技术领域：
本发明涉及一种检测山羊支原体山羊肺炎亚种的iipcr试剂盒，属于分子生物学检测领域。
背景技术：
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山羊支原体山羊肺炎亚种(mycoplasmacapricolumsubsp.capripneumoniae,mccp)是山羊传染性胸膜肺炎(contagiouscaprinepleuropneumonia,ccpp)的病原体，同时也是丝状支原体簇(mycoplasmamycoidescluster,mmcluster)的主要成员之一。其它丝状支原体簇成员包括丝状支原体丝状亚种小菌落型(mycoplasmamycodiessubsp.mycodiessmallcolony,mmmsc)、丝状支原体丝状亚种大菌落型(mycoplasmamycodiessubsp.mycodieslargecolony,mmmlc)、丝状支原体山羊亚种(mycoplasmamycodiessubspcapri,mmc)、山羊支原体山羊亚种(mycoplasmacapricolumsubsp.capricolum,mcc)和牛群支原体7型(mycoplasmabovinegroup7,mbg7)等。由于这些支原体之间具有非常相似或相近的生化和血清学特性，使得由山羊支原体山羊肺炎亚种(mccp)引起的山羊传染性胸膜肺炎(ccpp)的诊断较为困难，容易将ccpp与由其它支原体引起的疾病混淆，或者将由mmc、mmmlc等支原体引起的山羊呼吸道疾病错误地归类于ccpp。
目前，对山羊支原体山羊肺炎亚种的检测方法主要是分离培养、血清学检测、常规pcr检测以及利用传统平板培养相结合的方法进行检测。山羊支原体山羊肺炎亚种对营养要求苛刻、生长缓慢而且难以分离培养，判断结果时只靠肉眼观察，没有足够的可靠依据，影响实验的准确性；血清学检测既费时又费力，而且灵敏度不高；常规pcr检测虽然避免了上述两类方法的缺陷，但存在引物特异性不高、容易污染和临床样品中pcr抑制物存在造成的假阴性等问题，限制了在快速检测诊断上的推广应用。iipcr(恒温隔绝式pcr)方法凭借特异性引物和探针，有效地增加了检测的特异性和敏感性，同时大大提高了检测速度和检测结果的准确率，且该方法实现反应体系的全封闭自动操作，避免了dna的污染，具有广泛的现场实用性，可确保快速、准确地检测病原体，在病原体的快速定性检测方面具有广阔的应用前景和发展趋势。
技术实现要素：
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针对上述问题，本发明解决的技术问题是克服现有技术不能适应疫病现场快速、敏感和特异检测的需求，目的在于提供一种快速、敏感、特异检测山羊支原体山羊肺炎亚种的iipcr试剂盒及该试剂盒的使用方法。
本发明的检测山羊支原体山羊肺炎亚种的iipcr试剂盒包括：premixextaq引物mccp-specific-forward和mccp-specific-revers，探针mccp-specific-probe，阴性对照和阳性对照，其中所述premixexta引物为：
mccp-specific-forward：5′-gtagcagctatattcttaatca-3′
mccp-specific-reverse：5′-gctacaaataattcttgcatac-3′
所述探针为：
mccp-specific-probe：5′-f-aagtaataccagcagcaacagcaag-q-3′其中，f为荧光报告基团，q为荧光淬灭基团；
优选地，所述荧光报告基团为fam，所述荧光淬灭基团为tamra。
所述阴性对照为nuclease-freewater；
所述阳性对照为含有arcd基因序列的阳性标准质粒pmd18-t/arcd。
所述引物的扩增产物为185bp片段：
gtagcagctatattcttaatcagctcaattttattagcaattgttaactctttaggagaagaaaaatttattaaagaatttatggctggtgcttgcgatcttttaggagtatgtttagtt
其中，带有下划线的序列为上下游引物，带有着重号的序列为探针的反向互补序列。
其中,所述引物的浓度为10um，探针的浓度为0.5um，上、下游引物与探针的配比为1:1:2。
本发明还提供了所述用于检测山羊支原体山羊肺炎亚种iipcr试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
步骤一.在iipcr检测之前，打开pockittm核酸分析仪，仪器将在5分钟内完成自动校准，选择520nm波长，屏幕上显示“systemready”；
步骤二.将山羊支原体山羊肺炎亚种的iipcr试剂盒取45ul混合液加入到r-tubetm，然后加入5ul模板dna，将r-tubetm盖上盖子后，用cubeetm将管内液体离心至管底，r-tubetm内所述试剂盒各成分的浓度和用量为：premixextaq25ul，mccp-specific-forward10um1ul，mccp-specific-reverse10um1ul，mccp-specific-probe0.5um2ul，nuclease-freewater16ul；
步骤三.将r-tubetm放入到pockittm核酸分析仪的固定槽内，按压r-tubetm确认放入正确位置；
步骤四.盖上pockittm核酸分析仪后，按“run”启动扩增程序，仪器将在42min内完成检测。
本发明的有益效果：选取山羊支原体山羊肺炎亚种arcd基因的一段序列，基于该基因序列，设计特异性引物和探针，建立了山羊支原体山羊肺炎亚种的iipcr检测试剂盒。为了检测该试剂盒的特异性，本发明以构建的重组质粒(pmd18-t/arcd)为阳性对照，以山羊支原体山羊肺炎亚种和其它丝状支原体簇的基因组dna作为阴性对照，进行iipcr反应。结果发现：除阳性对照(pmd18-t/arcd)以外，山羊支原体山羊肺炎亚种的基因组dna检测结果为阳性(+)，其余丝状支原体簇的检测结果均为阴性(-)。本发明将检测结果同之前建立的山羊支原体山羊肺炎亚种实时荧光定量pcr检测结果进行比较，发现两种方法的符合率为100％。同时，本发明也对试剂盒的稳定性进行了检测，发现在-20℃条件下，所建立的试剂盒至少可以保存一个月，这为山羊支原体山羊肺炎亚种的现场检测提供了极大的便利，省去了现场操作带来的交叉污染以及费时费力等问题。因此，本发明所建立的试剂盒是一种具有特异性高、方便快捷的山羊支原体山羊肺炎亚种检测技术手段，能够满足一般临床样品的检测要求。
附图说明
图1为本发明检测山羊支原体山羊肺炎亚种iipcr试剂盒的使用方法中试剂盒各成分的浓度和用量示意图。
具体实施方式：
本具体实施方式采用以下技术方案和实施例对发明进行进一步的详细说明。
本具体实施方式中实施例：一种检测山羊支原体山羊肺炎亚种的iipcr试剂盒
1.材料和方法
1.1菌株和部分支原体、细菌基因组dna，
山羊支原体山羊肺炎亚种(mccp)m1601、山羊支原体山羊亚种(mcc)c.kid、丝状支原体丝状亚种小菌落型(mmmsc)pg1、丝状支原体丝状亚种大菌落型(mmmlc)y98、y-goat、丝状支原体山羊亚种(mmc)pg3的基因组dna均由中国农业科学院兰州兽医研究所提供。
1.2主要仪器设备与试剂
pockittm核酸分析仪(pockittmnucleicacidanalyzer)、高速离心机eppendorfcentrifuge5804r、核酸浓度测定仪nanodrop-2000，细菌基因组dna提取试剂盒(tianampbacqeriadnakit)购自天根生化科技(北京)有限公司，质粒dna提取试剂盒、pmd18-tcloningkit、premixextaq购自宝生物工程(大连)有限公司。
1.3引物、探针的设计与合成
从ncbi数据库中获取山羊支原体山羊肺炎亚种的arcd基因序列(genbank登录号：ay529462.1)，应用dnaman软件(version5.2.10,lynnonbiosoft,vaudreuil,canada)分析基因序列，根据引物和探针设计原则，在多态位点较丰富区域设计扩增片段长度为185bp的一对引物，并在该引物的扩增区域内设计一条荧光探针。引物和探针由宝生物工程(大连)有限公司合成。引物和探针序列分别为：
mccp-specific-forward：5′-gtagcagctatattcttaatca-3′
mccp-specific-reverse：5′-gctacaaataattcttgcatac-3′
mccp-specific-probe：5′-f-aagtaataccagcagcaacagcaag-q-3′
其中，5′端标记有荧光报告基团fam，3′端标记有荧光淬灭基团tamra。
1.4阳性标准质粒的构建
以mccp-specific-forward和mccp-specific-reverse为引物，山羊支原体山羊肺炎亚种的arcd基因为模板，pcr扩增得到大小为185bp的目的片段。pcr产物切胶回收纯化后连接到pmd18-t载体上，然后将连接产物导入到dh-5a感受态细胞，筛选出阳性克隆子，琼脂糖凝胶电泳验证后提取质粒并测定浓度。
1.5反应体系
iipcr反应体系为50μl，其中premixextaq25μl，上、下游引物(10um)各1μl，探针(0.5um)2μl，ddh2o16μl，dna模板5μl。
1.6特异性检测
以标准质粒pmd18-t/arcd为阳性对照，按上述反应体系分别加入山羊支原体山羊肺炎亚种(m1601株)和其它丝状支原体簇成员的基因组dna为模板，检测试剂盒的特异性。
1.7稳定性检测
在200μlpcr管内于-20℃保存若干管反应预混液(premixextaq25μl，上、下游引物(10um)各1μl，探针(0.5um)2μl，ddh2o16μl，共计45μl)，并以阳性对照(pmd18-t/arcd)为模板，分别在第7天、第14天、第21天、第28天检测预混液的保存效果，即试剂盒的稳定性。
2.结果
2.1特异性检测
iipcr检测结果显示，阳性对照(pmd18-t/arcd)和山羊支原体山羊肺炎亚种(m1601株)呈阳性(+)，其余丝状支原体簇成员的检测结果呈阴性(—)。
2.2稳定性检测
分别对-20℃保存第7天、第14天、第21天和第28天预混液的稳定性进行了iipcr检测，发现阳性对照(pmd18-t/arcd)检测结果均呈阳性(+)。说明上述预混液或试剂盒在-20℃保存条件下可进行长期保存，至少可保存1个月。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。