一种筛选抗猪圆环病毒病猪的CXCL13分子标记育种方法及其应用与流程

本发明涉及分子遗传学技术领域，具体涉及一种筛选抗猪圆环病毒病猪的cxcl13分子标记育种方法及其应用。

背景技术

猪圆环病毒(porcinecircovirus，pcv)属圆环病毒科圆环病毒属，含单股环状dna，基因组大小约为1.7kb，分pcv1(非致病型)和pcv2(致病型)两种类型。pcv2主要感染5～15周龄的猪，引发猪圆环病毒相关疾病，主要表现为断奶后仔猪多系统衰竭综合征、呼吸道疾病综合征、猪皮炎肾炎综合征(allanandellis,2000；stevensonetal.,2001)。pcv2感染机体后优先侵染淋巴组织，导致淋巴细胞减少，从而影响机体对病原体的免疫应答能力，导致机体产生免疫抑制，而且常与许多病原并发或继发感染，加重病情，严重的则会造成机体死亡。

研究发现，猪在感染pcv2后的表现受遗传背景的影响。opriessnig等人研究发现在感染pcv2后，长白猪所表现出的临床症状比杜洛克猪和大白猪更明显。同时，本研究团队前期的研究发现在感染pcv2后，大长杂交猪出现日增重减慢、体温升高、腹泻、肺脏充血、脾脏内淋巴细胞缺失等，而莱芜猪却无明显病变(lietal.,2016)。以上结果表明不同品种猪对pcv2的抗性存在遗传差异，地方品种猪抗pcv2的能力较强，这就为抗猪圆环病毒病猪的育种提供了前提。

分子标记辅助选择育种，是指利用dna分子标记对育种材料进行选择，综合改良选育物种的重要性状，是传统遗传育种与现代分子生物学有机结合的育种方法。目前，针对抗猪圆环病毒病猪的选育，人们希望通过寻找影响抗猪圆环病毒病的主效基因，进而筛选获得与抗猪圆环病毒病密切相关的分子标记，以便实现早期选种，提高育种的准确性。

趋化因子是一类大小在8～14kd的趋化性细胞因子，对白细胞的激活和募集具有重要作用，是免疫系统功能的重要组成部分(moserandloetscher,2001；turneretal.,2014；zlotnikandyoshie,2000)。趋化因子配体13(cxcl13)是cxc趋化因子家族中的一员(anseletal.,2002)，主要在巨噬细胞和树突状细胞内表达(anseletal.,2002；allenandcyster,2008)。cxcl13有助于生发中心的形成(katakaietal.,2003；vandepavertetal.,2009)，吸引b细胞至次级淋巴组织，并能促进抗体产生(manzoetal.,2008；shietal.,2001)。此外，cxcl13能促进成骨细胞增殖(lisignolietal.,2006)，并抑制b细胞凋亡(munoz-fernandezetal.,2012)。敲除cxcl13后，会导致外周淋巴结缺失(anseletal.,2002)，天然抗体产生受阻(anseletal.,2002)，进而导致机体产生免疫抑制。近来研究发现，当受到病原体dna模拟物刺激后，大蒲莲猪cxcl13mrna的表达量显著高于长白猪(huetal.,2016)。这提示cxcl13可能与猪的抗病性相关，但cxcl13的置信区间较大，在此区间内仍然无法确定其关键的变异位点，仍然难以直接应用于猪的改良育种。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种筛选抗猪圆环病毒病猪的cxcl13分子标记育种方法及其应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种与抗猪圆环病毒病相关的分子标记，所述分子标记为seqidno.13所示的核苷酸序列第519位碱基g或a。

seqidno.13所示的核苷酸序列上第519位位点上由a到g的突变会提高猪抗猪圆环病毒病的能力。

本发明的第二方面，提供一组用于检测上述分子标记的引物，所述引物的序列分别如seqidno.10和seqidno.11所示。

本发明的第三方面，提供一种用于检测上述分子标记的试剂盒，包含：上述的引物。

本发明的第四方面，提供上述分子标记、引物或试剂盒在抗猪圆环病毒病猪的选育中的应用。

本发明的第五方面，提供一种猪育种方法，所述方法包括：种猪选育cxcl13基因5′调控区－1014位点的gg基因型个体，淘汰cxcl13基因5′调控区－1014位点的ga基因型和aa基因型个体。

上述育种方法中，gg基因型个体的抗猪圆环病毒病的能力显著高于aa基因型个体和ga基因型个体。

本发明的第六方面，提供一种用于猪育种的检测方法，所述检测方法包括检测猪cxcl13基因5′调控区－1014位点核苷酸为g还是a，来确定基因型，然后通过基因型确定猪的生产性状，其中，所述猪的生产性状为抗猪圆环病毒病能力的高低。

上述检测方法中，检测猪cxcl13基因5′调控区－1014位点核苷酸为g还是a采用的方法为：

提取待测猪的基因组dna，以猪的基因组dna为模板，采用seqidno.10和seqidno.11所示的引物进行扩增，测定扩增产物第519位的核苷酸类型。

优选的，扩增的条件为：94℃90s；98℃20s，54℃20s，72℃72s，35个循环；72℃8min。

本发明的有益效果：

本发明首次发现猪cxcl135′调控区－1014位点碱基(g或a)的不同会在体外试验中改变其启动子在接毒pcv2后的活性，并具有显著差异，可以作为猪抗猪圆环病毒病相关的分子标记。通过检测该分子标记，选择cxcl13基因5′调控区-1014位为gg型的猪只组建基础群进行育种，对于提高猪群体的抗圆环病毒病特性具有重要的意义。检测该分子标记不仅方法简便快速，而且不受环境影响，并可实现早期选种。

附图说明

图1为猪cxcl13基因在脾脏内的荧光定量pcr结果；lw-u：莱芜猪对照组；lw-i：莱芜猪攻毒组；yl-u：大长杂交猪对照组；yl-i：大长杂交猪攻毒组；**p<0.01。

图2为cxcl13pf和cxcl13pr引物pcr扩增猪cxcl13启动子－3407至+79片段电泳图。

图3为cxcl13f1、cxcl13f2、cxcl13f3、cxcl13f4、cxcl13f5和cxcl13pr引物扩增cxcl13启动子删除片段的电泳图；图中，自左至右分别为：扩增cxcl13启动子删除片段长度分别为2745bp、2284bp、1611bp、1168bp和668bp；m：dl10000marker。

图4为构建删除载体，转染pk15细胞荧光素酶检测结果，不同字母间表示差异显著p<0.05。

图5为5′调控区－1014位点多态性的鉴定结果；其中，－1014a：cxcl13基因的5′调控区－1014位碱基为a；－1014g：cxcl13基因的5′调控区－1014位碱基为g。

图6为5′调控区－1014位碱基为a或g时启动子载体的荧光素酶活性检测结果；其中，a中，pgl3-cxcl13(－3407/+79)-u为－1014位多态位点为a的启动子载体对照组；pgl3-cxcl13(－3407/+79)-i为－1014位多态位点为a的启动子载体接毒组；b中，pgl3-cxcl13(－3407/+79)g-u为－1014位多态位点为g的启动子载体对照组；pgl3-cxcl13(－3407/+79)g-i为－1014位多态位点为g的启动子载体接毒组。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图7为cxcl13mf和cxcl13mr引物pcr扩增猪cxcl13启动子－1532至－373片段电泳图；其中，m：dl2000marker。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，不同品种猪对pcv2的抗性存在遗传差异，因此，寻找与pcv2抗性相关的分子标记并用于猪育种是目前亟待解决的问题。基于此，本发明对比了大长杂交猪的pcv2攻毒组和对照组之间脾脏组织内基因mrna水平表达的差异，筛选出了差异表达的基因，并与莱芜猪中相应基因的表达量进行定量分析比较。根据定量验证的结果发现，在大长杂交猪的脾脏中，攻毒组的cxcl13基因的mrna表达极显著下降；而在莱芜猪中的表达相对稳定，且呈现上升趋势(图1)。这提示了cxcl13基因可能与猪圆环病毒病的抗性有关。

为进一步的筛选出猪抗猪圆环病毒病相关的分子标记，建立猪分子标记辅助育种方法，本发明采用了如下方法：

(1)获得猪基因组dna；

(2)以上述猪基因组dna为模板，扩增cxcl13基因的5′调控区序列；

(3)构建cxcl13基因启动子活性检测载体，并以此载体上的启动子片段为模板，通过不同的引物扩增得到不同长度的5′调控区序列，构建启动子删除载体，随后进行细胞培养和转染，利用双荧光素酶报告系统检测不同载体的表达情况，找出调控基因表达的关键元件；

(4)鉴定cxcl13基因5′调控区多态性。

通过对比莱芜猪和大长杂交猪cxcl13基因的5′调控区序列，找到多处核苷酸序列的不同，并对－1014位点存在的g>a多态进行了进一步研究。本发明研究发现，cxcl13基因－1014位点为g时，荧光素酶报告基因活性在接毒pcv2后显著升高，而－1014位点为a时，荧光素酶报告基因活性在接毒pcv2后有下降趋势，提示该位点碱基为g时，对pcv2侵染有积极响应，促进cxcl13的转录，从而提升机体对pcv2的抵抗力。由于在猪攻毒后cxcl13的表达模式和抗猪圆环病毒病相一致，因此通过检测该分子标记，选择cxcl13基因5′调控区－1014位为gg型的猪只组建基础群进行育种，对于提高猪群体的抗猪圆环病毒病特性具有重要的意义。

为此，在本发明的一种实施方案中，提供了一种与抗猪圆环病毒病相关的分子标记，所述分子标记为seqidno.13所示的核苷酸序列第519位碱基g或a。

上述分子标记位于猪cxcl13基因5′调控区－1014位。现有研究发现cxcl13基因可能与猪的抗病性有关，但是，cxcl13基因与猪抗猪圆环病毒病的关系还未见报道，而且，cxcl13基因的置信区间较大，因此在此区间内发现与抗猪圆环病毒病直接相关的关键变异位点的难度极大。

本发明发现，该分子标记的位点处基因型为gg的猪抗猪圆环病毒病的能力显著高于此处基因型为aa或ga的猪。进而，通过检测猪的上述分子标记，能够有效的确定其抗猪圆环病毒病的能力。具体的，检测方法如下：

提取待测猪的基因组dna，以猪的基因组dna为模板，采用seqidno.10和seqidno.11所示的引物进行扩增，测定扩增产物第519位的核苷酸类型是g还是a。

cxcl13mf：5′-catcccatacataccagacact-3′；(seqidno.10)

cxcl13mr：5′-ctttgtgttctcagcatcca-3′；(seqidno.11)

本发明所设计的上述引物具有非常好的特异性，利用本发明的引物能够准确有效的对猪的上述与抗猪圆环病毒病相关的分子标记所在的片段进行pcr扩增，进而通过测序检测能够有效实现对该分子标记的检测，从而能够有效确定猪的抗猪圆环病毒病的能力。

利用所鉴别的主效分子标记可以开展种猪选育，利用分子标记辅助选择有利基因型个体留种生产，以提高猪抗猪圆环病毒病的能力。在本发明的一个优选的实施方案中，给出的猪育种方法，所述方法包括：种猪选育cxcl13基因5′调控区－1014位点的gg基因型个体，淘汰cxcl13基因5′调控区－1014位点的ga基因型和aa基因型个体。从而可以获得在感染pcv2后cxcl13高表达的个体，对于提高猪群的抗猪圆环病毒病特性具有重要意义。

综上所述，本发明通过实验发现猪cxcl13启动子－1014位点碱基(g或a)的不同会在体外试验中改变启动子在pcv2侵染后的活性，而且差异明显，可见检测与突变相关联的分子标记不仅方法简便快速，而且不受环境影响，并可实现早期选种。

本发明中的猪cxcl13启动子－1014位点是指猪cxcl13启动子转录起始位点上游第1014bp的位置。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。

实施例1：猪cxcl13基因5′调控区序列的克隆

基因组提取：取大长杂交猪耳组织，按照tiangen公司tianampgenomicdnakit的说明书进行基因组dna提取。

根据cxcl13基因5′调控区序列(ncbireferencesequence:nc_010450.4)，用dnaman7.0.2.176设计如下：引物cxcl13pf序列如seqidno.1所示，cxcl13pr序列如seqidno.2所示。具体见表1。

表1：

引物中分别加入xhoi和hindiii限制性内切酶酶切位点及其保护碱基(斜体部分)。利用cxcl13pf和cxcl13pr引物扩增cxcl135′调控区－3407bp至+79bp片段，它们包含了从转录起始位点下游79bp到上游3407bp的范围。扩增体系为2×primestargcbuffer(mg²⁺plus)12.5μl，dntps2μl，引物(10μm)各0.5μl，primestar^tmhsdnapolymerase(5u/μl，takara)0.25μl，基因组dna1μl，加ddh2o至总体积25μl。pcr反应条件为94℃5min；98℃10s，65℃15s，72℃3min30s，35个循环；72℃8min。得到pcr产物3486bp(pcr产物的核苷酸序列如seqidno.12所示)，将扩增后的产物与6×loadingbuffer混合后，上样于1％tae琼脂糖凝胶，180v电泳15min，置于紫外灯下观察，pcr扩增cxcl13启动子片段电泳图如图2所示。

实施例2：猪cxcl13启动子载体的构建

1)以pgl3-basic为骨架载体构建cxcl13启动子载体。将pgl3-basic载体和实施例1中得到的cxcl13启动子片段分别用xhoi和hindiii限制性内切酶进行酶切。酶切体系为：10×greenbuffer5μl，xhoi内切酶2μl，hindiii内切酶2μl，pgl3-basic载体4μl(cxcl13启动子片段20μl)，加ddh2o至总体积50μl。以37℃酶切3h。产物上样至1％tae琼脂糖凝胶，180v电泳15min后切胶回收各片段，并按axygen琼脂糖凝胶纯化试剂盒纯化说明书操作得到纯化产物。

2)dna的连接和转化。连接体系为：10μl体系中包括5×rapidligationbuffer2μl，t4dnaligase(5u/μl)0.5μl，载体1μl，插入片段3μl，ddh2o3.5μl，连接条件为22℃30min。转化时取10μl连接产物轻轻加入100μl感受态细胞dh5α中，置于冰上孵育30min，然后42℃热激90s，再冰浴5min，加入1ml温热无抗生素的lb液体培养基，37℃200rpm孵育1h，6000×g离心1min，留100μl上清重悬菌体后均匀地涂布于lb固体培养基上。

3)质粒dna的制备及测序。用无菌牙签在转化后的平板上挑取单菌落，接种于3ml含100μg/ml氨苄青霉素的lb培养液中，37℃200rpm培养12～14h。质粒的提取过程按天根质粒小提试剂盒进行，质粒抽提完成后进行酶切验证。酶切验证体系为：10×greenbuffer1.5μl，xhoi内切酶0.3μl，hindiii内切酶0.3μl，质粒dna2μl，加ddh2o至总体积15μl。以37℃酶切1h。将酶切检测的阳性克隆送于济南铂尚测序部进行测序。得到pgl3-cxcl13(－3407/+79)载体。

实施例3：猪cxcl13启动子删除片段的克隆

根据实施例2获得的pgl3-cxcl13(－3407/+79)载体上的启动子片段序列，用dnaman设计不同的上游引物，cxcl13f1序列如seqidno.3所示，cxcl13f2序列如seqidno.4所示，cxcl13f3序列如seqidno.5所示，cxcl13f4序列如seqidno.6所示，cxcl13f5序列如seqidno.7所示，下游引物仍然为cxcl13pr。具体见表2。

表2：

引物中分别加入xhoi限制性内切酶酶切位点及其保护碱基(斜体部分)。分别利用cxcl13f1、cxcl13f2、cxcl13f3、cxcl13f4、cxcl13f5和cxcl13pr引物扩增cxcl135′调控区－2666bp、－2205bp、－1532bp、－1089bp、－589bp至+79bp片段，它们分别包含了从转录起始位点下游79bp到上游2666bp、2205bp、1532bp、1089bp和589bp的范围。扩增体系为2×primestargcbuffer(mg²⁺plus)12.5μl，dntps2μl，上下游引物(10μm)各0.5μl，primestar^tmhsdnapolymerase(5u/μl)0.25μl，pgl3-cxcl13(－3407/+79)载体质粒1μl，加ddh2o至总体积25μl。pcr反应条件为94℃5min；98℃10s，65℃15s，72℃2min45s，35个循环；72℃8min。得到pcr产物分别为2745bp、2284bp、1611bp、1168bp和668bp，将扩增后的产物与6×loadingbuffer混合后，上样于1.5％tae琼脂糖凝胶，180v电泳15min，置于紫外灯下观察，pcr扩增cxcl13启动子删除片段电泳图如图3所示。

实施例4：猪cxcl13启动子删除载体的构建，荧光素酶活性检测

1)以pgl3-basic为骨架载体构建cxcl13启动子删除载体。pgl3-basic载体和实施例3中得到的cxcl13启动子删除片段的酶切、回收纯化、连接转化、质粒的制备以及测序同实施例2中1)、2)和3)。最终得到pgl3-cxcl13(－2666/+79)、pgl3-cxcl13(－2205/+79)、pgl3-cxcl13(－1532/+79)、pgl3-cxcl13(－1089/+79)和pgl3-cxcl13(－589/+79)载体。

2)将各个载体预存的菌液分别取200μl转接到200mllb液体培养基(含氨苄抗生素)中，37℃200rpm培养12h～16h。8000rpm离心3min，收集菌体至50ml离心管中，用于无内毒素质粒提取，具体操作按照endofreemaxiplasmidkit(tiangen)说明书进行，纯化得到的质粒a260/280在1.8～2.0之间。

3)pk15细胞培养于25cm²/50ml的细胞培养瓶中。所用培养基为dmem培养基(含10％的胎牛血清)。培养至70～80％融合即传代，每2天换1次细胞培养基。

将待转染的细胞用1×pbs(gibco)漂洗贴壁细胞两次，加入37℃预热的0.25％胰酶(gibco)，消化4min，加入无抗生素的完全培养基重悬细胞，细胞计数后每孔按7×10⁴接种至24孔板，24h后用1×pbs洗涤细胞一次，每孔加入500μl新鲜的无抗生素的完全培养基，12h后进行转染，此时细胞汇合度为90％～95％。分别将无启动子的阴性对照载体pgl3-basic、实验载体pgl3-cxcl13(－3407/+79)、pgl3-cxcl13(－2666/+79)、pgl3-cxcl13(－2205/+79)、pgl3-cxcl13(－1532/+79)、pgl3-cxcl13(－1089/+79)和pgl3-cxcl13(－589/+79)七个质粒同时转染pk15细胞系，每孔取750ng目标质粒和18.75ngpgl4.74内参质粒一同稀释至100μl的opti-mem(gibco)中，加入0.75μl的lipofectamine^tmplus(invitrogen)轻轻混匀，5min后加入2μl的lipofectamine^tmltx(invitrogen)转染试剂轻轻混匀，室温孵育30min后轻轻加至每一孔中，混匀，将培养板置于5％co2，37℃培养。6h后更换完全培养基。转染48h后按照双荧光素酶检测试剂盒说明进行荧光素酶测定，测定结果如图4所示。从图4中可以推测在转录起始位点上游－3407至－2666、－1089至－589位点之间存在着增强基因表达的调控元件，在－2205至－1532之间存在抑制基因表达的调控元件。

实施例5：寻找不同猪种cxcl13基因5′调控区多态

利用cxcl13pf和cxcl13pr引物分别扩增莱芜猪(10头莱芜猪dna混池样)和大长杂交猪(10头大长杂交猪dna混池样)cxcl135′调控区－3407bp至+79bp片段。引物序列、扩增体系、反应条件同实施例1。将扩增后的产物与6×loadingbuffer混合上样至1％tae琼脂糖凝胶，180v电泳15min后切胶回收3486bp片段，按axygen琼脂糖凝胶纯化试剂盒纯化说明书操作得到纯化产物，将纯化产物连入pmd^tm18-t载体(takara)中，转化进dh5α感受态细胞。莱芜猪和大长杂交猪分别挑取单菌落10管摇菌，送往济南铂尚测序部进行测序。用dnaman软件进行序列比对，找出了多个多态位点，其中－1014g/a多态位于存在增强基因表达元件的关键区段－1089和－589之间(图5)，且在两猪种间的等位基因频率存在一定差异。

实施例6：荧光素酶报告系统检测－1014位点不同等位基因启动子活性的差异

根据上述多态性的分析结果，对pgl3-cxcl13(－3407/+79)载体进行定点突变。pgl3-cxcl13(－3407/+79)载体上插入片段的目的多态位点为a，通过定点突变引物将其突变成g。定点突变引物设计原则为以目的多态位点a为中心向左右各延伸12～25个碱基，并将目的多态位点a改为g，最终设计得到上游引物－1014f，序列如seqidno.8所示，下游引物－1014r，序列如seqidno.9所示。具体见表3。

表3：

引物中加粗的碱基表示目的多态位点a突变成g。以pgl3-cxcl13(－3407/+79)载体质粒为模板，用－1014f和－1014r引物进行扩增。扩增体系为2×primestargcbuffer(mg2+plus)12.5μl，dntps2μl，引物(10μm)各0.5μl，primestar^tmhsdnapolymerase(5u/μl)0.25μl，pgl3-cxcl13(－3407/+79)载体质粒0.2μl，加ddh2o至总体积25μl。pcr反应条件为94℃5min；98℃10s，68℃15s，72℃8min30s，18个循环；72℃10min。pcr反应后，直接在体系中加入1μldpni，混匀后37℃孵育1小时，以去除原始未突变的模板质粒。随后，直接取10μl产物轻轻加入100μl感受态细胞dh5α中进行转化，转化步骤、质粒dna的制备及测序同实施例2中2)和3)。

为防止在定点突变pcr扩增过程中pgl3-basic载体出现其它偶然突变影响后续的试验结果，测序完成后，将启动子片段中目的多态位点a成功突变成g且没有其它突变碱基的质粒进行双酶切，回收目的多态位点为g的启动子片段，再次进行连接转化、质粒dna的制备及测序，步骤同实施例2中1)、2)和3)。最终得到目的多态位点为g的载体pgl3-cxcl13(－3407/+79)g。

将pgl3-cxcl13(－3407/+79)g载体去内毒素，步骤同实施例4中2)。

将pgl3-cxcl13(－3407/+79)和pgl3-cxcl13(－3407/+79)g质粒转染到pk15细胞，步骤同实施例4中3)。在转染后6h时吸除原有培养基，用1×pbs(gibco)漂洗两次，两种质粒分别设对照组和处理组，处理组接毒pcv2(moi＝0.1tcid50)，因为pcv2保存于pk15细胞裂解液中，所以对照组加入等量的pk15细胞裂解液，置于细胞培养箱中孵育1h。1h后更换成含有1％胎牛血清的dmem，置于细胞培养箱中继续培养。在接毒pcv2后0h、12h、24h、36h和48h时按照双荧光素酶检测试剂盒说明进行荧光素酶测定，测定结果如图6所示。结果显示，5′调控区-1014位碱基为g时，在pcv2侵染后启动子活性显著升高；而-1014位碱基为a时，在pcv2侵染后启动子活性没有明显变化，甚至有下降的趋势。说明，该位点为g时，在感染pcv2后会促进cxcl13转录，有利于机体对抗pcv2。

实施例7：群体检测－1014位点的多态性及标记辅助育种

为了方便，用dnaman重新设计一对用于多态位点检测的标记引物cxcl13m。根据cxcl13基因5′调控区序列(ncbireferencesequence:nc_010450.4)，设计引物如下：引物cxcl13mf序列如seqidno.10所示，cxcl13mr序列如seqidno.11所示，具体见表4。它包含了从转录起始位点上游1532bp到转录起始位点上游373bp之间的范围(序列如seqidno.13所示，序列中第519位碱基为g或a)。

表4：

利用cxcl13mf和cxcl13mr引物扩增cxcl135′调控区－1532bp至－373bp片段，扩增体系为：2×taqmastermix(novoprotein)12.5μl，引物(10μm)各0.5μl，基因组dna1μl，加ddh2o至总体积25μl。pcr反应条件为94℃1min30s；98℃20s，54℃20s，72℃1min12s，35个循环；72℃8min。得到pcr产物1160bp，将扩增后的产物上样于1.5％tae琼脂糖凝胶，180v电泳15min，置于紫外灯下观察，pcr扩增片段电泳图如图7所示。

通过以上方法检测猪cxcl135′调控区－1014位点基因型。不同猪种的检测结果如表5所示。

表5-1014位点等位基因在不同品种猪之间的分布

由表5可以看出，gg型基因频率在本地猪种(莱芜猪和大蒲莲猪)中占优势，而在西方猪种(杜洛克猪、长白猪和大约克猪)中gg基因型基因频率明显较低。将－1014位点等位基因g的有无作为抗病相关基因标记，将携带该抗病基因标记的猪进行繁殖，在仔猪出生后，鉴定该标记，通过综合选种，从中筛选出抗猪圆环病毒病强的猪，即可培养抗猪圆环病毒病的优良猪种。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

sequencelisting

<110>山东农业大学

<120>一种筛选抗猪圆环病毒病猪的cxcl13分子标记育种方法及其应用

<130>2018

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cagacccatatctttgccccacccgtctcattgtaatgctccctctcctcccttgagcaa2100

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