本发明涉及一种高产环糊精葡萄糖基转移酶的基因工程菌，属于基因工程领域。
背景技术：
维生素c是一种水溶性维生素，参与人体多项生理活动，广泛应用于食品、医药、化妆品等领域。然而，由于自身不稳定，易被氧化降解的性质，严重影响应用。因此vc衍生物成为研究热点，其中2-o-α-d-吡喃葡萄糖基抗坏血酸(aa-2g)，具有vc正常生理功能、安全性高，并且在胞外稳定存在，成为很好的vc替代品。环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextringlycosyltransferase，简称cgtase，ec2.4.1.19)具有环化、歧化和耦合三种转糖基反应和水解反应。cgtase利用偶联和歧化两种特异转糖基作用将淀粉、环糊精等葡萄糖基供体上的葡萄糖苷转移到vc的c-2位上，得到产物aa-2gn(n＝1，2，3，4，5，6，7)，再利用葡糖淀粉酶(glucoamylase)将aa-2gn较长的糖链降解为成只连接一个葡萄糖基团的aa-2g。影响aa-2g转化效率的关键是糖基转移酶的选择，目前为止，有报道的用于aa-2g合成的糖基转移酶共有5种，分别为α-淀粉酶(α-amylase)、α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)、蔗糖磷酸化酶(sucrosephosphatase)、α-异麦芽糖基葡糖基糖合成酶(α-isomaltosylglucosaccharide-formingenzyme)和环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextringlycosyltransferase)。其中尤以环糊精葡萄糖基转移酶(cgtase)的强产物特异性而使其成为目前aa-2g生物合成中使用最广泛的酶种。b.stearothermophilis来源的α/β-环糊精葡萄糖基转移酶(α/β-cgtase)具有合成aa-2g的优良性能。本实验室已成功将α/β-cgtase在e.coli异源表达，但aa-2g作为食品、医药添加剂，需要以食品安全菌株作为宿主生产cgtase。
枯草芽孢杆菌b.subtilis是一类广泛分布革兰氏阳性杆状好养型细菌，具备无致病性，环境兼容性好、不易产生抗药性等优点，而且还具有良好的发酵基础，其培养简单快速，具有较强的分泌蛋白质的能力，目前广泛用于生产各种工业用酶。枯草芽孢杆菌遗传背景清晰，实验模式菌株b.subtilis168已完成全基因组测序，并根据发酵工艺需求改造成多种突变体，例如工业上使用的菌株b.subtiliswb600和b.subtiliswb800。b.subtiliswsh13是本实验室以b.subtilisatcc6051a为出发菌株经过定向基因组改造，实现高密度发酵的菌株，减少了发酵过程泡沫、芽孢、胞外淀粉酶和蛋白酶的产生。
为了提高cgtase在枯草枯草芽孢杆菌的异源表达，处理选择合适的表达载体和启动子外，筛选出匹配度高的信号肽也是提高表达量的有效手段。不同的信号肽对不同的异源蛋白表达量的影响不尽相同，毛婷等在枯草芽孢杆菌wb600表达系统筛选不同信号肽(esta、bpr、vpr、yncm、yvgo和ywbn)对cgtase表达量的影响，在相同的发酵条件下，esta信号肽介导的分泌效果最好。前人筛选信号肽所用的样本量较小，通过高通量平台从大样本中筛选出一个适合α/β-cgtase的信号肽就显得尤为重要。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明通过筛选合适的信号肽以及替换n端前的氨基酸，来提高环糊精葡萄糖基转移酶在枯草芽孢杆菌中的表达量。
本发明的第一个目的是提供一株枯草芽孢杆菌基因工程菌，所述基因工程菌表达了氨基酸序列如seqidno.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶α/β-cgtase。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌的宿主菌为枯草芽孢杆菌wsh13，所述枯草芽孢杆菌wsh13是以b.subtilisatcc6051a为出发菌株，通过敲除基因fenb和基因sfp得到。
在本发明的一种实施方式中，所述基因fenb的核苷酸序列如seqidno.19所示，基因sfp的核苷酸序列如seqidno.20所示。
在本发明的一种实施方式中，用于分泌表达所述环糊精葡萄糖基转移酶α/β-cgtase的信号肽sp1的氨基酸序列如seqidno.2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述环糊精葡萄糖基转移酶α/β-cgtase的n前端12个氨基酸替换为氨基酸序列如seqidno.3所示的15个氨基酸。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是以phyd4(kangzhang,lingqiasu,xuguoduan,linaliu,jingwu.high-levelextracellularproteinproductioninbacillussubtilisusinganoptimizeddual-promoterexpressionsystem.microbialcellfactories.2017,16(1):32)为载体构建得到。
本发明的第二个目的是提供所述基因工程菌的构建方法，所述方法具体是：
(1)以b.circulans环糊精葡萄糖基转移酶基因为模板扩增得n端前15个氨基酸的核苷酸序列，以b.stearothermophilus环糊精葡萄糖基转移酶为模板扩增除n端前12个氨基酸的核苷酸序列，利用重叠pcr的方法，将两端序列连接，得到重组环糊精葡萄糖基转移酶基因βn-α/βcgt；
(2)以phyd4为模板扩增载体片段，利用重叠pcr连接sp1与载体片段，得环糊精葡萄糖基转移酶表达载体phyd4-sp1；
(3)以phyd4为模板扩增载体片段，连接载体phyd4-sp1与重组环糊精葡萄糖基转移酶基因βn-α/βcgt，构成表达质粒phyα/βcgtd4-sp1-βn；
(4)然后转化b.subtiliswsh13，得到基因工程菌b.subtiliswsh13(phyα/βcgtd4-sp1-βn)。
本发明的第三个目的是提供基因工程菌高密度发酵的方法，所述方法是将所述枯草杆菌基因工程菌接种至发酵培养基中，控制ph6.5～7.5，培养温度32～35℃，先溶氧维持在25～35％，至溶氧迅速上升，开始流加补料液培养基，当环糊精葡萄糖基转移酶酶活下降时，结束培养。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基为：酵母粉15g/l，玉米浆25g/l，葡萄糖12g/l，(nh4)2-h-citrate1g/l，na2so32g/l，(nh4)2so42.68g/l，k2hpo4·3h2o19.2g/l，nah2po4·h2o4g/l，mgso4·7h2o1g/l，金属离子ptm溶液3ml/l。
在本发明的一种实施方式中，金属离子ptm溶液的组成为：cuso4·5h2o6g/l，ki0.08g/l，mnso4·h2o0.5g/l，na2moo3·2h2o0.2g/l，h3bo30.02g/l，cocl20.5g/l，zncl220g/l，feso4·7h2o65g/l，生物素0.2g/l，h2so45.0g/l。
在本发明的一种实施方式中，所述补料液培养基为：葡萄糖500g/l，mgso4·7h2o7.89g/l，(nh4)2hpo463.36g/l，金属离子ptm溶液40ml。
本发明的第四个目的是提供所述基因工程菌在食品、医药、化妆品中的应用。
附图说明
图1为重组菌3l发酵罐发酵产酶曲线；图中方形代表b.subtiliswsh13(phyα/βcgtd4)，圆形代表b.subtiliswsh13(phyα/βcgtd4-sp1)，三角代表b.subtiliswsh13(phyα/βcgtd4-sp1-βn)。
具体实施方式
环糊精葡萄糖基转移酶酶活测定方法：
将2ml1％可溶性淀粉底物置于水浴锅内预热10min，然后加入适当稀释的环糊精葡萄糖基转移酶酶液0.1ml，反应10min后，加入0.2ml3mhcl终止反应，然后加入0.2ml甲基橙显色液，置于16℃反应15min。在505nm下测定吸光度，计算酶活。一个酶活单位(u)定义为每分钟生成1μmolα-cd所需的酶量。
实施例1：枯草芽孢杆菌转化方法
1.感受态的制备
用接种环沾取冻存的枯草芽孢杆菌，然后在lb平板上划线，37℃培养过夜活化。挑取单菌落接种于10mllb液体培养基中，37℃培养过夜培养8h。取2.5ml培养物接种至40ml含有0.5m山梨醇的lb培养基，37℃200rpm振荡培养至od600达到0.85-0.95之间。将菌液冰水浴10min，然后4℃5000rpm离心5min，收集菌体。用50ml预冷的电转培养基15-20ml重悬菌体，4℃5000rpm离心5min，去上清，如此漂洗4次。将洗涤后的菌体重悬于1ml电转培养基中，0.3ml分装至预冷灭菌的ep管。
2.枯草芽孢杆菌的电击转化
将50ng质粒加入0.3ml感受态细胞，冰上孵育2min，加入预冷的电击杯(1mm)，1800v电击一次。
电击完毕后，取出电击杯并迅速加入1ml预冷的rm培养基。37℃200rpm振荡复苏培养3h后，离心去除大部分上清，重悬细胞，涂在含有相应抗生素的筛选平板上，37℃过夜培养。
培养基配方：
(1)lb+0.5m山梨醇：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl10g/l，山梨醇91g/l。
(2)电转培养基：山梨醇91g/l，甘露醇91g/l，葡萄糖100g/l。
(3)rm：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl10g/l，山梨醇91g/l，甘露醇69g/l。
实施例2：筛选提高环糊精葡萄糖基转移酶在枯草芽孢杆菌表达量的信号肽
使用试剂盒b.subtilissecretoryproteinexpressionsystem购自宝生物公司，筛选信号肽。按照说明书构建质粒pbe-s-α/βcgt及文库pbe-s-α/βcgt-l。以质粒pet-20b(+)-cgtopt(本实验室保藏的b.stearothermophilus来源环糊精葡萄糖基转移酶在大肠杆菌中的表达质粒)为模板，使用引物p1/p2pcr扩增出环糊精葡萄糖基转移酶基因α/β-cgtase，连接到pmd-19t克隆载体上，转化jm109进行扩增。利用酶切位点ecori和bamhⅰ在pbe-s质粒中插入α/β-cgtase基因，然后t4连接酶连接过夜，转化jm109进行扩增，得到质粒pbe-s-α/βcgt。先使用mlui酶切质粒pbe-s-α/βcgt并胶回收纯化，再使用eco52i酶切并胶回收得质粒pbe-s-α/βcgt片段，使用in-fusionhdcloningpluskit连接酶连接质粒pbe-s-α/βcgt和spdnamixture，转化jm109进行扩增，转化子达2000以上，可以用于构建文库，用ddh2o洗脱所有菌落，提质粒，得到文库质粒。按照说明书方法制作b.subtilisrik1285感受态，并转化文库质粒。
使用高通量筛选仪器qpix2(购自moleculardevices公司)，将b.subtilisrik1285转化子挑入每孔装有600μllb培养基的96深孔板，37℃900rpm过夜培养，取50μl培养物转入每孔装有600μltb培养基的96深孔板，37℃900rpm培养2h，再转入33℃发酵。发酵液4000rpm离心20min，取上清200μl于酶标板，使用高通量筛选平台的gridding功能，将发酵液点在含有1.0％可溶性淀粉的固体筛选板，37℃过夜静置后，碘液染色，挑选透明圈大的菌株，重复上述实验。
经过两次筛选的酶活提高的菌株，接种装有50mltb发酵培养基的250ml的三角瓶，先37℃200rpm培养2h，在转入33℃200rpm培养48h。发酵液1200rpm离心5min，取上清使用甲基橙染色法测环化活性。酶活最高的菌株提质粒送测，确定信号肽序列sp1。分别以质粒phyd4和筛选出的质粒为模板，用引p3/p4和p5/p6扩增出带有15bp同源序列的载体片段和信号肽片段，再用in-fusionhdcloningpluskit连接酶连接，得提高环糊精葡萄糖基转移酶在枯草芽孢杆菌中表达量的载体phyd4-sp1。
表1引物
表2ecori和bamhⅰ双酶切体系
37℃酶切反应2h。
表3mlui酶切体系
37℃酶切反应2h。
表4eco52i酶切体系
37℃酶切反应2h。
实施例3：环糊精葡萄糖基转移酶基因工程菌的构建
以质粒phycgtd4(本实验室保藏的b.circulans来源环糊精葡萄糖基转移酶在大肠杆菌中的表达质粒)为模板，用引物p7/p8扩增出b.circulans环糊精葡萄糖基转移酶基n端前15个氨基酸的核苷酸序列，得片段βn；以质粒pet-20b(+)-cgtopt(本实验室保藏的b.stearothermophilus来源环糊精葡萄糖基转移酶在大肠杆菌中的表达质粒)为模板，用引物p9/p10扩增出b.stearothermophilus环糊精葡萄糖基转移酶为模板扩增除n端前12个氨基酸的核苷酸序列的片段cgt。利用重叠pcr的方法，将片段βn与cgt连接，得到重组环糊精葡萄糖基转移酶基因βn-α/βcgt。以载体phyd4-sp1和βn-α/βcgt为模板，用引物p11/p12和p7/p10扩增出带有15bp同源序列的载体片段和基因片段，再用in-fusionhdcloningpluskit连接酶连接，连接产物转化e.colijm109感受态细胞，经37℃培养8h，挑转化子在含有100mg/l氨苄青霉素液体的lb中振荡培养，提取质粒，测序验证得到表达质粒phyα/βcgtd4-sp1-βn。同理，以质粒pet-20b(+)-cgtopt为模板，用引物p13/p10扩增出b.stearothermophilus环糊精葡萄糖基转移酶基因sp1-α/βcgt，连接载体phyd4-sp1和基因sp1-α/βcgt，构建表达质粒phyα/βcgtd4-sp1。以载体phyd4为模板，用引物p11/p14扩增出载体片段phyd4，以质粒pet-20b(+)-cgtopt为模板，用引物p15/p10扩增出b.stearothermophilus环糊精葡萄糖基转移酶基因α/βcgt，连接载体phyd4和基因α/βcgt得表达质粒phyα/βcgtd4。
表5pcr反应体系为：
反应程序如下：94℃预变性4min；98℃10s，55℃10s,72℃1.5min，进行30个循环；72℃延伸10min，降温至4℃。
表6引物序列
采用实施例1中的方法，将质粒phyα/βcgtd4、phyα/βcgtd4-sp1、phyα/βcgtd4-sp1-βn分别转化b.subtiliswsh13，涂布含四环素(20mg/l)的lb平板上，37℃培养8h。挑单菌落至液体lb中，37℃培养过夜，保存甘油管，最终得到重组环糊精葡萄糖基转移酶基因工程菌b.subtiliswsh13(phyα/βcgtd4)、b.subtiliswsh13(phyα/βcgtd4-sp1)、b.subtiliswsh13(phyα/βcgtd4-sp1-βn)。
实施例4：环糊精葡萄糖基转移酶基因工程菌摇瓶酶活
对上述实施例3中构建好的三种环糊精葡萄糖基转移酶基因工程菌进行摇瓶培养，检验环糊精葡萄糖基转移酶表达情况，培养过程如下：吸取10μl的甘油管菌液接种于装有10mllb培养基的50ml三角瓶中，37℃，200rpm培养8-10h。将上述培养以5％(v/v)的接种量接入装有50mltb的250ml三角瓶中发酵罐，37℃，200rpm培养2h。然后33℃，200rpm培养48h。测定胞外葡萄糖基转移酶酶活。得出b.subtiliswsh13(phyα/βcgtd4)酶活为7.99u/ml，b.subtiliswsh13(phyα/βcgtd4-sp1)酶活为11.99u/ml，b.subtiliswsh13(phyα/βcgtd4-sp1-βn)酶活为12.65u/ml。
培养基配方：
(1)lb培养基：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl10g/l。
(2)tb培养基：酵母粉24g/l，蛋白胨12g/l，甘油5g/l，k2hpo412.54g/l，kh2po42.31g/l。
实施例5：环糊精葡萄糖基转移酶基因工程菌3-l罐发酵
对上述实施例3中重组环糊精葡萄糖基转移酶基因工程菌b.subtiliswsh13(phyα/βcgtd4)、b.subtiliswsh13(phyα/βcgtd4-sp1)、b.subtiliswsh13(phyα/βcgtd4-sp1-βn)进行3-l发酵培养，检验环糊精葡萄糖基转移酶的表达情况。培养过程如下：吸取200μl的甘油管菌液接种于装有100mllb培养基的500ml三角瓶中，37℃，200rpm培养8-10h，将上述培养液接入装液量为0.9l的3l发酵罐，以氨水和20％磷酸控制ph7.0，培养温度33℃，通过与搅拌转速偶联和调节通气量将溶氧维持在30％左右，当溶氧迅速上升，开始流加浓度为500g/l的葡萄糖补料液，当环糊精葡萄糖基转移酶酶活下降时结束培养。
培养基配方：
(1)lb培养基：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl10g/l。
(2)发酵培养基：酵母粉15g/l，玉米浆25g/l，葡萄糖12g/l，(nh4)2-h-citrate1g/l，na2so32g/l，(nh4)2so42.68g/l，k2hpo4·3h2o19.2g/l，nah2po4·h2o4g/l，mgso4·7h2o1g/l，金属离子ptm溶液3ml/l。
补料液培养基：葡萄糖500g/l，mgso4·7h2o7.89g/l，(nh4)2hpo463.36g/l，金属离子ptm溶液40ml。
金属离子ptm溶液的组成：cuso4·5h2o6g/l，ki0.08g/l，mnso4·h2o0.5g/l，na2moo3·2h2o0.2g/l，h3bo30.02g/l，cocl20.5g/l，zncl220g/l，feso4·7h2o65g/l，生物素0.2g/l，h2so45.0g/l。
b.subtiliswsh13(phyα/βcgtd4-sp1-βn)发酵培养96h，环糊精葡萄糖基转移酶酶活最优为255.9u/ml。b.subtiliswsh13(phyα/βcgtd4-sp1)发酵培养90h，环糊精葡萄糖基转移酶酶活为150.3u/ml，b.subtiliswsh13(phyα/βcgtd4)发酵培养96h，环糊精葡萄糖基转移酶酶活为110.4u/ml。各菌株发酵最高酶活点sds-page图如图1所示。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110>江南大学
<120>一种高产环糊精葡萄糖基转移酶的基因工程菌
<160>20
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>680
<212>prt
<213>人工序列
<400>1
alaglyasnleuasnlysvalasnphethrseraspvalvaltyrgln
151015
ilevalvalaspargphevalaspglyasnthrserasnasnproser
202530
glyalaleupheserserglycysthrasnleuarglystyrcysgly
354045
glyasptrpglnglyileileasnlysileasnaspglytyrleuthr
505560
aspmetglyvalthralailetrpileserglnprovalgluasnval
65707580
pheservalmetasnaspalaserglyseralasertyrhisglytyr
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trpalaargaspphelyslysproasnprophepheglythrleuser
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asppheglnargleuvalaspalaalahisalalysglyilelysval
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ileileaspphealaproasnhisthrserproalasergluthrasn
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prosertyrmetgluasnglyargleutyraspasnglythrleuleu
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glyglytyrthrasnaspalaasnmettyrphehishisasnglygly
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leualaaspleuasnhisglnasnprovalileaspargtyrleulys
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aspalavallysmettrpileaspmetglyileaspglyileargmet
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aspalavallyshismetpropheglytrpglnlysserleumetasp
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glygluvalglyvaltrpalatyrseralathrgluserthrproile
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ileglyhisvalglyprometmetglyglnvalglyhisglnvalthr
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sertyrprothrtrptyrileaspvalservalprogluglylysthr
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alaleualaalaglyleuilephethrseralaalaproalagluala
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