一种检测铅离子的新型荧光分子探针PP的合成方法与流程

本发明涉及到pb²⁺离子检测技术领域，具体为一种检测铅离子的新型荧光分子探针pp的合成方法。

背景技术：

pb²⁺离子是环境中最有毒的重金属之一，能严重危害人体的健康。我国规定自来水中可接受的pb²⁺离子的最大浓度为50μg/l，长期接触pb²⁺离子可导致神经系统、生殖系统、心脑血管的失调，特别是对于儿童(血液中铅中毒的临界值设置为5μm或者1.0mg/l)。因此，pb²⁺离子的检测引起了研究者的强烈兴趣。

目前，检测pb²⁺离子常用的方法有原子吸收光谱法、分光光度法、比色分析法、电化学方法、电感耦合等离子体发射光谱法等等，这些检测方法虽然都能准确的测定pb²⁺离子，但是这些方法所用仪器设备比较复杂、操作程序繁琐、不能实时在线检测等，所以应用受到了一定限制，近年来，荧光分子探针检测pb²⁺离子由于灵敏度高、选择性好、检测迅速而且使用的荧光分子有望做成便携式荧光传感器，使得这种方法得到了迅速的发展，荧光分子探针是建立在荧光分析和分子识别基础上的一个新兴课题，是一种微量分析技术,所谓荧光分析，是指利用某些物质在紫外光照射后产生的荧光的特性及其强度进行物质的定性和定量的分析的方法,所谓分子识别，就是主体(或受体)对客体(或底物)选择性结合并产生某种特定功能的过程，基于荧光分析的分子识别的主要目的和功能就是将物质之间的相互作用转变成荧光信号发送出来，而执行这种目的的分子(包括小分子、聚合物以及纳米颗粒)都被称作荧光分子探针；

目前已有的检测pb²⁺离子的荧光分子探针有以下几种：

(1)陈群等以氟化硼络合二吡咯甲川类(bodipy)染料为荧光团，二(2-羟基乙基)亚胺为识别体合成的检测pb²⁺离子的荧光分子探针，该探针在hepes缓冲溶液(ph7.4)中，当pb²⁺浓度达到1.0×10^-5mol/l时肉眼可观察到探针荧光强度明显增强；当pb²⁺浓度达到3.0×10^-4mol/l时，探针荧光强度增大20倍以上，且识别作用不受其它金属离子(na⁺、mg²⁺、ca²⁺、cu²⁺、fe²⁺、hg²⁺、ag⁺、cd²⁺、cr³⁺、fe³⁺)干扰，pb²⁺浓度在0.2×10^-5-5.0×10^-5mol/l范围内，探针荧光强度与pb²⁺浓度有较好的线性关系，相关系数为0.998，检出限为0.2μmol/l。

(2)王珊等合成了荧光分子探针5-全氟正己基-硫杂杯[4]芳烃r1，在乙腈/二氯甲烷(v:v＝1:1)的溶液中，pb²⁺离子对r1有明细的荧光增强效应，而其他测试的离子(如ca²⁺、fe³⁺、eu³⁺等)几乎没有引起荧光变化，且r1(2.0×10^-7mol/l)和pb²⁺离子(0-20.0×10^-7mol/l)的浓度均很低。

(3)张琳等以1,8和萘乙二胺为原料合成了一种新的铅离子荧光探针m1，并对其结构进行了表征，荧光光谱实验表明：在乙醇溶液中，m1对pb²⁺离子表现出了识别性能，随pb²⁺离子的加入，其荧光光谱强度发生明显萃灭，而对na⁺、k⁺、ag⁺、hg²⁺、cr³⁺等离子无明细响应，pb²⁺离子在0-9×10^-5mol/l范围内，探针的荧光强度与其浓度成线性关系。

(4)张琦等合成了2-氟-3-吡啶酯基硫桥杯[4]芳烃衍生物f(c64h56f4n4o8s4)，通过荧光光谱实验研究了衍生物f对k⁺、ca²⁺、mg²⁺、pb²⁺、hg²⁺等多种不同金属离子的荧光响应，结果表明，在乙腈/二氯甲烷(v:v＝1:1)的溶液中，f对pb²⁺表现出很好的荧光淬灭效应和良好的选择专一性，并且随着pb²⁺(0-20.0×10^-6mol/l)的增加，荧光淬灭程度增强，而衍生物f对pb²⁺的可识别浓度低至10^-6数量级。

(5)李志英等在ph6.2的弱酸性介质中，用茜素红与铅反应生成荧光络合物，且荧光强度与铅离子的浓度在一定范围内呈线性关系，由此建立了简单快速测定化妆品中的铅含量的方法，该法测定pb²⁺离子浓度的线性范围为8×10^-8-1.2×10^-5mol/l，检出限为1.04×10^-8mol/l。

(6)李敏等通过在罗丹明异羟肟酸衍生物上引入亚氨基二乙酸二乙酯基团，合成了一个新的双功能探针l1，在ph6.5的hepes缓冲溶液中，l1可以高选择性地识别pb²⁺，在荧光光谱上显示出专一的荧光增强；在ph7.2的缓冲溶液中，加入cu²⁺使得l1的溶液由无色变为紫红色，而其它金属离子均没有引起溶液颜色发生明显变化，在紫外可见光谱上对cu²⁺显示出专一的吸收增强，l1对pb²⁺和cu²⁺的最低检测限分别为2.5×10^-7mol/l和5.8×10^-7mol/l，识别可逆且不受其它物种干扰；通过job-plot工作曲线和高分辨质谱分析可知，l1与pb²⁺和cu²⁺的络合比均为1:1，并通过核磁滴定、单晶结构表征和理论计算等方法进一步探讨了l1与pb²⁺和cu²⁺的配位模式以及pb²⁺和cu²⁺诱导罗丹明开环的机理，此外，细胞内pb²⁺的荧光成像实验证明l1具有细胞膜渗透性，可作为潜在的细胞内pb²⁺成像试剂。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种检测铅离子的新型荧光分子探针pp的合成方法，可直接在水溶液中检测，检测速度快，下限低，以解决上述背景技术中提出不能直接在水溶液中检测pb²⁺离子，检测速度不够快，检测下限不够低的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种检测铅离子的新型荧光分子探针pp，荧光分子探针pp包括识别基团、荧光基团和连接臂，连接臂连接识别基团和荧光基团，识别基团可以与底物特异性结合，能够选择性识别底物分子，荧光基团将客体分子和识别基团结合所产生的变化转换为易观察的荧光信号。

本发明提供另一种技术方案为：一种检测铅离子的新型荧光分子探针pp的合成方法，包括以下步骤：

s1：取4.4g(40.69mmol)邻苯二胺，26.8ml(241.67mmol)溴乙酸乙酯，5.1g(34.02mmol)碘化钠和33.3ml(201.47mmol)二异丙基乙胺(dipea)加入40ml乙腈中，回流搅拌反应，过夜，tlc监测反应完全后，将混合物倒入200ml水中，用二氯乙烷萃取(100ml×3)，旋蒸除去有机相溶剂，干燥，粗产物经柱层析提纯(硅胶,石油醚/乙酸乙酯＝3/1,v/v)，得到17.5g(38.67mmol)棕色固体(记为化合物1)，产率95％；

s2：冰浴下，向17.3ml(223.68mmol)dmf中滴加13.2ml(141.61mmol)pocl3，滴加完毕后将混合物搅拌反应1小时，后将含有8g(17.68mmol)化合物1的170ml1，2-二氯乙烷溶液中滴加到反应体系中，回流搅拌反应过夜，反应结束后，将混合物冷却至室温，倒入200ml水中，用二氯甲烷萃取(100ml×3)，除去有机相溶剂，粗产物经柱层析提纯(硅胶,石油醚/乙酸乙酯＝2/1,v/v)，得6.5g(13.54mmol)淡黄色固体(记为化合物2)，产率为76％；

s3：取40g(200.73mmol)吩噻嗪溶于200mldmf中，冰浴下向体系中分批加入nah14g(350mmol)，搅拌15min，再向体系中滴加溴乙烷21ml(279.44mmol)，滴加完毕后将混合物于室温下搅拌反应3小时，反应结束后，将混合物倒入600ml水中，抽滤，干燥，粗产物经柱层析提纯(硅胶,石油醚/二氯甲烷＝1/1,v/v)，得40g(175.96mmol)白色固体(记为化合物3)，产率为88％；

s4：冰浴下，向19ml(245.66mmol)dmf中滴加17ml(182.38mmol)pocl3，滴加完毕后将混合物搅拌反应1小时，后将将含有20g(87.98mmol)化合物3的200ml1,2-二氯乙烷溶液滴加到体系中，回流搅拌反应过夜，反应结束后，将混合物冷却至室温，倒入600ml水中，用二氯甲烷萃取(100ml×3)，除去有机相溶剂，粗产物经柱层析提纯(硅胶,石油醚/二氯甲烷＝1/1,v/v)，得16g(62.67mmol)黄色固体(记为化合物4)，产率为71％；

s5：将2.55g(22.73mmol)叔丁醇钾溶于50ml干燥thf中，氮气保护下，于-40℃下将含有2.15g(11.01mmol)对甲基苯磺酰甲基异腈的17ml干燥thf溶液缓慢滴加到体系中，然后将含有2.6g(10.18mmol)化合物4的17ml干燥thf溶液滴加到混合物中，滴加完毕后，加入50ml干燥甲醇，升温至80℃，反应20分钟，反应结束后，减压蒸馏除去溶剂，再加入10ml冰乙酸，倒入200ml水中，用二氯乙烷萃取(50ml×3)，除去有机相溶剂，粗产物经柱层析提纯(硅胶,石油醚/二氯甲烷＝1/3,v/v)，得1.85g(6.95mmol)黄棕色固体(记为化合物5)，产率为68％；

s6：取1.1g(4.13mmol)化合物5和2.0g(4.16mmol)化合物2溶于100ml无水乙醇中，再加入ch3ona0.23g(4.26mmol)，氮气保护下，将混合物于回流搅拌反应过夜，反应结束后，将混合物冷却至室温，倒入150ml水中，加入nacl盐析，用二氯甲烷萃取(100ml×3)，蒸去溶剂后干燥，粗产物经柱层析提纯(硅胶,石油醚/乙酸乙酯＝3/1,v/v)，得1.3g(1.78mmol)黄色油状液体(记为化合物6)，产率为43％；

pp：取1.3g(1.78mmol)化合物6溶于40ml干燥乙腈中，后加入20ml(208.67mmol)二乙醇胺(dea)，氮气保护下，将混合物回流搅拌反应24小时，反应结束后，旋蒸除去溶剂，后倒入50ml饱和食盐水中，再用nah2po3调节ph至中性，用二氯甲烷萃取(100ml×10)，蒸去溶剂后干燥，粗产物经柱层析提纯(硅胶,二氯甲烷/甲醇/三乙胺＝10/3/1,v/v/v)，得0.5g(0.52mmol)暗黄色油状液体(记为化合物7)，产率为30％。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提出的一种检测铅离子的新型荧光分子探针pp的合成方法，合成得到了检测pb²⁺离子的荧光分子探针pp，pp分子与pb²⁺离子的反应1分钟内即可完成，检测速度快；对pb²⁺离子的检测下限达到了9.11×10^-8mol/l；并且，pp分子检测pb²⁺的选择性非常好，不受溶液中其它离子如cd²⁺,zn²⁺,mn²⁺,cu²⁺,co²⁺,mg²⁺,ca²⁺,ba²⁺,fe²⁺,hg²⁺等的干扰，可以直接在水溶液中检测pb²⁺的浓度；整体可在水溶液中检测，检测速度快，检测下限低。

附图说明

图1为本发明荧光分子探针检测底物的作用原理图；

图2为本发明荧光分子探针pp结构示意图；

图3为本发明荧光分子探针pp合成路线图；

图4为本发明荧光分子探针pp分子在水溶液中的紫外可见吸收光谱，插图中显示的是pp分子与pp+pb²⁺在365nm紫外灯照射下的颜色图；

图5为本发明荧光分子探针pp分子随着pb²⁺加入的荧光发射光谱，插图是pp分子的荧光强度与pb²⁺浓度的关系曲线图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

请参阅图1，一种检测铅离子的新型荧光分子探针pp，荧光分子探针pp包括识别基团、荧光基团和连接臂，连接臂连接识别基团和荧光基团，识别基团可以与底物特异性结合，能够选择性识别底物分子，荧光基团将客体分子和识别基团结合所产生的变化转换为易观察的荧光信号。

实施例2：

请参阅图3，基于上述实施例1描述，还提供一种检测铅离子的新型荧光分子探针pp的合成方法，包括以下步骤：

第一步：取4.4g(40.69mmol)邻苯二胺，26.8ml(241.67mmol)溴乙酸乙酯，5.1g(34.02mmol)碘化钠和33.3ml(201.47mmol)二异丙基乙胺(dipea)加入40ml乙腈中，回流搅拌反应，过夜，tlc监测反应完全后，将混合物倒入200ml水中，用二氯乙烷萃取(100ml×3)，旋蒸除去有机相溶剂，干燥，粗产物经柱层析提纯(硅胶,石油醚/乙酸乙酯＝3/1,v/v)，得到17.5g(38.67mmol)棕色固体(记为化合物1)，产率95％；

第二步：冰浴下，向17.3ml(223.68mmol)dmf中滴加13.2ml(141.61mmol)pocl3，滴加完毕后将混合物搅拌反应1小时，后将含有8g(17.68mmol)化合物1的170ml1，2-二氯乙烷溶液中滴加到反应体系中，回流搅拌反应过夜，反应结束后，将混合物冷却至室温，倒入200ml水中，用二氯甲烷萃取(100ml×3)，除去有机相溶剂，粗产物经柱层析提纯(硅胶,石油醚/乙酸乙酯＝2/1,v/v)，得6.5g(13.54mmol)淡黄色固体(记为化合物2)，产率为76％；

第三步：取40g(200.73mmol)吩噻嗪溶于200mldmf中，冰浴下向体系中分批加入nah14g(350mmol)，搅拌15min，再向体系中滴加溴乙烷21ml(279.44mmol)，滴加完毕后将混合物于室温下搅拌反应3小时，反应结束后，将混合物倒入600ml水中，抽滤，干燥，粗产物经柱层析提纯(硅胶,石油醚/二氯甲烷＝1/1,v/v)，得40g(175.96mmol)白色固体(记为化合物3)，产率为88％；

第四步：冰浴下，向19ml(245.66mmol)dmf中滴加17ml(182.38mmol)pocl3，滴加完毕后将混合物搅拌反应1小时，后将将含有20g(87.98mmol)化合物3的200ml1,2-二氯乙烷溶液滴加到体系中，回流搅拌反应过夜，反应结束后，将混合物冷却至室温，倒入600ml水中，用二氯甲烷萃取(100ml×3)，除去有机相溶剂，粗产物经柱层析提纯(硅胶,石油醚/二氯甲烷＝1/1,v/v)，得16g(62.67mmol)黄色固体(记为化合物4)，产率为71％；

第五步：将2.55g(22.73mmol)叔丁醇钾溶于50ml干燥thf中，氮气保护下，于-40℃下将含有2.15g(11.01mmol)对甲基苯磺酰甲基异腈的17ml干燥thf溶液缓慢滴加到体系中，然后将含有2.6g(10.18mmol)化合物4的17ml干燥thf溶液滴加到混合物中，滴加完毕后，加入50ml干燥甲醇，升温至80℃，反应20分钟，反应结束后，减压蒸馏除去溶剂，再加入10ml冰乙酸，倒入200ml水中，用二氯乙烷萃取(50ml×3)，除去有机相溶剂，粗产物经柱层析提纯(硅胶,石油醚/二氯甲烷＝1/3,v/v)，得1.85g(6.95mmol)黄棕色固体(记为化合物5)，产率为68％；

第六步：取1.1g(4.13mmol)化合物5和2.0g(4.16mmol)化合物2溶于100ml无水乙醇中，再加入ch3ona0.23g(4.26mmol)，氮气保护下，将混合物于回流搅拌反应过夜，反应结束后，将混合物冷却至室温，倒入150ml水中，加入nacl盐析，用二氯甲烷萃取(100ml×3)，蒸去溶剂后干燥，粗产物经柱层析提纯(硅胶,石油醚/乙酸乙酯＝3/1,v/v)，得1.3g(1.78mmol)黄色油状液体(记为化合物6)，产率为43％；

第七步：取1.3g(1.78mmol)化合物6溶于40ml干燥乙腈中，后加入20ml(208.67mmol)二乙醇胺(dea)，氮气保护下，将混合物回流搅拌反应24小时，反应结束后，旋蒸除去溶剂，后倒入50ml饱和食盐水中，再用nah2po3调节ph至中性，用二氯甲烷萃取(100ml×10)，蒸去溶剂后干燥，粗产物经柱层析提纯(硅胶,二氯甲烷/甲醇/三乙胺＝10/3/1,v/v/v)，得0.5g(0.52mmol)暗黄色油状液体(记为化合物7)，产率为30％，暗黄色油状液体即为新型荧光分子探针pp。

经过实验表明，新型荧光分子探针pp是一种能完全在水溶液中检测pb²⁺离子的荧光分子探针；pp分子本身在408nm波长处有可见吸收峰，在365nm的紫外灯照射下呈现黄褐色，与pb²⁺离子结合后呈现草绿色(图4所示)；在408nm波长激发下，pp分子在600nm波长处有明显的荧光发射峰；将pb²⁺离子加入pp水溶液中，pp分子在600nm波长处的荧光发射峰强度明显降低，降低的程度与加入pb²⁺离子的浓度成正比关系(图5所示)；pp分子与pb²⁺离子的反应1分钟内即可完成；对pb²⁺离子的检测下限达到了9.11×10^-8mol/l；并且，pp分子检测pb²⁺的选择性非常好，不受溶液中其它离子如cd²⁺,zn²⁺,mn²⁺,cu²⁺,co²⁺,mg²⁺,ca²⁺,ba²⁺,fe²⁺,hg²⁺等的干扰。

综上所述，本发明提出的一种检测铅离子的新型荧光分子探针pp的合成方法，合成得到了检测pb²⁺离子的荧光分子探针pp，pp分子与pb²⁺离子的反应1分钟内即可完成，检测速度快；对pb²⁺离子的检测下限达到了9.11×10^-8mol/l；并且，pp分子检测pb²⁺的选择性非常好，不受溶液中其它离子如cd²⁺,zn²⁺,mn²⁺,cu²⁺,co²⁺,mg²⁺,ca²⁺,ba²⁺,fe²⁺,hg²⁺等的干扰，可以直接在水溶液中检测pb²⁺的浓度；整体可在水溶液中检测，检测速度快，检测下限低。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。