系，转化体系的ph6.5～8.5，进行转化反应，转化反应的反应温度为20～40℃，反应时间为24～120h；所述转化体系中底物阿魏酸的初始浓度为0.2～20g/l；所述转化体系中催化剂芽孢杆菌dlf-15161湿菌体的浓度为10～100g/l，所述芽孢杆菌dlf-15161湿菌体的含水质量百分数为80～90％。
第二步，转化反应结束后，将转化液离心，上清液即为含有香兰素的反应液，将反应液经过滤，超滤，滤液浓缩，取浓缩液调节ph5.0～6.0，降温结晶，晶体再经过洗涤，过滤，干燥，得到所述的香兰素。
进一步地，所述催化剂制备包括如下步骤：
(1)活化培养：将甘油管冷冻保存的bacillussp.dlf-15161菌株接种到活化培养基上，30～40℃下培养24～48小时；所述活化培养基的终浓度组成为：蛋白胨1～5g/l，酵母膏1～5g/l，葡萄糖5～20g/l，磷酸二氢钾1～3g/l，mgso40.1～1g/l，cacl20.1～0.2g/l，琼脂15～20g/l，溶剂为水，ph6.5～7.5；
(2)种子培养：从活化培养的斜面上挑取一环菌体，接种至种子培养基中，在摇床转数150～250rpm、30～40℃下恒温振荡培养至菌株的对数生长期，得到种子液；所述的种子培养基的终浓度组成为：蛋白胨1～5g/l，酵母膏1～5g/l，葡萄糖5～20g/l，磷酸二氢钾1～3g/l，mgso40.1～1.0g/l，cacl20.1～0.2g/l，mnso40.05～0.2g/l，fecl30.02～0.06g/l，溶剂为水，ph6.5～7.5；
(3)发酵培养：将步骤(2)得到的种子液，按照体积1～5％的接种量接种到发酵培养基中，在摇床转数150～250rpm、30～40℃培养1～3天，取发酵液于8000～12000rpm离心，收集湿菌体；所述发酵培养基的终浓度组成为：酵母膏1～5g/l，葡萄糖10～50g/l，磷酸二氢钾1～5g/l，mgso40.1～1.0g/l，cacl20.1～0.2g/l，mnso40.05～0.2g/l，fecl30.02～0.06g/l，溶剂为水，ph6.5～7.5。
更进一步地，所述催化剂制备中活化培养ph7.0～7.2；种子培养ph7.0～7.2；发酵培养ph7.0～7.2。
进一步地，上述转化体系的ph7.0～7.2。
本发明的有益效果是：提供了一种利用芽孢杆菌dlf-15161全细胞生物催化阿魏酸制备香兰素的方法，该合成条件温和，产品安全性高，操作流程简单，对环境友好，具有良好的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：菌株bacillussp.dlf-15161湿菌体的制备
(1)活化培养：将甘油管冷冻保存的bacillussp.dlf-15161菌株接种于活化培养基上，30℃下培养48小时；活化培养基配方为：蛋白胨1g/l，酵母膏1g/l，葡萄糖5g/l，磷酸二氢钾1g/l，mgso40.1g/l，cacl20.1g/l，琼脂15g/l，溶剂为水，ph6.5。
(2)种子培养：用接种环挑取一环步骤(1)得到的菌体，接种至种子培养基中，在摇床转数150rpm、30℃下恒温振荡培养24小时，得到种子液；种子培养基的配方为：蛋白胨1g/l，酵母膏1g/l，葡萄糖5g/l，磷酸二氢钾1g/l，mgso40.1g/l，cacl20.1g/l，mnso40.05g/l，fecl30.02g/l，溶剂为水，ph6.5。
(3)发酵培养：将步骤(2)得到的种子液，按照体积1％的接种量接种到发酵培养基中，在摇床转数150rpm、30℃培养1天，取发酵液于8000rpm离心20min，收集湿菌体，湿菌体的产量为21g/l，湿菌体含水量为81％。发酵培养基的配方为：酵母膏1g/l，葡萄糖10g/l，磷酸二氢钾1g/l，mgso40.1g/l，cacl20.1g/l，mnso40.05g/l，fecl30.02g/l，溶剂为水，ph6.5。
实施例2：菌株bacillussp.dlf-15161湿菌体的制备
(1)活化培养：将甘油管冷冻保存的bacillussp.dlf-15161菌株接种于活化培养基上，40℃下培养24小时；活化培养基配方为：蛋白胨5g/l，酵母膏5g/l，葡萄糖20g/l，磷酸二氢钾3g/l，mgso41g/l，cacl20.2g/l，琼脂20g/l，溶剂为水，ph7.5。
(2)种子培养：用接种环挑取一环步骤(1)得到的菌体，接种至种子培养基中，在摇床转数250rpm、40℃下恒温振荡培养15小时，得到种子液；种子培养基的配方为：蛋白胨5g/l，酵母膏5g/l，葡萄糖20g/l，磷酸二氢钾3g/l，mgso41g/l，cacl20.2g/l，mnso40.2g/l，fecl30.06g/l，溶剂为水，ph7.5。
(3)发酵培养：将步骤(2)得到的种子液，按照体积5％的接种量接种到发酵培养基中，在摇床转数250rpm、40℃培养3天，取发酵液于12000rpm离心15min，收集湿菌体，湿菌体的产量为146g/l，湿菌体含水量为87％。发酵培养基的配方为：酵母膏5g/l，葡萄糖50g/l，磷酸二氢钾5g/l，mgso41g/l，cacl20.2g/l，mnso40.2g/l，fecl30.06g/l，溶剂为水，ph7.5。
实施例3：菌株bacillussp.dlf-15161湿菌体的制备
(1)活化培养：将甘油管冷冻保存的bacillussp.dlf-15161菌株接种于活化培养基上，37℃下培养36小时；活化培养基配方为：蛋白胨3g/l，酵母膏2g/l，葡萄糖10g/l，磷酸二氢钾2g/l，mgso40.5g/l，cacl20.15g/l，琼脂15g/l，溶剂为水，ph7.0。
(2)种子培养：用接种环挑取一环步骤(1)得到的菌体，接种至种子培养基中，在摇床转数180rpm、37℃下恒温振荡培养24小时，得到种子液；种子培养基的配方为：蛋白胨3g/l，酵母膏2g/l，葡萄糖10g/l，磷酸二氢钾2g/l，mgso40.5g/l，cacl20.15g/l，mnso40.1g/l，fecl30.04g/l，溶剂为水，ph7.0。
(3)发酵培养：将步骤(2)得到的种子液，按照体积2％的接种量接种到发酵培养基中，在摇床转数180rpm、37℃培养2天，取发酵液于10000rpm离心20min，收集湿菌体，湿菌体的产量为124g/l，湿菌体含水量为85％。发酵培养基的配方为：酵母膏3g/l，葡萄糖40g/l，磷酸二氢钾3g/l，mgso40.5g/l，cacl20.15g/l，mnso40.1g/l，fecl30.04g/l，溶剂为水，ph7.0。
实施例4：菌株bacillussp.dlf-15161湿菌体的制备
(1)活化培养：将甘油管冷冻保存的bacillussp.dlf-15161菌株接种于活化培养基上，37℃下培养36小时；活化培养基配方为：蛋白胨3g/l，酵母膏2g/l，葡萄糖10g/l，磷酸二氢钾2g/l，mgso40.5g/l，cacl20.15g/l，琼脂15g/l，溶剂为水，ph7.2。
(2)种子培养：用接种环挑取一环步骤(1)得到的菌体，接种至种子培养基中，在摇床转数180rpm、37℃下恒温振荡培养24小时，得到种子液；种子培养基的配方为：蛋白胨3g/l，酵母膏2g/l，葡萄糖10g/l，磷酸二氢钾2g/l，mgso40.5g/l，cacl20.15g/l，mnso40.1g/l，fecl30.04g/l，溶剂为水，ph7.2。
(3)发酵培养：将步骤(2)得到的种子液，按照体积2％的接种量接种到发酵培养基中，在摇床转数180rpm、37℃培养1天，取发酵液于10000rpm离心20min，收集湿菌体，湿菌体的产量为82g/l，湿菌体含水量为83％。发酵培养基的配方为：酵母膏3g/l，葡萄糖40g/l，磷酸二氢钾3g/l，mgso40.5g/l，cacl20.15g/l，mnso40.1g/l，fecl30.04g/l，溶剂为水，ph7.2。
实施例5：香兰素的制备
湿菌体的制备同实施例1。在转化瓶中加入100ml蒸馏水，其中含有湿菌体10g，底物阿魏酸0.2g，在40℃条件下转化24h，反应结束后，离心取上清液获得含有香兰素的反应液。上清液用0.45μm微滤膜过滤，滤液用高效液相色谱仪进行检测，香兰素含量为0.17g，底物转化率为85％。将反应液100ml(含有香兰素0.17g)，室温下离心或过滤，滤液浓缩至10ml，调节ph至5.0，冷却至0℃，过滤，结晶用无水乙醇洗涤，过滤，干燥，获得香兰素(0.15g)，总提取收率为88.2％。
实施例6：香兰素的制备
湿菌体的制备同实施例2。在转化瓶中加入100ml磷酸盐缓冲溶液(ph6.5，0.1m)，其中含有湿菌体10g，底物阿魏酸0.5g，在20℃条件下转化48h，反应结束后，离心取上清液获得含有香兰素的反应液。上清液用0.45μm微滤膜过滤，滤液用高效液相色谱仪进行检测，香兰素含量为0.39g，底物转化率为78％。将反应液100ml(含有香兰素0.39g)，室温下离心或过滤，滤液浓缩至10ml，调节ph至6.0，冷却至0℃，过滤，结晶用无水乙醇洗涤，过滤，干燥，获得香兰素(0.32g)，总提取收率为82.1％。
实施例7：香兰素的制备
湿菌体的制备同实施例3。在转化瓶中加入100ml磷酸盐缓冲溶液(ph8.5，0.1m)，其中含有湿菌体20g，底物阿魏酸1g，在30℃条件下转化72h，反应结束后，离心取上清液获得含有香兰素的反应液。上清液用0.45μm微滤膜过滤，滤液用高效液相色谱仪进行检测，香兰素含量为0.72g，底物转化率为72％。将反应液100ml(含有香兰素0.72g)，室温下离心或过滤，滤液浓缩至8ml，调节ph至5.5，冷却至0℃，过滤，结晶用无水乙醇洗涤，过滤，干燥，获得香兰素(0.57g)，总提取收率为79.2％。
实施例8：香兰素的制备
湿菌体的制备同实施例4。在转化瓶中加入100ml磷酸盐缓冲溶液(ph7.0，0.1m)，其中含有湿菌体50g，底物阿魏酸2g，在35℃条件下转化72h，反应结束后，离心取上清液获得含有香兰素的反应液。上清液用0.45μm微滤膜过滤，滤液用高效液相色谱仪进行检测，香兰素含量为1.36g，底物转化率为68％。将反应液100ml(含有香兰素1.36g)，室温下离心或过滤，滤液浓缩至9ml，调节ph至5.5，冷却至0℃，过滤，结晶用无水乙醇洗涤，过滤，干燥，获得香兰素(1.02g)，总提取收率为75.0％。
实施例9：香兰素的制备
湿菌体的制备同实施例3。在转化瓶中加入100ml磷酸盐缓冲溶液(ph7.2，0.1m)，其中含有湿菌体100g，底物阿魏酸20g，在40℃条件下转化120h，反应结束后，离心取上清液获得含有香兰素的反应液。上清液用0.45μm微滤膜过滤，滤液用高效液相色谱仪进行检测，香兰素含量为3.13g，底物转化率为15.7％。将反应液100ml(含有香兰素3.13g)，室温下离心或过滤，滤液浓缩至12ml，调节ph至5.0，冷却至0℃，过滤，结晶用无水乙醇洗涤，过滤，干燥，获得香兰素(2.19g)，总提取收率为70.0％。