一种对氨基苯磺酸金属配合物抗菌剂及其制备方法和应用与流程

本发明涉及抗菌剂领域，尤其涉及一种对氨基苯磺酸金属配合物抗菌剂及其制备方法和其在抗菌领域的应用。

背景技术：

抗菌药物是临床应用最广泛的药物之一，不仅能减少不良反应，还可提高疾病的治愈率，降低病死率，缩短病程，并达到减少医疗费用的目的。其中磺胺是应用最早的一类化学合成抗菌药，在治疗感染性疾病中起着重要作用，目前广泛用于预防和治疗人类和其他动物的细菌感染，具有抗菌谱广、疗效确切、性质稳定、价格便宜等优点。磺胺类药物的抗菌机理为在细菌二氢叶酸的生物合成中和对氨基苯甲酸(p-aminobenzoicacid,paba)竞争性地与酶结合，影响核酸前体物的合成，从而抑制细菌生长和繁殖。

然而许多磺胺类化合物的理化性质、生物利用率和抗菌功效还需进一步改善。目前对于磺胺类化合物的研究十分活跃，许多药物研究致力于磺胺类化合物的深入开发。通常对母体结构进行化学结构修饰，主要包括磺酰胺基结构修饰和苯氨基结构修饰。磺胺类化合物的金属配合物及其抗菌活性研究相对较少。

近年来的最新研究表明，由于协同作用的结果，大部分磺胺类金属配合物通常具有比配体本身更好的抗菌活性。如今对磺胺类金属络合物的研究主要为磺胺类金属超分子络合物。由两个磺胺异噁唑分子、两个水分子和一分子金属盐通过配位键等形成的金属超分子络合物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和结核分枝杆菌均显示出优良的抑制活性。[marquesll,deoliveiragm,langes,decamposmm,grislr.newgold(i)andsilver(i)complexesofsulfamethoxazole:synthesis,x-raystructuralcharacterizationandmicrobiologicalactivitiesoftriphenylphosphine(sulfamethoxazolato-n2)gold(i)and(sulfamethoxazolato)silver(i)inorgchemcommun,2007,10:1083-1087]。含双嘧啶的络合物对部分细菌具有良好抑制活性[chohanzh,shadha,youssoufimh,haddatb.somenewbiologicallyactivemetal-basedsulfonamide.eurjmedchem,2010,45:2893–2901]。这类金属超分子络合物通常结构复杂，合成困难。

与抗菌化合物络合的金属主要包括ag(i)、cu(ii)、ni(ii)、zn(ii)、co(ii)。

磺胺类化合物在使用过程中特别容易出现以下问题：

①磺胺类化合物大多具有较大的毒性；

②磺胺类化合物抗菌活性不够强；

③抗菌效果较好的磺胺类化合物大多合成困难。

最近有一种结构简单，易于合成的钛配体的报道，此类结构是将钛与磺酸基进行配位[yuetaozhao,huaiyuwang,^*xue-fengyu,^*etal.surfacecoordinationofblackphosphorusforrobustairandwaterstability.angew.chem.int.ed.2016,55,5003–5007.]。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供细胞无毒无害的一种对氨基苯磺酸金属配合物及其制备方法和抗菌应用。

具体而言，本发明的目的之一在于提供一类对氨基苯磺酸金属配合物，使对氨基苯磺酸类化合物与金属配位，从而达到更好的抗菌效果。

本发明中，所述对氨基苯磺酸金属配合物具有式(i)所示结构

其中，r选自苯基，所述苯基任选进一步被0-4个羟基、硝基、氨基、醛基、酰基、烷氧基、烷基、卤素原子取代；

m表示金属离子；

x表示配位数；优选表示1-6的自然数；更优选表示1、2、4或6。

优选地，所述磺胺类配体中的r选自被0-2个羟基、硝基、氨基、c1-6烷基、c1-6烷氧基、卤素取代的苯基。

优选地，所述m表示ti(iv)、cu(ii)、ni(ii)、zn(ii)、co(ii)、ag(i)中的一种或多种。

根据本发明的配合物，其中，所述“烷基”是指含1-30个碳原子的烷基；优选低级烷基，即c1-6烷基，包括甲基、乙基、丙级、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、叔戊基、新戊基、己基、异己基，叔己基，季己基等。

所述“烷氧基”是指ro-基团，其中r表示烷基，且具有如上所述的定义。

所述“酰基”是指基团，其中r表示烷基，且具有如上所述的定义。

本发明的另一目的涉及对氨基苯磺酸金属配合物的制备方法。

在此，所述方法包括：使用对氨基苯磺酸或其衍生物在极性溶剂中与含金属离子的溶液进行配位反应得到对氨基苯磺酸钛配合物。

优选地，所述极性溶剂选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、乙二醇、丁二醇中的一种或多种。

优选地，所述反应在30～70℃下反应3～5小时。

优选地，当所述金属离子选自ti(iv)时，使用四异丙醇钛、钛酸四丁酯、钛酸四乙酯中的一种或多种的溶液。

优选地，根据本发明的方法，所述反应中配体的用量相对于金属离子是按照化学计量比的或略过量，即对于1mol金属离子，对应的配体的投料量为1-2xmol。

本发明的目的之三是氨基苯磺酸金属配合物的抗菌应用。

抗细菌方面的研究方案为检测在生理盐水中对氨基苯磺酸金属配合物的抑制细菌效果。

优选的，所用细菌为革兰氏阴性菌大肠杆菌(e.coli)和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(s.aureus)。

细菌实验结果证实，与现有磺胺抗菌化合物相比，本发明的对氨基苯磺酸金属配合物，性能优异，抑菌效果十分突出。这些化合物对革兰阳性菌(金黄色葡萄球菌、masr、藤黄微球菌、枯草杆菌)、革兰阴性菌(大肠杆菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌)都具有良好的抑制活性，且抑制活性较好。

优选地，根据本发明得到的对氨基苯磺酸金属配合物对大肠杆菌(e.coli.)和金黄色葡萄球菌(s.aureus)具有更高的抑制率。

真菌实验结果证实，本发明的对氨基苯磺酸金属配合物，对产朊假丝酵母菌、黄曲霉菌、啤酒酵母菌、白色念珠菌和假丝酵母菌等多种真菌具有广谱、高效的抑制效果。

本发明还进一步涉及对氨基苯磺酸金属配合物的细胞毒性。

在此，研究方法包括：mtt法检测细胞毒性与钙黄绿素/碘化丙啶(calcein-am/pi)染色法检测细胞毒性。

优选的，所用细胞为人肾上皮细胞(293t)、小鼠腹腔巨噬细胞(raw264.7)以及人非小细胞肺癌细胞(a549)。

实验结果表明，氨基苯磺酸金属配合物，细胞毒性低，有望成为高效、安全的抗菌治疗候选药物。

综上所述，与现有技术相比，本发明具有如下效果：

本发明为了给现有磺胺类抗菌化合物提供一种更佳的选择，解决了磺胺类抗菌化合物毒性大、抗菌效率不高、合成困难等问题，设计合成了一系列对氨基苯磺酸金属配合物，将磺胺类似物对氨基苯磺酸与金属配位，这些配合物的合成路线短、制备方法简单、原料易得、可重复性好、可批量生产、效率高、成本较低。进一步地，对配合物的抗细菌活性进行评估，结果显示，与现有磺胺抗菌化合物相比，对氨基苯磺酸金属配合物性能优异，抗菌谱广，抑菌效果十分突出、细胞毒性低。从而为临床抗菌治疗提供了高效、安全的候选药物。

附图说明

图1对氨基苯磺酸钛配合物(ⅳ)的¹hnmr(d2o)谱。

图2空白组与不同浓度对氨基苯磺酸钛配合物(ⅳ)组的大肠杆菌菌落数结果图。

图3对氨基苯磺酸钛配合物(ⅳ)组的大肠杆菌菌落统计结果图。

图4空白组与不同浓度对氨基苯磺酸钛配合物(ⅳ)组的金黄色葡萄球菌菌落数结果图。

图5对氨基苯磺酸钛配合物(ⅳ)组的大肠杆菌菌落统计结果图。

图6人肾上皮细胞(293t)、小鼠腹腔巨噬细胞(raw264.7)以及人非小细胞肺癌细胞(a549)三种细胞对于对氨基苯磺酸钛配合物(ⅳ)的细胞存活率。

图7对基苯磺酸钛配合物(ⅳ)对于人肾上皮细胞(293t)、小鼠腹腔巨噬细胞(raw264.7)以及人非小细胞肺癌细胞(a549)的染色结果。

具体实施方式

下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。

实施例1

按如下方式合成本实施例所用对氨基苯磺酸钛配合物

将1.54g4-氨基-3-甲基苯磺酸(ⅲ)溶于10ml乙醇，在室温下缓慢滴加5ml浓度为0.14g/ml钛酸四丁酯(ⅱ)的乙醇溶液，在30～70℃下搅拌3～5小时，随后冷却至室温，旋转蒸发除去溶剂，残余的固体即为目标产物(ⅳ)。¹hnmr(400mhz,d2o)δ7.52(s,4h),7.14(dd,j＝8.2,1.6hz,4h),6.83(d,j＝8.2hz,4h),2.23(s,12h)。图1为产物(ⅳ)的¹hnmr谱图。

实施例2

按如下方式合成本实施例所用对氨基苯磺酸锌配合物

将1.87g4-氨基-3-甲基苯磺酸(ⅲ)溶于15ml乙醇中，加入400mgnaoh固体，室温搅拌半小时后加入940mg无水硝酸锌(ⅴ)，50～70℃下搅拌3～5小时，冷却后减压蒸馏除去溶剂，残余的固体即为目标产物(ⅵ)。¹hnmr(400mhz,d2o)δ7.56(s,2h),7.16(d,j＝8.1hz,2h),6.88(d,j＝8.1hz,2h),2.28(s,6h)。

实施例3

按如下方式合成本实施例所用对氨基苯磺酸银配合物

将2.03g4-氨基-3-甲氧基苯磺酸(ⅷ)溶于15ml乙醇中，加入123mg氧化银固体，60～70℃下搅拌3～5小时，冷却后过滤，滤液减压蒸馏除去溶剂，残余的固体即为目标产物(ⅸ)。¹hnmr(400mhz,d2o)δ7.54(s,1h),7.08(dd,j＝8.0,1.4hz,1h),6.85(d,j＝8.0hz,1h),3.75(s,3h)。

实施例4

对氨基苯磺酸钛配合物(ⅳ)抑制革兰氏阴性菌大肠杆菌功效研究

接种5个独立的大肠杆菌菌落于5ml新鲜无菌的lb肉汤培养基中，于37℃下培养18h至稳定期。吸取50μl菌悬液至新鲜培养基中37℃下二次培养生长至对数期，生理盐水组取菌液1ml5000rpm离心1min后弃除培养液后以生理盐水清洗沉淀，重复两次后以生理盐水梯度稀释至5×10⁵cfu/ml浓度后备用。

将20-100μg对氨基苯磺酸钛配合物(ⅳ)分别加入1ml生理盐水的细菌悬液中，37℃下孵育3h后，吸取100μl细菌悬液进行涂板，将培养皿至于培养箱中培养24h后进行拍照。图2为大肠杆菌菌落数结果图。

在生理盐水的作用体系中，对氨基苯磺酸钛配合物(ⅳ)有显著的大肠杆菌抑菌功效。在大肠杆菌溶液中对氨基苯磺酸钛配合物(ⅳ)组的抗菌功效与浓度成正比例关系。在100μg/ml浓度时，对氨基苯磺酸钛配合物(ⅳ)组的抗菌率高达92.75％。图3为对氨基苯磺酸钛配合物(ⅳ)组的大肠杆菌菌落统计结果图，纵坐标为抗菌率。

实施例5

对氨基苯磺酸钛配合物(ⅳ)抑制革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌功效研究

接种5个独立的金黄色葡萄球菌菌落于5ml新鲜无菌的lb肉汤培养基中，于37℃下培养18h至稳定期。吸取50μl菌悬液至新鲜培养基中37℃下二次培养生长至对数期，生理盐水组取菌液1ml5000rpm离心1min后弃除培养液后以生理盐水清洗沉淀，重复两次后以生理盐水梯度稀释至5×10⁵cfu/ml浓度后备用。

将20-100μg对氨基苯磺酸钛配合物(ⅳ)分别加入1ml生理盐水的细菌悬液中，37℃下孵育3h后，吸取100μl细菌悬液进行涂板，将培养皿至于培养箱中培养24h后进行拍照。图4为金黄色葡萄球菌菌落数结果图。

在生理盐水的作用体系中，对氨基苯磺酸钛配合物(ⅳ)有较好的金黄色葡萄球菌抑菌功效。在金黄色葡萄球菌溶液中对氨基苯磺酸钛配合物(ⅳ)组的抑菌功效与浓度成正比例关系。在100μg/ml浓度时，对氨基苯磺酸钛配合物(ⅳ)组的抗菌率为69.28％。图5为对氨基苯磺酸钛配合物(ⅳ)组的金黄色葡萄球菌菌落统计结果图，纵坐标为抗菌率。

实施例6

mtt法与钙黄绿素/碘化丙啶(calcein-am/pi)染色法检测对氨基苯磺酸钛配合物(ⅳ)细胞毒性

获得人肾上皮细胞(293t)、小鼠腹腔巨噬细胞(raw264.7)以及人非小细胞肺癌细胞(a549)，培养液为10％胎牛血清(fbs)dmem培养基，培养环境为37℃、5％co2细胞培养箱。细胞以每孔100μl(5-10×10³细胞)加入到96孔细胞培养板内用于细胞毒性实验。

移去96孔板培养基，加入10％fbsdmem稀释的不同浓度对氨基苯磺酸钛配合物(ⅳ)，于培养箱内继续孵育24h。接着移去培养基，加入100μl10％fbsdmem稀释的mtt工作液(0.5mg/ml)继续孵育3-4h。然后移去mtt溶液，加入200μl二甲基亚砜(dmso)溶液并摇床震荡10-15min左右，于酶标仪中测其od490nm的吸光度值(实验组，ae)，并计算细胞存活率(细胞存活率％＝[(ae-ab)/(ac-ab)]×100)。在此需要设置空白孔(只有细胞，ab)以及对照孔(细胞孵育等体积的无菌水，ac)。图6为人肾上皮细胞(293t)、小鼠腹腔巨噬细胞(raw264.7)以及人非小细胞肺癌细胞(a549)三种细胞对于不同浓度对氨基苯磺酸钛配合物(ⅳ)(6.3μg/ml，12.5μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml)的细胞存活率；

钙黄绿素/碘化丙啶(calcein-am/pi)染色法检测细胞毒性：移去96孔板培养基，加入100μg/ml对氨基苯磺酸钛配合物(ⅳ)(分散于10％fbsdmem)，于培养箱内继续孵育24h。接着移去培养基，加入pbs清洗1-2次，加入钙黄绿素/碘化丙啶(calcein-am/pi)工作液(4μg/mlcalcein-am，3μg/mlpi)孵育10-15min(37℃)，pbs洗去染料后，于荧光显微镜下成像(calcein-am选择475nm通道成像，pi选择535nm通道成像)。图7为对基苯磺酸钛配合物(ⅳ)对于人肾上皮细胞(293t)、小鼠腹腔巨噬细胞(raw264.7)以及人非小细胞肺癌细胞(a549)的染色结果。

本发明已经实验证实，对氨基苯磺酸类化合物与ti(iv)配位可得到对氨基苯磺酸钛配合物，并通过核磁鉴定结构(见图1)，对氨基苯磺酸钛配合物对革兰氏阳性菌和革兰阴性菌均有较好的抗菌效果(见图2-图5)；并且通过mtt法与染色法测细胞毒性说明此类结构配合物的细胞毒性较低(见图6，图7)。

类似的，采用同样的方法制备得到了对氨基苯磺酸锌和银配合物，并通过了结构及性质鉴定，其具有与对氨基苯磺酸钛配合物相近的抗菌效果以及较低的细胞毒性。

产业应用性：经过本发明得到的这些化合物的合成路线短、制备方法简单，原料易得，成本较低。且对多种细菌抑制活性较好，细胞毒性较低，具有潜在的临床应用价值。