雌乌贼缠卵腺酶解制备高抗氧化活性多肽的方法与流程

本发明涉及海洋生物活性物质的制备领域，尤其是涉及雌乌贼缠卵腺酶解制备高抗氧化活性多肽的方法。

技术背景

乌贼，又称墨斗鱼或墨鱼，隶属软体动物门，头足纲，乌贼目，乌贼科，分布于世界各大洋，主要生活在热带和温带沿岸浅水中，冬季常迁至较深海域。我国常见并有广泛研究的乌贼有枪乌贼（俗称鱿鱼），金乌贼与无针乌贼等。乌贼鱼性质温和，味微咸，具有补益精气、健脾利水、养血滋阴、治疗高血压、温经通络、收敛止血、美肤等功效，而且，乌贼鱼肉质中含有一种可降低胆固醇的氨基酸，可防止动脉硬化；常吃乌贼鱼也可提高免疫力，防止骨质疏松，缓解倦怠乏力，对食欲不振等作用显著，包括arefneifar,walidsaibi，等对乌贼墨中酶系的研究；culkinf,morisrj对乌贼中的dha、epa两种脂肪酸的研究；除此之外，乌贼缠卵腺也有一定的研究价值，乌贼缠卵腺位于直肠两侧内脏囊壁，开口于外套腔，作用是在产卵的同时分泌腺液将卵粒缠绕起来粘结成串，使卵串附着在海底的海藻或其它物体上。乌贼缠卵腺干制品俗称“墨鱼蛋”主产于我国山东，宁波等地，营养丰富，是山珍海味中的下八珍之一，同时它不仅是烹饪原料中的佳品,在海洋药物研究领域也有重要价值，乌贼缠卵腺中富含k、ca、mg、fe、zn等元素，并且氨基酸种类齐全，eaa(必需氨基酸）含量丰富，比例合理，在当今海洋药物发展中值得一提。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种雌乌贼缠卵腺酶解制备高抗氧化活性多肽的方法，本发明简单易行，提取时间较短，提取效率较高，而且酶解产物的纯度很高。

本发明针对

背景技术：
中提到的问题，采取的技术方案为：雌乌贼缠卵腺酶解制备高抗氧化活性多肽的方法，包括：酶解、纯化、旋蒸冷冻，具体包括以下步骤：

酶解：按照料液比1:2-4配制乌贼缠卵腺匀浆液，调节ph为2.5-3.5，温度为36-37℃，加入乌贼缠卵腺重量2.5-3.8%的复合酶，以双频率超声与微波辐射间隔辅助酶解，酶解30-45分钟，在170-180℃灭活10-15分钟；冷却后，调ph至中性，用低温高速离心机在转速11000-12000r/min、温度-4-0℃条件下离心15-25分钟，取上清液，放入培养皿中待用；双频率超声与微波辐射的交替间隔辅助产生交替的机械效应、热效应和空化效应等作用可使底物蛋白分子化学键断裂，表面结构及结晶结构发生变化，促进底物与酶的作用，显著提高复合酶对雌乌贼缠卵腺的酶解效率；

纯化分段：用直径为50-100mm、孔径为0.35-0.45mm的醋酸纤维微孔滤膜对酶解步骤后的上清液进行抽滤，除去酶解液中的较粗颗粒；然后用超滤装置让酶解液依次通过30kd、10kd、3kd的超滤膜，收集>30kd、10-30kd、3-10kd、<3kd的四个分子段的酶解液，分别收藏备用；通过抽滤与超滤，将酶解产物中的寡肽与多肽分隔成四个不同的分子段，不仅避免了高活性抗氧化肽的浪费，实现了雌乌贼缠卵腺的高效率利用，还可以更加精确与方便地对不同分子段的高氧化活性肽进行清除自由基与还原力方面的测试；

旋蒸冷冻：将不同分子段的酶解液进行旋转蒸发，除去多余水分，分装至培养皿中，放置于-80~-100℃冰箱冷冻；将冷冻24-36小时后的酶解物置于冷冻干燥机中，48-72小时后得到酶解粉末并进行分袋密封备用；将高抗氧化活性肽进行超低温冷冻并低温干燥后封存，有助于保持其抗氧化活性，同时也方便了对其进行保存与运输。

作为优选，复合酶为重量比为3-5:1的胃蛋白酶与木瓜蛋白酶的混合物；复合酶的协同作用可以将底物更加彻底的水解，提高水解效率，降低成本。

作为优选，双频率复合超声与微波辐射交错间隔辅助酶解的步骤为：开启双频率超声波45-60秒，关闭超声波，开启微波辐射10-15秒，关闭微波辐射；开启双频率超声波45-60秒，关闭超声波，开启微波辐射10-15秒，关闭微波辐射；在酶解过程中持续地以双频率超声与微波辐射交错间隔辅助酶解；以双频率超声与微波辐射交错间隔辅助酶解，不仅可以为酶解体系提供能量，维持酶解所需温度，而且双频率超声与微波辐射的交替间隔辅助还可以大大提高酶解效率，降低酶解时间，同时保证了酶解的彻底性与准确性，节约了成本。

作为优选，双频率超声波的超声频率与超声密度分别为23-25khz、0.30-0.35w/cm²与63-65khz、0.50-0.55w/cm²，微波辐射的功率为100-180w；双频率复合超声波的双空化效应可以产生叠加作用与协同作用，所产生的空化效应较之单频甚至双频交替要强的多，其所产生的空化崩溃次数也较多，更加高效的打散团聚的蛋白质分子与酶分子，使酶与底物的接触几率与接触面积大大增大，从而提高酶解效率；微波频率的共振使蛋白质大分子能象偶极子分子一样在微波的作用下产生振荡，这种振荡使蛋白质分子在微波触发下产生相干、有序的振动，从而加快蛋白的酶解。

与现有技术相比，本发明的优点在于：1）通过使用复合酶与双频率复合超声波、微波辐射的辅助，可以将酶解时间由5-7小时降低至30-40分钟，极大地提高了酶解效率，在保证酶解彻底性与精确性的同时大大地节省了时间成本与人工成本；2）本发明方法分别收集了>30kd、10-30kd、3-10kd、<3kd四个分子段的雌乌贼缠卵腺酶解高抗氧化活性肽，不仅方便了对雌乌贼缠卵腺酶解活性肽抗氧化性与还原力的精细化研究，还实现了雌乌贼缠卵腺酶解高抗氧化活性肽的全效利用，避免了浪费。

附图说明

图1是本发明中不同分子段雌乌贼缠卵腺酶解高抗氧化活性肽的dpph自由基清除率与vc对照清除率测定结果图；

图2是本发明中<3kd分子段雌乌贼缠卵腺酶解高抗氧化活性肽不同浓度的dpph自由基清除率与vc对照清除率测定结果图；

图3是本发明中不同分子段雌乌贼缠卵腺酶解高抗氧化活性肽的还原力测定结果图；

图4是本发明中3-10kd分子段雌乌贼缠卵腺酶解高抗氧化活性肽不同浓度的还原力测定结果图；

图5是本发明中不同分子段雌乌贼缠卵腺酶解高抗氧化活性肽的羟自由基清除率与vc对照清除率测定结果图；

图6是本发明中3-10kd分子段雌乌贼缠卵腺酶解高抗氧化活性肽不同浓度的羟自由基清除率与vc对照清除率测定结果图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：

实施例1：

雌乌贼缠卵腺酶解制备高抗氧化活性多肽的方法，具体包括以下步骤：

乌贼缠卵腺酶解液制备：取较多量乌贼缠卵腺匀浆液，在料液比为1:3、酶解温度为37℃、蛋白酶添加量为2.4%乌贼缠卵腺重量、木瓜蛋白酶添加量为0.6%乌贼缠卵腺重量、ph为3.0、酶解时间为7h的条件下进行酶解，酶解后高温灭活、冷却、低温高速离心后备用；

酶解液抽滤：用直径50mm，孔径0.45mm的醋酸纤维微孔滤膜，进行抽滤，除去酶解液中较粗颗粒；

乌贼缠卵腺酶解液多肽分段：用超滤装置让酶解液依次通过30kd、10kd、3kd的超滤膜，分为>30kd、10-30kd、3-10kd、<3kd四个分子段，分别收藏备用。

旋转蒸发：将不同分子段的酶解液进行旋转蒸发，除去多余水分，每个分子段装一到两个培养皿，放置于-80℃冰箱冷冻。

冷冻干燥：将冷冻24h后的酶解物，置于冷冻干燥机，48小时后得到酶解粉末并进行分袋密封备用。

实施例2：

雌乌贼缠卵腺酶解制备高抗氧化活性多肽的方法，包括：酶解、纯化分析、旋蒸冷冻，具体包括以下步骤：

酶解：按照料液比1:3配制乌贼缠卵腺匀浆液，调节ph为3.5，温度为36℃，加入乌贼缠卵腺重量2.5%的胃蛋白酶、木瓜蛋白酶混合物，其中胃蛋白酶、木瓜蛋白酶的重量比为4:1；以双频率超声45秒与微波辐射15秒交替间隔辅助酶解，双频率超声波的超声频率与超声密度分别为25khz、0.32w/cm²与64khz、0.54w/cm²，微波辐射的功率为160w；酶解20分钟后，在体系中加入复合酶重量25‰的（s）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚，再持续酶解20分钟，迅速置于180℃灭活10分钟；冷却后，调ph至中性，用低温高速离心机在转速11000r/min、温度0℃条件下离心25分钟，取上清液，放入培养皿中待用；双频率超声与微波辐射的交替间隔辅助产生交替的机械效应、热效应和空化效应等作用可使底物蛋白分子化学键断裂，表面结构及结晶结构发生变化，促进底物与酶的作用，显著提高复合酶对雌乌贼缠卵腺的酶解效率；但是过长的微波辐射时长会影响胃蛋白酶与木瓜蛋白酶蛋白质的空间结构，进而降低酶的活性，随着反应的进行与微波辐射时长的增加，在酶解反应的中程添加（s）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚，（s）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚在较强酸性环境下可以发生二聚合、三聚合反应，聚合产物可以与胃蛋白酶与木瓜蛋白酶产生亲电作用，防止胃蛋白酶与木瓜蛋白酶蛋白质结构发生变化，从而防止其活性的减低；

纯化分段：用直径为60mm、孔径为0.35mm的醋酸纤维微孔滤膜对酶解步骤后的上清液进行抽滤，除去酶解液中的较粗颗粒；然后用超滤装置让酶解液依次通过30kd、10kd、3kd的超滤膜，收集>30kd、10-30kd、3-10kd、<3kd的四个分子段的酶解液，分别收藏备用；通过抽滤与超滤，将酶解产物中的寡肽与多肽分隔成四个不同的分子段，不仅避免了高活性抗氧化肽的浪费，实现了雌乌贼缠卵腺的高效率利用，还可以更加精确与方便地对不同分子段的高氧化活性肽进行清除自由基与还原力方面的测试；

旋蒸冷冻：将不同分子段的酶解液进行旋转蒸发，除去多余水分，分装至培养皿中，放置于-100℃冰箱冷冻；将冷冻36小时后的酶解物置于冷冻干燥机中，48小时后得到酶解粉末并进行分袋密封备用；将高抗氧化活性肽进行超低温冷冻并低温干燥后封存，有助于保持其抗氧化活性，同时也方便了对其进行保存与运输。

实施例3：

dpph自由基清除率测定：

测定步骤为：分别取适宜浓度雌乌贼缠卵腺高抗氧化活性肽液1ml于试管中，测定<3kd（编号1）、3-10kd（编号2）、10-30kd（编号3）、>30kd（编号4）四个分子段的清除率，并取用清除率最好的分子段设抗氧化活性肽浓度为1mg/ml、3mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml，再进行清除率测定。

配制浓度为1×10^-4mol/ldpph95%乙醇溶液，加入试管中混合均匀，于黑暗处常温避光反应30分钟，另取对照组用等量蒸馏水代替样品，空白组用等量乙醇溶液代替dpph溶液，并用vc作为阳性对照，均在波长为517nm的紫外分光光度计下测定吸光度，按以下公式计算自由基清除率（d）：

d=（1-（ax-ay）/ac）×100%

，其中是为ax加样组吸光度，ay为空白组吸光度，ac为对照组吸光度；dpph自由基清除率测定结果如图1、图2所示。

由图1可知，复合酶酶解雌乌贼缠卵腺高抗氧化肽在<3kd分子段的清除率最高，接下来由高到低依次为3-10kd、>30kd、10-30kd，分别为69.84%、67.9%、46.89%，说明雌乌贼缠卵腺酶解高抗氧化活性肽对自由基具有较高的清除功能，其抗氧化活性较高。

由图2可知，vc在浓度增加的情况下清除率均稳定在90%以上，而<3kd分子段雌乌贼缠卵腺酶解高抗氧化活性肽浓度在10mg/ml时清除率最佳，可达78.82%。

实施例4：

还原力测定：

取干净烘干的带塞试管分别依次加入雌乌贼缠卵腺高抗氧化活性肽2.5ml、1%铁氰化钾2.5ml，混匀后于50℃水浴20分钟，再加入10%三氯乙酸2.5ml，纯水5.0ml和0.1%三氯化铁1ml，混匀后放置10分钟，于700nm处测定吸光度值a，根据每个分子段的吸光度大小，测定<3kd（编号1）、3-10kd（编号2）、10-30kd（编号3）、>30kd（编号4）四个分子段的还原力强弱，吸光度值越大，还原力越强，表示抗氧化能力越强。并取用还原力最好的分子段，设样品浓度为1mg/ml、3mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml，再进行还原力测定，研究随浓度增加，其还原力变化。还原力测定结果如图3、图4所示。

由图3可知，复合酶酶解雌乌贼缠卵腺高抗氧化肽在3-10kd分子段的还原力最好，接下来依次为>30kd、10-30kd、<3kd，吸光度分别为0.2601、0.0899、0.0139。

由图4可知，随样品浓度的增加还原力不断增加，即表示样品抗氧化能力随浓度的增加而增加。

实施例5：

羟自由基清除率测定：

取洁净带塞试管依次加入1.0ml邻二氮菲水溶液（7.5mmol/l）、5.0mlpbs（ph7.4）、1.0mlfeso4溶液（7.5mmol/l）、1ml0.1％h2o2溶液和1ml不同分子段多肽溶液，室温下放置60min，在波长510nm处测吸光度，记为加药管as，以vc为阳性对照，用1ml蒸馏水代替1mlh2o2测其吸光度，记为未损伤管ab；用1ml的蒸馏水代替1ml雌乌贼缠卵腺高抗氧化活性肽测其吸光度，记损伤管ap，按公式计算测定雌乌贼缠卵腺高抗氧化活性肽分别在<3kd（编号1）、3-10kd（编号2）、10-30kd（编号3）、>30kd（编号4）四个分子段的羟自由基清除率d的大小：

d=（（as-ap）/（ab-ap））×100%

，并取用清除率最好的分子段，设样品浓度为设样品浓度为1mg/ml、3mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml，再进行清除率测定，研究随样品浓度增加，其羟自由基清除率的变化。羟自由基清除率测定结果如图5、图6所示。

由图5可知，复合酶酶解乌贼缠卵腺高抗氧化肽在3-10kd分子段的羟自由基清除率最好，达到72.56%，接下来依次为>30kd、10-30kd、<3kd，清除率为40.46%、23.68%、0.58%。

由图6可知，3-10kd分子段的样品的羟自由基清除率随浓度的增加而增加，清除率最佳的是浓度为15mg/ml的样品，而vc的自由基清除率稳定在80%左右。

本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。