RT‑LAMP检测结核分枝杆菌活菌的引物组合物、相应的试剂盒及检测方法与流程

本发明属于分子检测技术领域，涉及一种引物组合物、试剂盒和检测方法，具体地说是一种rt-lamp检测结核分枝杆菌活菌的引物组合物、相应的试剂盒及检测方法。

背景技术：

结核病是由结核分枝杆菌引起的严重影响人类健康的慢性传染病，是至今仍然困扰人类的古老疾病之一，在古埃及木乃伊中就已发现结核分枝杆菌的存在，即使在最近几年,每年还大约有900万人感染结核。随着耐药与多重耐药菌株的出现，结核病的控制难度不断增加，而建立快速、灵敏度高、特异性强的诊断方法，对于结核病的防治工作具有重要意义，也是进行早期隔离、诊治的前提。

目前，结核病的诊断方法主要是痰涂片抗酸染色法、罗氏固体培养法、液体快速培养、核酸扩增等方法。染色涂片虽然简单易行，但敏感性差，检出率低，并且不能鉴别是死菌还是活菌，亦不能分辨结核分支杆菌与非结核分枝杆菌；罗氏固体培养法培养周期长，需要4-8周，改进后液体快速培养系统将时间缩短到10天左右，但花费昂贵且容易受到污染，只能检出活力旺盛的菌，并且培养法不能鉴别结核分支杆菌与非结核分枝杆菌；以扩增核酸为基础的实验技术，具有快速、灵敏、特异强等特点，比如pcr、lamp等；但因pcr技术对操作人员技能有较高要求，需要的热循环设备格昂贵而很难得到推广，环介导等温扩增技术（loop-mediatedisothermalamplification,lamp）克服了上述缺点，具有反应快速、操作简单的优势，一台水浴锅等恒温设备即可完成操作，扩增结果可用肉眼判定，对员工简单培训即可完成操作，适合在基层医疗机构应用，但pcr、lamp等分子生物学检测法是针对结核杆菌dna基因为靶序列设计的引物并进行扩增的，对死菌或活菌都呈现阳性结果，无法在临床上评估抗结核治疗效果。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题，是要提供一种rt-lamp检测结核分枝杆菌活菌的引物组合物及相应的试剂盒，该引物组合物的序列设计合理，特异性强，灵敏度高；含有该引物组合物的试剂盒特异性强、灵敏度高，操作方便，可通过肉眼观察扩增结果；

本发明的另外一个目的，是提供一种rt-lamp检测结核分枝杆菌活菌的方法，该方法简单，灵敏度高，检测过程便捷，扩增反应快，节省时间，30min内即可完成扩增，扩增结果通过肉眼即可观察，能特异性检测死菌或活菌。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

一种rt-lamp检测结核分枝杆菌活菌的引物组合物，它包括：

正向外引物f3：5’-tcctggctcaggacgaac-3’；

反向外引物b3：5’-cgctttccaccacaagacat-3’；

正向内引物fip：5’-tcgccactcgagtatctccgaagcggcgtgcttaacacat-3’；

反向内引物bip：5’-agtaacacgtgggtgatctgccatcccgtggtcctatccg-3’；

反向环引物lb：5^，-ataagcctgggaaactgggt-3^，

本发明提供了一种用于检测结核分枝杆菌活菌的rt-lamp试剂盒，包括25μl的rt-lamp扩增反应液，所述rt-lamp扩增反应液包括如下组分：

0.2μm正向外引物f3、0.2μm反向外引物b3、1.6μm正向内引物fip、1.6μm反向内引物bip、0.8μm反向环引物lb、0.8m甜菜碱、8mmmgso4、1.4mmdntps，8ubstdna聚合酶、20u重组核糖核酸酶抑制剂、100um-mlv反转录酶、2.5μl10×buffer、1μl模板rna、5mm/μl钙黄绿素、10mm/μlmncl2混合液、11.7μl去离子水。

本发明还提供了一种rt-lamp检测结核分枝杆菌活菌的方法，利用前述的试剂盒进行检测，并按照如下的步骤顺序进行：

（1）在反应管中加入0.2μm正向外引物f3、0.2μm反向外引物b3、1.6μm正向内引物fip、1.6μm反向内引物bip、0.8μm反向环引物lb、0.8m甜菜碱、8mmmgso4、1.4mmdntps，8ubstdna聚合酶、20u重组核糖核酸酶抑制剂、100um-mlv反转录酶、2.5μl10×buffer、1μl模板rna、5mm/μl钙黄绿素、10mm/μlmncl2和11.7μl去离子水，并将反应管置于恒温水浴箱内反应；

（2）将步骤（1）的反应管置于90℃恒温水浴箱内2min，终止反应，根据反应管中液体的颜色变化判断扩增结果。

作为限定，所述恒温水浴箱的温度为60-65℃，反应时间为30-50min。

作为进一步限定，所述恒温水浴箱的温度为60℃，反应时间为50min。

由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：

本发明提供的用于检测结核分枝杆菌活菌的rt-lamp的引物组合物设计合理，特异性强；含有该引物组合物的试剂盒特异性强、灵敏度高，操作方便，可通过肉眼观察扩增结果；

结核杆菌16srrna半衰期短，仅存在于代谢增殖的活菌中，占总rna的80%，与dna的单一拷贝相比较，16srrna拷贝数更多，本发明提供的用于检测结核分枝杆菌活菌的检测方法，选择能合并反转录功能的rt-lamp方法，不仅有助于判定活菌，而且可以进一步提高灵敏性；检测方法简单，灵敏度高，检测过程便捷，扩增反应快，节省时间，30min内即可完成扩增，扩增结果通过肉眼即可观察，能特异性检测死菌或活菌。

本发明适用于对结核杆菌的活菌进行检测。

本发明下面将结合具体实施例作进一步详细说明。

附图说明

图1为rt-lamp引物的相对位置和特异识别位点图；

图2为不同温度的rt-lamp与lamp电泳图（a图和b图中：m-250bpdnamaker；1-56℃、2-58℃、3-60℃、4-63℃；5-65℃；6-阴性对照）；

图3为rt-lamp与lamp检测时效对比图（a-不同时间的rt-lamp电泳图；b-不同时间的lamp电泳图；图中：m-250bpdnamaker；1-20min、2-25min、3-30min、4-40min、5-50min；6-阴性对照）；

图4为rt-lamp和lamp的灵敏度实验结果图（a-rt-lamp凝胶电泳及钙黄绿素染色图；b-lamp凝胶电泳及钙黄绿素染色图；a图和b图中：m-250bpdnamaker；1-5.0×10⁷、2-5.0×10⁶、3-5.0×10⁵、4-5.0×10⁴、5-5.0×10³、6-5.0×10²、7-5.0×10¹、8-5.0×10⁰、9-5.0×10^-1cfu/ml；10-阴性对照）；

图5为rt-lamp的特异性实验中凝胶电泳及钙黄绿素染色结果图（a图:m-250bpdnamaker；1肺结核患者痰标本、2-葡萄菌肺炎患者痰标本、3-铜绿假单胞菌肺炎患者痰标本、4-肺炎克雷伯肺炎患者痰标本；b图:m-250bpdnamaker；1-结核杆菌h37rv、2-胞内分枝杆菌、3-海分枝杆菌、4-堪萨斯分枝杆菌、5-鸟结核分枝杆菌、6-浅黄分枝杆菌、7-耻垢分枝杆菌、8-偶发分枝杆菌、9-龟分枝杆菌）；

图6为rt-lamp检测极限实验中rt-lamp凝胶电泳及钙黄绿素染色结果图（图中：m-250bpdnamaker；1-0.1ng、2-10pg、3-1pg、4-100fg、5-10fg、6-1fg、7-100ag、8-10ag、9-1ag；10-阴性对照）；

图7为酶切产物分析结果图（a图为rt-lamp酶切产物分析结果图：m-250bpdnamarker；1-酶切前产物、2-酶切后产物；b图为lamp产物分析结果图，m-100bpdnamarker；1-酶切前产物、2-酶切后产物）；

图8为rt-lamp和lamp的临床样本的检测结果图（a图为rt-lamp凝胶电泳及钙黄绿素染色图：m-250bpdnamaker；1-4：肺结核患者痰标本；5-阴性对照；b图lamp凝胶电泳及钙黄绿素染色图：m-250bpdnamaker；1-4：肺结核患者痰标本；5-阴性对照）。

具体实施方式

下面将结合具体的实施方式对本发明的技术方案进行详细的说明。

下述实施例中所用的试剂如无特殊说明均为现有的常规市售试剂，所用的测试方法、检测方法、提取方法如无特殊说明，均使用现有的方法。

实施例1一种rt-lamp检测结核分枝杆菌活菌的引物组合物

本实施例括：

正向外引物f3：5’-tcctggctcaggacgaac-3’（seqidno：1）；

反向外引物b3：5’-cgctttccaccacaagacat-3’（seqidno：2）；

正向内引物fip：5’-tcgccactcgagtatctccgaagcggcgtgcttaacacat-3’（seqidno：3）；

反向内引物bip：5’-agtaacacgtgggtgatctgccatcccgtggtcctatccg-3’（seqidno：4）；

反向环引物lb：5^，-ataagcctgggaaactgggt-3^，（seqidno：5）。

该引物组合物的设计过程如下：

从ncbi数据库下载非结核杆菌16srrna全序列，用clustalomega工具将结核杆菌标准株（genbank号：nr_102810.1）与各种非结核杆菌进行序列对比，非结核杆菌包括：胞内分枝杆菌（m.intracellμlarenr_074661.1）、海分枝杆菌（m.marinumnr_025214.1）、堪萨斯分枝杆菌（m.kansasiinr_121712.1）、鸟结核分枝杆菌（m.aviumnr_102855.1）、浅黄分枝杆菌（m.flavescensnr_044815.1）、耻垢分枝杆菌（m.segmatisnr_074718.1）、偶发分枝杆菌（m.fortuitumx65529.1）、龟分枝杆菌（m.chelonaeaf480594.1）。

根据两个高变区170-210bp处和430-490bp处，从而确定特异引物的设计区段，如图1所示。然后用引物设计软件primerexplorerv5，针对该区段设计多套特异引物，比较每套引物的3’端位点的特异性并使用blast工具进一步验证其特异性，最后选出最佳引物。本实施例选用1-210bp区段设计特异引物，所有引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

实施例2一种用于检测结核分枝杆菌活菌的rt-lamp试剂盒

本实施例为一种用于检测结核分枝杆菌活菌的rt-lamp试剂盒，该试剂盒包括rt-lamp扩增反应液。

rt-lamp扩增反应液为25μl，包括如下组分：

0.2μm正向外引物f3（实施例1所提供）、0.2μm反向外引物b3（实施例1所提供）、1.6μm正向内引物fip（实施例1所提供）、1.6μm反向内引物bip（实施例1所提供）、0.8μm反向环引物lb（实施例1所提供）、0.8m甜菜碱、8mmmgso4、1.4mmdntps，8ubstdna聚合酶、20u重组核糖核酸酶抑制剂、100um-mlv反转录酶、2.5μl10×buffer，1μl模板rna，5mm/μl钙黄绿素、10mm/μlmncl2、11.7μl去离子水。

在具体的试验中，为了进行效果对比，试剂盒还包括对照，对照包括阳性对照和阴性对照，阳性对照为含目的基因结核杆菌（m.tuberculosish37rv，genbank号：nr_102810.1）的混合液（即本实施例中的rt-lamp扩增反应液）；阴性对照为不含目的基因结核杆菌（如其他肺部细菌感染者及常见的非结核杆菌）混合液。

本实施例提供的rt-lamp试剂盒，特异性强、灵敏度高，操作方便，可通过肉眼观察扩增结果，简便、易于操作。

实施例3一种rt-lamp检测结核分枝杆菌活菌的方法

本实施例在检测的过程中使用实施例2所提供的试剂盒，具体的检测方法如下：

（31）将含有结核分枝杆菌的待检提取液用rna提取试剂盒提取结核分枝杆菌的rna后，得到模板rna，作为rt-lamp扩增反应液中组分之一（即模板rna）；

本实施例中的待检提取液取自确诊肺结核的就诊者的痰液，即将该痰液作为痰标本，加入痰液2倍体积的rna保护剂，用2倍体积2%n-乙酰-l-半胱氨酸（nalc）-naoh溶液进行消化，旋紧盖子，在涡旋振荡器上涡旋震荡2min，直至痰标本充分液化，利用rna提取试剂盒按照现有的提取手段，提取样品rna；rna提取时根据试剂盒提示加入dnasei进行处理，提取后得到模板rna；其中：rna提取试剂盒（rneasyminikit）购自德国的qiagen。

（32）在反应管中加入试剂盒中rt-lamp扩增反应液并将反应管置于60℃恒温水浴箱内，反应50min；

（33）将步骤（32）的反应管置于90℃恒温水浴箱内2min，终止反应，根据反应管中液体的颜色变化判断扩增结果。

扩增完成后，见到体系变绿色是为阳性，保持淡橙色是为阴性，并取扩增产物5μl在凝胶中电泳25min以验证扩增结果。

本实施例提供的用于检测结核分枝杆菌活菌的检测方法，过程简单，灵敏度高，检测过程便捷，扩增反应快，节省时间，30min内即可完成扩增，扩增结果通过肉眼即可观察，能特异性检测死菌或活菌。

实施例4-6rt-lamp检测结核分枝杆菌活菌的方法

实施例4-6分别为一种rt-lamp检测结核分枝杆菌活菌的方法，与实施例3相似，不同之处仅在于：rt-lamp扩增过程[即步骤（x2）(x=4-7)]中的反应温度和时间不同，具体如下：

实施例4中，反应温度为62℃，反应时间为30min；

实施例5中，反应温度为63℃，反应时间为40min；

实施例6中，反应温度为65℃，反应时间为45min。

实施例4-6所提供的用于检测结核分枝杆菌活菌的方法，过程简单，灵敏度高，检测过程便捷，扩增反应快，节省时间，30min内即可完成扩增，扩增结果通过肉眼即可观察，能特异性检测死菌或活菌。

实施例7rt-lamp与lamp方法分别检测结核分枝杆菌活菌的对比实验与探究

在下述的实验中，rt-lamp与lamp扩增的条件、体系是相似的，不同之处仅在于：所用的扩增模板不同，rt-lamp扩增使用的是模板rna，lamp扩增使用的是模板dna。

（一）、灵敏度实验

将结核分枝杆菌菌液按照10倍梯度稀释，取各稀释度菌液2ml分别提取rna与dna，rna的提取方法与实施例3中相同，dna的提取利用dna提取试剂盒[细菌dna提取试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司]按照现有的提取手段，提取样品dna。利用rt-lamp与lamp检测方法对结核分枝杆菌进行检测，测试两种方法的灵敏度，重复3次以上实验，以凝胶电泳和钙黄绿素染色进行结果判定，其中rt-lamp检测方法即进行rna的反转录扩增，即扩增体系中含有提取后的rna模板，lamp检测方法即进行dna的扩增，即扩增体系中含有提取后的dna模板，rt-lamp检测方法与实施例3相同，lamp的检测方法为现有的检测方法。

具体的检测结果如图4所示，由该图可以看出，rt-lamp比lamp灵敏度高10倍。

（二）、特异性实验

以含有结核杆菌（m.tubercμlosish37rv）的基因rna液体作为阳性对照，其他肺部细菌感染者及常见的非结核杆菌混合液作为阴性对照，用rt-lamp（与实施例3中检测方法相同）和lamp检测方法（现有技术）分别进行扩增，通过电泳观察扩增结果并进行特异性比较，具体的结果如图5所示。

由图5可知，只有结核杆菌出现扩增条带，其它细菌及非结核分枝杆菌为出现扩增，该引物特异性强。

（三）、检测极限实验

使用核酸蛋白分析仪（eppendorf，germany）对纯化的结核杆菌标准株rna进行多次测量，取平均值作为真实rna含量值，并用去离子水调至1ng/μl作为rt-lamp实验的模板；用去离子水对模板进行倍比稀释，根据下述公式：

1ng约相当于10⁹copyrna，1ag约相当于1copyrna。用rt-lamp检测方法（实施例3所提供的方法）进行扩增，根据结果评价rt-lamp的检测极限，具体结果见图6。

由图6可知，rt-lamp可检测1copy结核菌，该方法灵敏度高。

（四）、扩增后产物酶切鉴定

对在同一条件下rt-lamp及lamp扩增方法扩增后的产物,采用限制性内切酶xhoi进行酶切鉴定,30μl酶切体系如下:

rt-lamp产物3μl、lamp产物3μl、q.cut.10×buffer3μl、xhoi1μl，去离子水补足23μl,37°c作用1小时；酶切产物用2.0%琼脂糖凝胶进行电泳。具体的结果如图7所示。

由图7可知，lamp反应产物被切成大约70bp的条带，与预期条带相符，rt-lamp出现两条条带，说明反应产物量大，与未完全酶切有关。

（五）、临床样本检测

利用rt-lamp检测方法（实施例3所提供）和lamp的检测方法（现有技术）对同一含有结核杆菌的痰标样本进行检测，检测结果如图8所示。

结果表明：rt-lamp的扩增结果中对培养法与lamp法检测不到的结核杆菌仍能检测阳性，这说明rt-lamp较lamp敏感性强。

以罗氏培养法为金标准，用rt-lamp与lamp检测方法分别对122例痰标本进行检测，3种方法检出率为：rt-lamp100%、lamp法92%、培养法88%，利用统计分析软件为spss19.0统计结果的灵敏度、特异度。

检测结果比较用卡方检验，p<0.05认为两者有统计学差异。rt-lamp与scm差异有统计学意义（p<0.01，见表1），lamp和scm差异无统计学意义（p>0.05，见表1），rt-lamp与lamp差异在统计学上有意义（p<0.05，见表1），rt-lamp阳性率高于lamp。

表1临床样本阳性检出率（%）

表中：a-mtb患者，n=100;非mtb患者，n=22;b-rt-lamp与scm相比的灵敏度;c-lamp与scm相比的灵敏度;d-rt-lamp与lamp相比的灵敏度。

实施例8rt-lamp与lamp方法分别检测结核分枝杆菌活菌时温度和检测时效对比试验

将结核分枝杆菌菌液按照10倍梯度稀释，取各稀释度菌液2ml分别提取rna与dna，rna的提取方法与实施例3中相同，dna的提取利用dna提取试剂盒[细菌dna提取试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司]按照现有的提取手段，提取样品dna。利用rt-lamp与lamp检测方法对结核分枝杆菌进行检测，分别测试两种方法的扩增时效及在不同的扩增温度下扩增效果，重复3次以上实验，其中rt-lamp检测方法即进行rna的反转录扩增，即扩增体系中含有提取后的rna模板，lamp检测方法即进行dna的扩增，即扩增体系中含有提取后的dna模板，rt-lamp检测方法与实施例3相同，lamp的检测方法为现有的检测方法。

具体的结果见图2和图3。

由图2可知,rt-lamp的最适温度为60°c;

由图3可知,rt-lamp30min即可完成扩增。

实施例1-6，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明所作的其它形式的限定，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述技术内容作为启示加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但凡是未脱离本发明权利要求的技术实质，对以上实施例所作出的简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明权利要求保护的范围。

sequencelisting

<110>中国人民解放军白求恩国际和平医院

<120>rt-lamp检测结核分枝杆菌活菌的引物组合物、相应的试剂盒及检测方法

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