基于金属螯合亲和层析制备口蹄疫病毒疫苗抗原的方法与流程

本发明涉及疫苗的分离纯化
技术领域：
，具体地，涉及一种基于金属螯合亲和层析制备口蹄疫病毒疫苗抗原的方法。
背景技术：
：口蹄疫(footandmouthdisease，fmd)是一种烈性极强传染病，该病发病主要是由于牛、羊、猪等偶蹄类动物感染口蹄疫病毒(footandmouthdiseasevirus，fmdv)所致。口蹄疫病毒具有传染速度快，传播范围广等特点，因此会给畜牧业造成巨大的损失。接种口蹄疫疫苗是目前防治口蹄疫最有效的方法。目前使用的口蹄疫疫苗主要通过将口蹄疫病毒接种到细胞培养液中，后将病毒抗原收获后进行浓缩、灭活，经过膜过滤和peg沉淀后与缓冲液和相应的佐剂混合制备而成。通过该工艺制备而成的疫苗纯度差，杂质含量多，成分复杂。注射入动物体内后造成免疫保护力差、副反应严重、安全性差等问题。这对目前口蹄疫疫情的控制及整个畜牧业造成了极大的隐患。色谱分离技术是一种获得的样品纯度高、易于工业放大的蛋白质分离纯化技术。目前色谱技术已经广泛用于人用药物的制备，但是在兽用药物领域的应用则尚未普及。目前，已有专利报道了应用色谱技术分离纯化口蹄疫病毒抗原，中国发明专利cn102988970b报道了应用凝胶过滤的方法进行口蹄疫病毒抗原的纯化，该方法虽然能获得纯度较高的抗原，但是由于凝胶过滤处理量较小，且对层析柱的柱效具有较高的要求，加之其纯化过程处理时间较长，纯化后抗原浓度会进一步下降，需要后续进行进一步的抗原浓缩，因此该技术在小规模样品制备时具有一定优势，但是由于凝胶过滤技术本身存在的局限性，不适合用于大规模的口蹄疫抗原制备。中国发明专利cn104818254a和cn104892734a分别报道了应用离子交换层析和疏水层析进行口蹄疫抗原的制备，上述两种层析方法具有处理量大、耗时短、适用于大规模抗原制备的优点，但是其获得的抗原纯度仍然较低。此外，灭活口蹄疫病毒的结构特殊性使得其纯化过程存在难点。口蹄疫灭活病毒的完整病毒粒子146s具有高的免疫原性，而146s结构稳定性差，容易裂解成为亚基12s，失去免疫活性。因此纯化后的灭活口蹄疫病毒抗原在去除原有培养条件中的杂质成分后，稳定性通常变得更差，保存时间短。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的是提供一种基于金属螯合亲和层析制备口蹄疫病毒疫苗抗原的方法，以期解决上述现有技术中存在的至少部分技术问题。金属离子鳌合亲和层析目前主要用于带标签蛋白的纯化，如镍亲和层析用于带组氨酸(his)标签的蛋白纯化，这些蛋白的组氨酸标签并不是天然存在，主要是通过基因工程的方法修饰形成。而用金属螯合层析直接纯化未经人为添加组氨酸标签的天然蛋白，尤其是超大生物分子如灭活病毒和病毒样颗粒，则鲜有报道。本发明提供一种基于金属螯合层析制备口蹄疫病毒抗原的色谱分离方法，该方法基于亲和层析的思路，通过对口蹄疫抗原结构进行分析后发现其抗原表明存在着大量的组氨酸位点，因此采用金属离子作为配基和抗原表面的组氨酸位点特异性结合，而溶液中的杂质蛋白则不与金属离子配基结合穿出色谱柱，从而实现从复杂的组分中特异性捕获口蹄疫病毒抗原。基于金属螯合亲和层析纯化获得的口蹄疫抗原相比于其它方法具有非常高的纯度，杂蛋白去除率到达98％以上，大大提高了疫苗的安全性，且该方法操作简单，工艺重复性好，获得的抗原纯度和收率高。此外，通过实验，发明人还惊喜地发现，通过金属离子和抗原颗粒表面组氨酸位点的作用还有利于使各亚基之间作用更为牢固从而增加纯化后口蹄疫病毒抗原颗粒的结构稳定性，因此通过本方法纯化后的抗原相比其它常用层析纯化方法，具有更高的稳定性，保证抗原的有效性。因此，该发明能同时适用于实验室和工业化规模的实际应用，具有较大的实用价值。为实现上述目的，根据基于金属螯合亲和层析制备口蹄疫病毒疫苗抗原的方法包括如下步骤：(1)将灭活后的口蹄疫病毒细胞培养液进行固液分离后，取上清；(2)将获得的上清进行金属螯合层析，收集洗脱液组分，获得灭活口蹄疫抗原。根据本发明的基于金属螯合亲和层析制备口蹄疫病毒疫苗抗原的方法，其中，所述的灭活口蹄疫病毒抗原选自a型、o型、c型、sat1型、sat2型、sat3型和asia1型中的任一种，优选a型或o型。根据本发明的基于金属螯合亲和层析制备口蹄疫病毒疫苗抗原的方法，其中，所述固液分离的方法可为本领域常规操作，优选将灭活后的口蹄疫病毒细胞培养液在4℃下以8000-9000rpm的转速离心25分钟后弃去沉淀，保留上清，如此可去除口蹄疫病毒细胞培养液中的杂质，避免其在后续纯化步骤中对层析介质造成污染或损伤。根据本发明的基于金属螯合亲和层析制备口蹄疫病毒疫苗抗原的方法，其中，在所述的固液分离之后，在所述的将获得的上清进行金属螯合层析之前，还优选对获得的上清进行粗分离处理，获得粗分离组分，以去除病毒细胞培养液中的部分杂质蛋白，从而获得高纯度的灭活口蹄疫病毒抗原。优选地，所述粗分离处理的方法为离子交换层析、疏水层析或peg沉淀。具体地，各粗分离处理的方法分别优选如下的操作。对于离子交换层析，口蹄疫病毒疫苗抗原在ph高于其等电点时带负电荷，因此可选用阴离子交换层析进行分离，其方法为：将上清通过超滤或透析的方式置换入20mm，ph7.5的磷酸缓冲液，进样到层析柱中，使用含高盐的缓冲液进行洗脱，收集洗脱组分，获得粗分离组分。或者，对于疏水层析，与杂质蛋白相比，口蹄疫病毒抗原的疏水性较强，因此可以选用疏水层析进行分离，其方法为：室温下加入硫酸铵粉末使得上清组分的电导不低于130ms/cm，进样到层析柱中，使用电导小于5ms/cm的缓冲液进行洗脱，收集洗脱组分，获得粗分离组分。或者，对于peg沉淀，加入peg至上清中，置于4℃过夜沉淀，10000rpm离心10min，将离心后的沉淀溶解于200mm，ph7.5的磷酸盐缓冲液中，复溶后再次10000rpm离心5min，收集上清获得粗分离组分。根据本发明的基于金属螯合亲和层析制备口蹄疫病毒疫苗抗原的方法，其中所述的金属螯合层析，其具体方法优选如下：先将金属螯合层析柱用平衡缓冲液平衡3-5个柱体积，将步骤(1)获得的上清进样到平衡好的层析柱中，层析过程使用280nm和259nm紫外吸收波长进行蛋白检测，进样的体积为0.5-30倍层析柱体积，优选10-20倍层析柱体积；待进样完后，用平衡缓冲液淋洗层析柱3-5个cv；用含有咪唑的洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱组分，从而获得高纯度的灭活口蹄疫病毒抗原。其中，在将步骤(1)获得的上清进样到平衡好的层析柱中的操作中，若在所述的固液分离之后，在所述的将获得的上清进行金属螯合层析之前，还对获得的上清进行粗分离处理，获得粗分离组分，则以获得的粗分离组分进样。粗分离组分中灭活口蹄疫病毒抗原与金属离子配基结合保留在层析柱中，而杂质组分则无法保留，穿透出层析柱。其中，所述金属螯合层析中，使用的金属离子配基为cu2+、co2+、ni2+或zn2+，优选cu2+、ni2+或zn2+，最优选ni2+。其中，所述金属螯合层析中，平衡缓冲液系统可选用磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液或柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，优选磷酸盐缓冲液；平衡缓冲液的浓度为0mm-150mm，ph为6.0-9.0，优选浓度10mm～50mm，ph为7.0-8.0；平衡缓冲液含氯化钠浓度为0m-500mm，优选0m-200mm，含咪唑浓度为0mm-20mm，优选0mm-10mm。其中，所述金属螯合层析中，洗脱缓冲液可选用磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液或柠檬酸盐缓冲液，优选磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液；洗脱缓冲液的浓度为10mm-150mm，优选浓度10mm～50mm；ph为4.0-9.0，进行咪唑梯度洗脱时，ph优选7.0-8.0；洗脱缓冲液含咪唑浓度为0.1-1m。其中，所述金属螯合层析中，洗脱方式可选用咪唑阶梯梯度洗脱或咪唑线性梯度洗脱；其中，咪唑阶梯梯度洗脱的洗脱方法为，依次用含咪唑浓度为10mm、100mm、200mm、300mm、500mm、1000mm的洗脱缓冲液进行洗脱，收集含有口蹄疫抗原的洗脱组分；咪唑线性梯度洗脱方法为，平衡缓冲液→含咪唑浓度为1m的洗脱缓冲液进行线性梯度洗脱，洗脱15-25个柱体积，收集含有口蹄疫抗原的洗脱组分。相对于现有技术，由于本发明采用了能与口蹄疫病毒样颗粒表面特定部位多个组氨酸形成位点特异性结合的金属离子作为亲和配基，可从口蹄疫病毒细胞培养液或口蹄疫病毒细胞培养液粗分离液中特异性捕获口蹄疫抗原，得到高纯度的抗原；本发明以金属螯合层析作为核心的工艺方法，生产工艺稳定，获得产品纯度高，回收率高，易于放大，能同时适用实验室和生产规模灭活口蹄疫病毒抗原的纯化制备。与此同时，制备得到的口蹄疫病毒抗原相比其它常用色谱技术得到的抗原稳定性更高。附图说明图1为实施例1中制备病毒疫苗抗原的分离纯化工艺流程图。图2为实施例2中金属离子螯合层析从培养液中一步纯化口蹄疫灭活病毒抗原线性梯度洗脱色谱图。图3为实施例2中金属离子螯合层析从培养液中一步纯化口蹄疫灭活病毒抗原纯度鉴定的sec-hplc色谱图。图4为实施例5中疏水层析从培养液中纯化口蹄疫灭活病毒抗原纯度鉴定的sec-hplc色谱图。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。实施例1该实施例描述采用疏水层析结合金属螯合层析制备抗原的方法。如图1所示，其显示本实施例制备病毒疫苗抗原的分离纯化工艺流程图。取226mlo型口蹄疫病毒细胞培养液，总蛋白浓度为2.9mg/ml，口蹄疫抗原含量为0.0086mg/ml，使用离心机在4℃下将培养液以9000转离心25分钟后收集上清组分，弃去沉淀。使用硫酸铵粉末将上清电导调为130ms/cm，进样至用20mm，ph7.5，含1m硫酸铵的磷酸盐缓冲液平衡好的butylsepharose4ff疏水层析柱中，柱内介质体积为23ml，层析设备为geaktaexplorer100，紫外280nm和259nm波长吸收检测，流速5ml/min，上样完毕后用20mm，ph7.5含1m硫酸铵的磷酸盐缓冲液继续冲洗至280nm和259nm紫外吸收信号回到基线，再用20mm，ph7.5的磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集洗脱组分，洗脱组分体积约为45ml。将疏水层析洗脱组分直接进样至用20mm，ph7.5含200mm氯化钠，0m咪唑的磷酸盐缓冲液平衡好的金属螯合层析柱中，层析介质采用交联琼脂糖作为基质，金属螯合剂为ida，配基为ni2+，介质体积为3ml，层析设备为geaktaexplorer100，紫外280nm和259nm波长吸收检测，流速1ml/min，上样完毕后用平衡缓冲液继续冲洗至280nm和259nm紫外吸收信号回到基线，洗脱时用平衡缓冲液作为a相，用20mm，ph7.5，含1m咪唑的磷酸盐缓冲液作为b相进行咪唑线性梯度洗脱，洗脱梯度为0％b至50％b，梯度时间为120min，分步收集洗脱组分，第一个洗脱组分即为口蹄疫抗原组分。采用改良lowry法测定样品的总蛋白浓度，采用凝胶高效液相色谱法(sec-hplc，中国专利：201510025994.7)测定样品中灭活口蹄疫抗原的含量。计算各组层析操作获得的口蹄疫抗原的收率和杂蛋白去除率，结果列于表1。表1纯化前后样品总蛋白和146s抗原含量比较当然，本实施例中的粗分离方法还可以是图1中的离子交换层析和peg沉淀，其也能够实现相当的效果。实施例2该实施例描述采用金属螯合层析直接从细胞培养液中一步纯化抗原的方法。取60mlo型口蹄疫病毒细胞培养液，总蛋白浓度为2.9mg/ml，口蹄疫抗原含量为0.0086mg/ml，使用离心机在4℃下将培养液以8000转离心25分钟后收集上清组分，弃去沉淀。将样品上样至用50mm，ph7.0含0m氯化钠，10mm咪唑的磷酸盐缓冲液平衡好的金属螯合层析柱中，层析介质采用交联琼脂糖作为基质，金属螯合剂为nta，配基为ni2+，介质体积为3ml，层析设备为geaktaexplorer100，紫外280nm和259nm波长吸收检测，流速1ml/min，上样完毕后用平衡磷酸盐缓冲液继续冲洗至280nm和259nm紫外吸收信号回到基线，洗脱时用平衡缓冲液作为a相，用50mm，ph7.0，含1m咪唑的磷酸盐缓冲液作为b相进行咪唑线性梯度洗脱，洗脱梯度分别为0％b至50％b，梯度时间为120min，分步收集洗脱组分，第一个洗脱组分即为口蹄疫灭活病毒抗原组分。层析图谱见图2。采用改良lowry法测定样品的总蛋白浓度，采用凝胶高效液相色谱法(中国专利：201510025994.7)测定样品中灭活口蹄疫抗原的含量。计算各组层析操作获得的口蹄疫抗原的收率和杂蛋白去除率，结果列于表2。纯化后获得的抗原纯度检测的sec-hplc图谱见图3。表2纯化前后样品总蛋白和146s抗原含量比较实施例3该实施例描述采用peg沉淀结合金属螯合层析制备抗原的方法。取10mla型灭活口蹄疫病毒培养液，总蛋白浓度为2.0mg/ml，口蹄疫抗原含量为0.008mg/ml，使用离心机在4℃下将培养液以9000转离心25分钟后收集上清组分，弃去沉淀。在上清中加入peg6000，peg浓度为8％。置于4℃过夜沉淀，10000rpm离心10min，将离心后的沉淀溶解于1ml的10mm，ph8.0的磷酸缓冲液。复溶后再次10000rpm离心5min，保留上清组分。将样品上样至用10mm，ph8.0含500mm氯化钠，5mm咪唑的磷酸缓冲液平衡好的金属螯合层析柱中，层析介质采用交联琼脂糖作为基质，金属螯合剂为nta，配基为ni2+，介质体积为3ml，层析设备为geaktaexplorer100，紫外280nm和259nm波长吸收检测，流速1ml/min，上样完毕后用平衡缓冲液继续冲洗至280nm和259nm紫外吸收信号回到基线，洗脱时用10mm，ph8.0的磷酸盐缓冲液作为a相，用10mm，ph8.0，含1m咪唑的磷酸盐缓冲液作为b相进行咪唑阶梯梯度洗脱，洗脱梯度为10％b、20％b，50％b，收集10％b洗脱的组分。采用改良lowry法测定样品的总蛋白浓度，采用凝胶高效液相色谱法(中国专利：201510025994.7)测定样品中灭活口蹄疫抗原的含量。计算各组层析操作获得的口蹄疫抗原的收率和杂蛋白去除率，结果列于表3。表3纯化前后样品总蛋白和146s抗原含量比较实施例4该实施例描述采用金属螯合层析制备抗原工艺的重复性。取300mlo型口蹄疫病毒细胞培养液，总蛋白浓度为2.6mg/ml，口蹄疫抗原含量为0.0086mg/ml，分成5组，每组60ml，分别使用离心机在4℃下将培养液以8000转离心25分钟后收集上清组分，弃去沉淀。将样品上样至用50mm，ph7.0含0m氯化钠，0mm咪唑的磷酸盐缓冲液平衡好的金属螯合层析柱中，层析介质采用交联琼脂糖作为基质，金属螯合剂为ida，配基为ni2+，介质体积为3ml，层析设备为geaktaexplorer100，紫外280nm和259nm波长吸收检测，流速1ml/min，上样完毕后用平衡磷酸盐缓冲液继续冲洗至280nm和259nm紫外吸收信号回到基线，洗脱时用平衡缓冲液作为a相，用50mm，ph7.0，含1m咪唑的磷酸盐缓冲液作为b相进行咪唑线性梯度洗脱，洗脱梯度分别为0％b至50％b，梯度时间为120min，分步收集洗脱组分，第一个洗脱组分即为口蹄疫抗原组分。用该方法制备上述五组样品，计算每份样品的回收率和纯度。采用改良lowry法测定样品的总蛋白浓度，采用凝胶高效液相色谱法(中国专利：201510025994.7)测定样品中灭活口蹄疫抗原的含量。计算各组层析操作获得的口蹄疫抗原的收率和杂蛋白去除率，结果列于表4，显示同一种金属螯合层析制备相同五组的样品具有良好的重复性。表4各组样品纯化后的收率和纯度对比样品组别洗脱体积(ml)杂蛋白去除率(％)抗原收率(％)第1组10.399.172.1第2组1199.074.2第3组10.599.172.5第4组10.899.270.0第5组1199.270.8实施例5该实施例描述分别采用阴离子交换层析、疏水层析、金属螯合层析、阴离子交换层析结合分子筛层析、阴离子交换层析结合金属螯合筛层析、疏水层析结合分子筛层析、疏水层析结合金属螯合层析，共7种工艺从o型灭活口蹄疫病毒培养液中纯化口蹄疫抗原的方法对比。原料为o型口蹄疫病毒培细胞养液，总蛋白浓度为2.6mg/ml，口蹄疫抗原含量为0.0086mg/ml。将o型口蹄疫病毒培细胞养液在4℃下以8000转离心25分钟后收集上清组分，弃去沉淀。层析设备为geaktaexplorer100，紫外280nm和259nm波长吸收检测。离子交换层析根据中国专利cn201510228052.9实施例2中的条件进行；阴离子交换层析结合分子筛层析根据中国专利cn201510228052.9实施例2中的条件进行；疏水层析根据本专利中实施例1的条件进行，疏水层析所得纯化后的抗原的sec-hplc检测图谱见图4。金属螯合层析均采用交联琼脂糖作为基质，金属螯合剂为ida，配基为ni2+。金属螯合层析条件为：将样品上样至用20mm，ph7.5含0.3m氯化钠的磷酸盐缓冲液平衡好的层析柱中，上样完毕后用平衡磷酸盐缓冲液继续冲洗至280nm和259nm紫外吸收信号回到基线，洗脱时用平衡缓冲液作为a相，用20mm，ph7.5，含1m咪唑的磷酸盐缓冲液作为b相进行咪唑线性梯度洗脱，洗脱梯度分别为0％b至50％b，梯度时间为120min，分步收集洗脱组分，第一个洗脱组分即为口蹄疫抗原组分。阴离子交换层析结合金属螯合层析条件：将阴离子交换层析洗脱组分直接进样至用20mm，ph7.5含5mm咪唑的磷酸缓冲液平衡好的金属螯合层析柱中，上样完毕后用20mm，ph7.5含5mm咪唑的磷酸盐缓冲液继续冲洗至280nm和259nm紫外吸收信号回到基线，洗脱时用20mm，ph7.5含5mm咪唑的磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集洗脱组分。疏水层析结合金属螯合层析：将疏水层析洗脱组分直接进样至用10mm，ph8.0含20mm氯化钠和5mm咪唑的磷酸缓冲液平衡好的金属螯合层析柱中，上样完毕后用10mm，ph8.0含20mm氯化钠和5mm咪唑的磷酸缓冲液继续冲洗至280nm和259nm紫外吸收信号回到基线，洗脱时用20mm，ph8.0含20mm氯化钠和15mm咪唑的磷酸缓冲液进行洗脱，收集洗脱组分。采用改良lowry法测定样品的总蛋白浓度，采用凝胶高效液相色谱法(中国专利：201510025994.7)测定样品中灭活口蹄疫抗原的含量。计算各层析方法获得的口蹄疫抗原的收率和杂蛋白去除率，见表5。经过金属螯合层析一步制备获得的样品收率和杂蛋白去除率均高于离子交换层析；虽然金属螯合层析的收率略低于疏水层析，但根据杂蛋白去除率及sec-hplc对层析后抗原的纯度检测结果(图3及图4)，经过金属螯合层析纯化后的抗原具有更高的纯度和抗原浓度。根据sec-hplc检测，经金属螯合层析一步制备获得的口蹄疫灭活病毒抗原峰面积占所有吸收峰峰面积的89.2％，而疏水层析纯化后的抗原为63.8％。在两步层析中，相比于分子筛层析，亲和层析具有更高的收率和更快速、更大的样品处理量。此外，根据测定所得纯化后的抗原浓度，采用金属螯合层析所得的抗原浓度远高于其它层析工艺所得抗原浓度。更高的抗原浓度有利于抗原的储存及储存过程中的稳定性。表5不同纯化工艺制备抗原的纯度和样品回收率实施例6该实施例描述通过上述实施例5中各种工艺制备出的抗原的稳定性。将纯化后获得的抗原无菌过滤后置于4℃保存，分别测定放置三个月期间样品间抗原含量的变化情况比较其稳定性，见表6。经过金属螯合层析制备获得的样品相比于其它层析方法具有优异的稳定性，在4℃放置三个月后抗原含量仍在90％以上。表6不同层析方法制备的抗原在4℃储存三个月期间抗原含量变化情况实施例7该实施例描述分别采用三种不同金属离子作为亲和配基进行抗原的制备。取150mlo型灭活口蹄疫病毒培养液，总蛋白浓度为2.6mg/ml，口蹄疫抗原含量为0.0086mg/ml，使用离心机在4℃下将培养液以9000转离心25分钟后收集上清组分，弃去沉淀。将上清组分平均分成三份，每份10ml。将三组上清组分分别上样至用20mm，ph7.5，含0.3m氯化钠的磷酸盐缓冲液中平衡好的层析柱中，层析介质均采用交联琼脂糖，金属螯合剂为ida，三组配基分别为第1组：cu2+；第2组：ni2+；第3组：zn2+。介质体积为1ml，层析设备为geaktaexplorer100，紫外280nm和259nm波长吸收检测，流速0.5ml/min，上样完毕后用平衡缓冲液继续冲洗至280nm和259nm紫外吸收信号回到基线，洗脱时用20mm，ph7.5含0.3m氯化钠和0.2m咪唑的磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集洗脱组分。采用改良lowry法测定样品的总蛋白浓度，采用凝胶高效液相色谱法(中国专利：201510025994.7)测定样品中灭活口蹄疫抗原的含量。计算各组层析操作获得的口蹄疫抗原的收率和杂蛋白去除率，结果列于表7。其中ni2+的总蛋白去除率及抗原回收率最高。表7各组样品纯化后的收率和纯度对比在本发明的其他一些实施例中，所述的灭活口蹄疫病毒抗原还可以是c型、sat1型、sat2型、sat3型或asia1型，也能够实现同上述实施例中所述基本相当甚至更优的效果。以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12