本发明属于生物工程技术领域，涉及基因的优化及构建，尤其是一种α-l-鼠李糖苷酶基因及其应用。
背景技术：
以酵母为基础的细胞表面展示是一项新兴的适合表达真核来源外源蛋白的蛋白质加工系统。2012年，xiao等应用细胞表面展示技术，采用a-凝集素作为载体蛋白，成功将来源于链格孢属alternariasp.l1的α-l-鼠李糖苷酶rhal1锚定在酿酒酵母的细胞壁上，并将其制备成全细胞催化剂以催化柚皮苷的水解(bioresourcetechnol,2012,123:144-149)。笔者前期试图将来源于黑曲霉a.niger的rha基因在酿酒酵母细胞表面展示，但蛋白质表达量偏低，经分析获知可能是某些因子对基因的表达有抑制作用，如密码子使用的偏爱等，导致其在外源宿主中难以表达(biotechj,2011,6(6):650-659)。因此，从密码子优化的角度出发，去尝试提高异源蛋白质的表达量值得进一步研究。
遗传密码偏爱性的发现与改造，催生了现代密码子优化技术。不同的生物甚至同种生物不同蛋白质的编码基因，对于同一氨基酸所对应的密码子使用频率也不相同，这种现象称为遗传密码偏爱性。2011年，学者们分别报道了应用optimumgenetm密码子优化技术有效提高关建酶、淋巴蛋白lyn(nature,2011,480(7375):109-112)和t4溶菌酶等多种异源蛋白的表达量(nature,2011,478(7369):412-416)；2016年，龙强等报道了一种密码子优化的chi3l1基因及其应用的专利(cn201611054705.7)。该技术可有效提高基因表达水平，使得对一些重要功能蛋白质或者关键酶的生物学结构及功能的研究成为可能。该技术依托的optimumgenetm运算法，充分考虑到蛋白质表达不同阶段可能遇到的多种复杂因素(nature,2011,477(7362):111-114)，如影响转录效率的gc含量、tata框、sd序列、cpg二核苷酸含量、隐蔽剪接位点及终止信号等；影响翻译效率的密码子偏爱性、抑制位点、gc含量、rna不稳定基序、polya早期信号、mrna结构以及自由能稳定性、潜在的chi序列和核糖体结合位点等；影响蛋白质折叠的密码子偏爱性、密码子上下关联、rna二级结构以及密码子与反密码子的交互作用等(bioinformatics,2003,19(8):987-998)。
因此，本文从分析α-l-鼠李糖苷酶基因(rha)和宿主酿酒酵母s.cerevisiae细胞对密码子的偏爱性和适应性入手，对rha进行optimumgenetm密码子优化，之后将密码子优化后获得的α-l-鼠李糖苷酶基因(corha)在酿酒酵母细胞中成功表达并展示到细胞表面，筛选出能展示表达高活性corha的重组菌株，以期制备成全细胞催化剂应用于选择性催化水解桑树来源的黄酮苷类化合物。
技术实现要素：
解决的技术问题：本发明提供一种优化的α-l-鼠李糖苷酶基因及其应用，包含该基因的载体和菌株，本发明将密码子优化后的corha基因的编码蛋白corha在酿酒酵母表面展示表达，同时利用该菌株将芦丁转化为具有生理活性的异槲皮苷，其转化产物纯度高，易分离。
技术方案：一种α-l-鼠李糖苷酶基因，基因序列如seqidno.3所示。
一种含有α-l-鼠李糖苷酶基因的载体，含有如seqidno.3所示序列的α-l-鼠李糖苷酶基因。
含有α-l-鼠李糖苷酶基因的载体，所述载体的质粒片段来源于质粒pyd1。
一种含有α-l-鼠李糖苷酶基因的工程菌，含有如seqidno.3所示的α-l-鼠李糖苷酶基因。
含有α-l-鼠李糖苷酶基因的工程菌，工程菌的质粒载体为pyd1。
含有α-l-鼠李糖苷酶基因的工程菌，工程菌的宿主菌为酿酒酵母eby100。
上述工程菌表达α-l-鼠李糖苷酶的方法，将工程菌接种到ynb-caa-葡萄糖培养基中，生长到指数期，然后经半乳糖诱导α-l-鼠李糖苷酶表达，离心，收集菌体；所述的半乳糖浓度为1％-2％g/l；诱导温度为20℃；诱导时间为0～72h。
上述工程菌在水解黄酮类化合物中的应用。
将所述工程菌加入到含有黄酮类化合物的缓冲液中，ph5.0-6.0，振荡反应；所述的缓冲液为柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液；所述的反应温度为40-50℃；所述的反应时间为1-6h。
一种水解黄酮类化合物的全细胞催化剂，所述全细胞催化剂包括上述的含有α-l-鼠李糖苷酶基因的工程菌。
上述黄酮类化合物为芦丁，柚皮苷等。
有益效果：(1)本发明首先对来源于黑曲霉菌(a.niger)的α-l-鼠李糖苷酶基因(rha)进行了密码子优化，得到基因corha，在一定程度上避免了由于密码子偏爱性对蛋白的表达产生的影响，将corha插入载体pyd1中，构建了表达载体pyd1-corha，并将它导入酿酒酵母eby100中，获得含有表达载体pyd1-corha的酿酒酵母菌株eby100-pyd1-corha。经诱导培养后，corha成功展示在酿酒酵母细胞壁表面，能够与底物芦丁充分接触，并将其专一的转化为异槲皮苷。
(2)本发明首先根据酿酒酵母基因组数据，分析酿酒酵母的密码子偏爱性，对rha进行密码子优化，采用偏爱密码子并避免利用率低的或稀有的密码子来合成基因，可以在一定程度上减弱由于密码子利用而产生的影响，提高异槲皮苷的产量。
(3)本发明利用酿酒酵母表面展示系统，将经过密码子优化后的corha展示在细胞壁表面，并利用该细胞壁上的酶生产异槲皮苷，既具有可靠的生物安全性，又能够提高α-l-鼠李糖苷酶的催化效率，同时获得具有生理活性的单一异构体。
附图说明
图1为以重组载体pyd1-corha为模板进行pcr验证的核酸电泳图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本发明所述的天然α-l-鼠李糖苷酶基因rha来源于黑曲霉菌(a.niger)，该基因的genbank号为nt_166524.1，分析酿酒酵母密码子偏好性，进行密码子优化，得到新的基因序列corha，其核苷酸序列如seqidno.3所示；所述的表达质粒将corha基因插入初始载体pyd1中，构建了表达载体pyd1-corha，并将它导入酿酒酵母eby100中，获得含有表达载体pyd1-corha的酿酒酵母菌株eby100-pyd1-corha。上述菌株经诱导培养后，corha成功的展示在酿酒酵母细胞壁表面，能够与底物芦丁充分接触，并将芦丁转化为单一活性异构体异槲皮苷。
所述的表达质粒将corha基因插入初始载体pyd1(购自invitrogen公司，货号v83501)；所述的酿酒酵母将构建后的表达质粒转入初始菌株酿酒酵母eby100中(购自invitrogen公司，货号c83900)。
实施例1
目的基因的获得
本发明以来源于黑曲霉菌(a.niger)的基因组为模板，利用下表中的引物进行pcr扩增。
pcr反应体系为：2×pcrbuffer(含mg2+)25μl，dntp(25mm)5μl，上游引物corha-f和下游引物corha-r(10μm)各1μl，模板1μl，kodfxdna聚合酶(购自toyobo公司，货号kfx-101)0.5μl，加无菌水至终体积为50μl。
pcr反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸90s，反应30个循环，72℃再延伸10min。
pcr结束后进行测序验证，验证正确后进行密码子优化获得新的α-l-鼠李糖苷酶基因corha核苷酸序列，其序列见seqidno.3。
引物序列
构建pyd1-rha载体
将已获得的目的基因corha用ecori和xhoi进行双酶切，回收后与经同样内切酶处理过的质粒片段pyd1进行连接，将连接产物转化大肠杆菌top10感受态细胞，并均匀涂布于带有氨苄青霉素抗性(50μg/ml)的lb平板上，37℃培养过夜，挑取单克隆接种到带有氨苄青霉素抗性(50μg/ml)的lb液体培养基中摇菌(4ml)至od600值为0.6-0.8，进行菌液pcr验证，提取质粒验证和酶切验证，获得表达载体pyd1-corha。
制备感受态酿酒酵母细胞
酿酒酵母eby100在ypd平板上进行三区划线，30℃培养48h，获得单菌落；挑取一个单菌落，接种于ypd液体培养基中，30℃振荡培养至od600达到0.6-1.0；室温下3000rpm离心5min，收集菌体，将菌体重新悬浮于无菌水中，重复一次；用0.5倍体积的新鲜制备的酵母感受态制备工作液洗涤酵母沉淀细胞。即混匀后振荡1min，室温3000rpm离心3min，收集菌体，将菌体重新悬浮于0.02倍体积的酵母感受态制备工作液中；分装到冻存管中放入保温冰盒中冷却半小时后再放入-80℃冰箱待用。
构建重组酿酒酵母eby100-pyd1-rha
向上述感受态细胞中依次加入0.1-5μg待转化质粒pyd1::corha，37℃恒温振荡器上振荡5min；加入1.4ml转化液a，轻柔颠倒混匀1min，30℃培养1h，室温3000g离心5s，弃上清，在酵母细胞沉淀中加入1.0ml转化液b，振荡1min，室温3000g离心5s，弃上清；在酵母沉淀细胞中加入适量的转化液b，混匀后将酿酒酵母菌悬液均匀涂布到md固体筛选培养基上，30℃培养3-4d，获得单菌落。
初始菌株酿酒酵母eby100为营养缺陷型菌株，初始载体pyd1含有trp1基因，含有表达载体的酿酒酵母菌株能够在色氨酸缺失的培养基上生长，因此选用md固体筛选培养基。md固体筛选培养基的成分g/l：葡萄糖2％，ynb-caa0.67％，亮氨酸0.01％，琼脂1.5％。
构建重组酿酒酵母eby100-pyd1-rha
挑取5个pyd1::corha转化子接种到ynb-caa-葡糖糖液体培养基中(10ml)，30℃过夜培养，用pyd1载体的通用引物分别对上述转化子进行α-l-鼠李糖苷酶基因的菌液pcr验证。所述的ynb-caa-葡萄糖培养基成分为g/l：ynb-caa0.67％，酪蛋白0.5％，葡萄糖2％。
pcr反应体系为：2×pcrmastermix25μl，上游引物pyd1-f和下游引物pyd1-r(10μm)各2μl，模板4μl，加无菌水至终体积为50μl。
pcr反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，49℃退火30s，72℃延伸90s，反应30个循环，72℃再延伸10min。
结果如图1所示，与阴性对照菌株相比，酿酒酵母菌株能够扩增出2802bp的条带，说明表达载体pyd1::corha已经成功转入酿酒酵母eby100中。
引物序列
含有表达载体的酿酒酵母的诱导表达
酿酒酵母eby100-pyd1-corha表面展示α-l-鼠李糖苷酶的方法是：从md固体筛选培养基上挑选pyd1-corha转化子接种到ynb-caa-葡萄糖培养基(10ml)中培养过液，待od600达到2.0-5.0时，转接至ynb-caa-半乳糖液体培养基上，20℃诱导α-l-鼠李糖苷酶表达，6000rpm离心，收集菌体细胞，将收集的菌体细胞用无菌水洗涤两次，然后用ph＝5.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液重悬菌体，使od600＝2.0，即为全细胞催化剂。所述的ynb-caa-半乳糖培养基为g/l：ynb-caa0.67％，酪蛋白0.5％，半乳糖2％；所述的诱导温度为20℃；所述的诱导时间为0～72h。
含有表达载体的酿酒酵母的诱导表达
将上述制备的全细胞催化剂corha加入到含有0.02mg/ml芦丁的缓冲液中，振荡培养进行转化反应，每隔一定时间测定异槲皮苷的产量，以含有空载体pyd1的酿酒酵母细胞的转化产物作为阴性对照。结果含原始基因rha的菌株中目的蛋白质表达量为110±20mg/l，含密码子优化基因corha的菌株中目的蛋白质的表达量为320±10mg/l，提高了2.9倍。以pnpr为水解底物检测酶活力，原始基因rha菌株中表达产物的酶活力为21.0±3.1u/g，密码子优化基因菌株中表达产物的酶活力达到56.9±2.9u/g，提高了2.7倍。
所述的缓冲液为柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液；所述的反应温度为40-50℃；所述的反应时间为1-6h，所述的转速为180r/min。
corha催化芦丁生物转化合成异槲皮苷
将上述制备的全细胞催化剂corha加入到含有0.02mg/ml芦丁的缓冲液中，40℃，ph＝5.0，180r/min振荡培养进行转化反应，每隔一定时间测定异槲皮苷的产量，以含有空载体pyd1的酿酒酵母细胞的转化产物作为阴性对照。corha水解产物异槲皮苷的得率为67.6±3.1％。
corha催化芦丁生物转化合成异槲皮苷
将上述制备的全细胞催化剂corha加入到含有0.02mg/ml芦丁的缓冲液中，60℃，ph＝5.0，180r/min振荡培养进行转化反应，每隔一定时间测定异槲皮苷的产量，以含有空载体pyd1的酿酒酵母细胞的转化产物作为阴性对照。corha水解产物异槲皮苷的得率为79.8±3.1％。
corha催化芦丁生物转化合成异槲皮苷
将上述制备的全细胞催化剂corha加入到含有0.02mg/ml芦丁的缓冲液中，60℃，ph＝8.0，180r/min振荡培养进行转化反应，每隔一定时间测定异槲皮苷的产量，以含有空载体pyd1的酿酒酵母细胞的转化产物作为阴性对照。corha水解产物异槲皮苷的得率为13.3±3.8％。
sequencelisting
<110>江苏科技大学
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