本发明属于免疫治疗领域，具体涉及一种通用性car-t细胞、制备方法及应用。
背景技术
car-t细胞技术是通过将识别肿瘤相关抗原的单链抗体(scfv)和胞内信号域“免疫受体酪氨酸活化基序(itam，通常为cd3ζ)”在体外进行基因重组，生成重组质粒，再在体外转染天然t细胞，纯化和扩增后的t细胞表达嵌合抗原受体(car)，表达car的t细胞称为car-t细胞。car-t细胞能够以抗原依赖、非mhc限制的方式结合肿瘤抗原,启动并活化特异性杀伤肿瘤效应。
目前该技术以已经在肿瘤治疗研究领域取得很大进展，2011年junech等首次报道采取这一技术治愈1例慢性淋巴细胞白血病患者，标志着肿瘤生物治疗跨入新纪元。近年来，car-t细胞技术不断改良和优化，疗效持续提升，应用范围已覆盖多种血液系统恶性肿瘤及实体肿瘤，单中心的临床病例观察中发现，car-t细胞疗法治疗急性淋巴细胞白血病完全缓解率可高达90％，治疗复发抵抗型慢性淋巴细胞白血病有效率达57％，最近也有成功治疗多发性骨髓瘤患者的报道。目前已有超过100项car-t细胞治疗的临床试验在美国nih注册各种固体肿瘤，多项研究为制药巨头诺华、merck等公司发起，除肿瘤之外，学者也开始尝试利用car-t细胞治疗病毒感染性疾病。尽管如此，当前car-t细胞治疗技术发展总的特点是：技术与疗效日益进步，但应用范围仍主要限于肿瘤性疾病；另外，在car-t细胞治疗领域也存在着一些技术缺陷，通常car-t细胞不是通用的没需要根据不同的病人进行制备，制备时间长，制备成本高，对病人病情造成不利影响，其次，难以把控car-t细胞的使用强度，易造成细胞因子风暴等副反应或其它风险。
自身抗体是多种自身免疫性疾病的直接致病因子，它们与自身抗原结合形成抗原抗体复合物沉积于组织介导炎症损伤。系统性红斑狼疮(sle)相关的自身抗体因不具组织特异性介导多系统损伤，而在另一些疾病中，自身抗体主要介导某一种组织器官损伤，如特发性膜性肾病(imn)、iga肾病(igan)、goodpasture`s病等是由相应的自身抗体介导肾小球病变。据2013年中国肾脏登记系统数据显示，iga肾病(igan)、特发性膜性肾病(imn)、狼疮性肾炎(ln)是我国慢性肾脏病患者除糖尿病肾脏疾病、高血压肾损害外最主要的肾小球疾病。自身抗体与肾脏疾病关系密切，目前多种肾脏疾病中关键的自身抗体及其抗原已得到鉴定，如pla2r、gd-iga1和anti-dsdna等，这些肾脏疾病本质是一种自身抗体介导的自身免疫性疾病，研究证明多种自身免疫性疾病是由自身反应性b细胞引起的，迄今为止，还没有出现用于靶向识别并杀伤自身反应性b细胞car-t细胞。
技术实现要素：
为解决上述技术缺陷，本发明提供一种通用性car-t细胞、制备方法及应用。
具体技术方案如下：
一种通用性car-t细胞，其不同之处在于，所述通用性car-t细胞可识别多肽gcn及gcn-自身抗体亲和肽融合多肽，在不同gcn-自身抗体亲和肽融合多肽引导子的引导和调控下，靶向识别并杀伤不同的自身反应性b细胞。
上述技术方案中，所述通用性car-t细胞嵌合抗原受体包括cd3ζ区、共刺激区、跨膜区、铰链区、抗gcn单链抗体区及信号肽，所述抗gcn单链抗体区基因序列如seqidno:1所示。
上述技术方案中，所述cd3ζ区携带seqidno:2所示基因序列，所述共刺激区携带seqidno:3所示基因序列，所述跨膜区携带seqidno:4所示基因序列，所述铰链区携带seqidno:5所示基因序列，所述信号肽携带seqidno:6所示基因序列。
上述通用性car-t细胞的制备方法，其不同之处在于：
(1)合成抗gcn单链抗体区，其序列如seqidno:1所示；
(2)合成含有hinge-tm-cd137-cd3ζ基因序列的质粒pcd-htcc；
(3)将质粒pcd-htcc与载体pcdh-cmv-mcs连接获得载体pcdh-cd137-cd3ζ；
(4)将anti-gcnscfv与载体pcdh-cd137-cd3ζ相接获得质粒psv-car；
(5)将质粒psv-car转至活化t细胞，获得svcar-t细胞。上述通用性car-t细胞在治疗自身免疫性疾病药物中的应用，其特征在于，所述自身免疫性疾病是由自身反应性b细胞引起，所述通用性car-t细胞需通过gcn-自身抗体亲和肽融合多肽引导子的引导和调控，所述gcn-自身抗体亲和肽融合多肽引导子能与所述car-t细胞的抗gcn单链抗体区结合。
上述技术方案中，所述gcn-自身抗体亲和肽融合多肽引导子包括多肽gcn、连接子以及自身抗体亲和肽，所述多肽gcn序列如seqidno:7所示。
上述技术方案中，所述连接子序列如seqidno:8所示。
上述技术方案中，所述自身抗体亲和肽通过所述连接子与所述多肽gcn的n端或c端连接。
上述技术方案中，所述自身免疫性疾病包括自身免疫性肾病。
上述技术方案中，所述通用性car-t细胞通过ppn与ppc的引导与调控在治疗特发性膜性肾病药物中的应用；
所述通用性car-t细胞通过pan及pac的引导与调控在治疗iga肾病药物中的应用；
所述通用性car-t细胞通过pdn及pdc的引导和调控在治疗狼疮性肾炎药物中的应用；
所述通用性car-t细胞通过pman及pmac的引导和调控在治疗mpo型-anca相关血管炎药物中的应用；
所述通用性car-t细胞通过ppan及ppac的引导和调控在治疗pr3型-anca相关血管炎药物中的应用；
其中，所述ppn与ppc的自身抗体亲和肽序列如seqidno:19所示，所述pan与pac的自身抗体亲和肽序列如seqidno:20所示，所述pdn及pdc的自身抗体亲和肽序列如seqidno:21所示，所述pman及pmac的自身抗体亲和肽序列如seqidno:22所示，所述ppan及ppac的自身抗体亲和肽序列如seqidno:23所示。上述技术方案中，ppn序列如seqidno:9所示，ppc序列如seqidno:10所示，pan序列如seqidno:11所示，pac序列如seqidno:12所示，pdn序列如seqidno:13所示，pdc序列如seqidno:14所示，pman序列如seqidno:15所示，pmac序列如seqidno:16所示，ppan序列如seqidno:17所示，ppac序列如seqidno:18所示。
本发明的有益效果在于：
1)本发明设计的通用型car-t细胞所表达的car是通用的，不同于常规car-t细胞需要针对不同病人设计不同的car。临床应用时，既缩短了car-t细胞制备时间，又降低了制备成本。
2)本发明设计的通用型car-t细胞回输入病人体内后，不会立即攻击异常的自身反应性b细胞，而是需要后续输注融合多肽引导子引导；且攻击效能与输注的融合多肽引导子剂量有关。可以很方便的控制car-t细胞体内免疫效应强度或完全关闭，有助于减少一般car-t细胞治疗中的细胞因子风暴等副反应或其它风险。
3)本发明设计的通用型car-t细胞联合融合多肽引导子治疗自身免疫性肾病的新方案可以很方便的应对自身免疫性肾病患者自身反应性b细胞的异质性，不同于常规car-t细胞需要针对不同的靶标设计不同的car；大大节省了时间和成本，提高了成功率。
附图说明
图1.通用性car(svcar)框架结构；
图2.ldh释放实验；
图3.细胞因子il2释放检测；
图4.通用性car-t细胞(svcar-t细胞)表型检测；
图5.细胞靶向杀伤率检测；
图6.小鼠体内靶细胞杀伤率检测。
具体实施方式
下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步详细说明。
实施例一
通用性car-t细胞(svcar-t)的制备
(1)合成抗gcn单链抗体区，其序列如seqidno:1所示；
(2)hinge-tm-cd137-cd3ζ基因序列的获得：按照cd8α、cd137及cd3ζ基因序列设计合成嵌合抗原受体的hinge-tm-cd137-cd3ζ表达框，包括信号肽(携带基因序列如seqidno:6所示)、铰链区(携带基因序列如seqidno:5所示)、cd3ζ区(携带基因序列如seqidno:2所示)、跨膜区(基因序列如seqidno:4所示)、共刺激区(携带基因序列如seqidno:3所示)以及抗gcn单链抗体区(携带seqidno:1序列)进行基因合成，获得质粒命名为pcd-htcc。
(3)hinge-tm-cd137-cd3ζ与载体pcdh-cmv-mcs连接获得载体pcdh-cd137-cd3ζ。
(4)anti-gcnscfv与pcdh-cd137-cd3ζ连接获得质粒psvcar(图1)。
(5)cd3+t细胞的分离：采取免疫磁珠法从人pbmc或小鼠脾脏细胞内分离cd3+t细胞，磁珠筛选获得cd3+t细胞，细胞的纯度高有利于提高cart的效果。
(6)以抗cd3/cd28单抗活化t细胞。
(7)电转法将psvcar转染至活化t细胞，获得svcar-t细胞(通用性car-t细胞)。
实施例二
gcn-自身抗体亲和肽融合多肽(gcn-sp)引导子的制备
1)多肽gcn来源于酵母转录因子gcn4的14个氨基酸肽段，能与svcar前端anti-gcnscfv高亲和性结合，可引导及桥接svcar-t与目标自身反应性b细胞结合，其序列如seqidno：7所示。
2)连接子用于连接多肽gcn与自身抗体亲和肽，其序列为：seqidno:8所示。
3)候选自身抗体亲和肽为已鉴定的自身免疫性肾病相关的自身抗原表位肽或模拟肽：
imn亲和肽pp：序列如seqidno:19所示；
igan亲和肽pa：序列如seqidno:20所示；
ln亲和肽pd：序列如seqidno:21所示；
mpo-aav亲和肽pma：序列如seqidno:20所示；pr3-aav
亲和肽ppa：序列如seqidno:22所示。
4)n端连接方式的ppn、pan、pdn的序列：
●ppn：序列如seqidno:9所示；
●pan：序列如seqidno:11所示；
●pdn：序列如seqidno:13所示；
●pman：序列如seqidno:15所示；
●ppan：序列如seqidno:17所示。
5)c端连接方式的ppc、pac、pdc的序列：
●ppc：序列如seqidno:10所示；
●pac：序列如seqidno:12所示；
●pdc：序列如seqidno:14所示；
●pmac：序列如seqidno:16所示；
●ppac：序列如seqidno:18所示。
实施例三
酶联免疫吸附法检测gcn-sp系列多肽与自身抗体的亲和性检验
1)gcn-sp及对照肽段准备：将实施例二合成的10种gcn-sp与5种对照肽段(pp、pa、pd、pma、ppa)自身抗体的亲和性检测。
2)阴阳性血清准备：
●经临床检验确认含有anti-dsdna抗体的ln患者血清30例；
●经临床检验确认含有anti-pla2r抗体的imn患者血清30例；
●经人gd-iga1检测试剂盒(27600，日本ibl)确认gd-iga1阳性的igan患者血清30例；
●经临床检验确认含有mpo-anca抗体的mpo-aav患者血清30例；
●经临床检验确认含有pr3-anca抗体的pr3-aav患者血清30例；
·阴性对照血清为正常人血清。
3)包被酶标板：将通过步骤1获得的gcn-sp及对照肽段以包被缓冲液(0.05mol/l，ph9.6碳酸盐缓冲液)溶解成1μg/ml，分别包被至酶标板(按100μl/孔的量加入96孔酶标板，4℃包被过夜)。
4)酶标板的封闭：用5％的bsa(以0.01mol/l，ph7.2～7.4的pbs配制)封闭，每孔150μl，37℃温育1h，洗板机洗涤2～3次，吸干。
5)将患者血清、阴性对照血清以含1％bsa的pbs(ph7.2～7.4)以1/10的比例稀释。
6)将步骤5中稀释好的患者血清和阴性对照血清按100μl/孔的量加入包被了相应gcn-sp的酶标板，37℃孵育1小时。
7)弃去孔中溶液，洗板机洗涤3次，吸干。
8)加入hrp标记的二抗：往酶标板孔内加入100μlhrp-兔抗人igg，另设空白对照孔，加入100μl含1％bsa的pbs；37℃孵育30min。
9)弃去孔中溶液，洗板机洗涤4次，吸干。
10)每孔加入tmb显色液100μl，室温避光反应10-15分钟。
11)每孔加入100μl终止液，将酶标板置于酶标仪测定450nm吸光度值(od450nm)。
12)判断标准：以2.1倍阴性对照血清od450nm值作为anti-gcnscfv阳性的cut-off值(co值)，检测孔光吸收值od450nm大于co值为阳性，小于co值为阴性。
13)结果表明：gcn-sp系列多肽与自身抗体的亲和性同未偶联gcn的自身反应性bcr亲和肽无明显差异，患者血清检出率均为100％(表1)。
表1.gcn-sp系列多肽与自身抗体的亲和性
实施例四
酶联免疫吸附法检测gcn-sp系列多肽与anti-gcnscfv的亲和性检测
1)gcn-sp及对照肽段准备：将实施例二合成的10种gcn-sp及对照肽段gcn与anti-gcnscfv进行亲和性检测。
2)抗gcn单链抗体及未免疫小鼠血清准备：
●anti-gcnscfv为商业化单链抗体，购自creativebiolabs；
●未免疫小鼠血清作为anti-gcnscfv的阴性对照。
3)包被酶标板：将通过步骤1获得的gcn-sp及对照肽段gcn以包被缓冲液(0.05mol/l，ph9.6碳酸盐缓冲液)溶解成1μg/ml，分别包被至酶标板(按100μl/孔的量加入96孔酶标板，4℃包被过夜)。
4)酶标板的封闭：用5％的bsa(以0.01mol/l，ph7.2～7.4的pbs配制)封闭，每孔150μl，37℃温育1h，洗板机洗涤2～3次，吸干。
5)将anti-gcnscfv以含1％bsa的pbs(ph7.2～7.4)按1/200、1/400、1/800、1/1600、1/3200、1/6400、1/12800稀释的比例稀释，未免疫小鼠血清以1/10的比例稀释。
6)将步骤5中稀释好的anti-gcnscfv和未免疫小鼠血清按100μl/孔的量加入包被了相应gcn-sp的酶标板，37℃孵育1小时。
7)弃去孔中溶液，洗板机洗涤3次，吸干。
8)加入hrp标记的二抗：往酶标板孔内加入100μlhrp-兔抗小鼠igglightchain，另设空白对照孔，加入100μl含1％bsa的pbs；37℃孵育30min。
9)弃去孔中溶液，洗板机洗涤4次，吸干。
10)每孔加入tmb显色液100μl，室温避光反应10-15分钟。
11)每孔加入100μl终止液，将酶标板置于酶标仪测定450nm吸光度值(od450nm)。
12)判断标准：以2.1倍未免疫小鼠血清od450nm值作为anti-gcnscfv阳性的cut-off值，检测孔光吸收值od450nm大于co值为阳性，小于co值为阴性。
13)结果表明：gcn-sp系列多肽与anti-gcnscfv的亲和性同未偶联自身反应性bcr亲和肽的gcn肽段检测限均达到了1/6400，无明显差异(表2)。
表2.gcn-sp系列多肽与anti-gcnscfv的亲和性
实施例五
gcn-sp调控svcar-t细胞的体外免疫学效应研究
1、靶细胞准备：
a:产生抗ds-dna抗体的细胞：r4a杂交瘤细胞(美国纽约哥伦比亚大学dr.bettydiamond惠赠)；
b:产生gd-iga1抗体的细胞：dakiki细胞株(购自美国atcc)。
c:产生pla2r抗体的细胞(ebv-pla2r-b细胞):从imn患者外周血中分离pbmc，再以免疫磁珠分步分选b细胞、igg-b细胞，以ebv转化后再以免疫磁珠分选igg4-b细胞，有限稀释法挑选pp阳性反应克隆及进行传代培养获得ebv-pla2r-b细胞；
d:产生mpo抗体的细胞(ebv-mpo-b细胞):从mpo-aav患者外周血中分离pbmc，再以免疫磁珠分步分选b细胞、igg-b细胞，以ebv转化后再以免疫磁珠分选igg4-b细胞，有限稀释法挑选pma阳性反应克隆及进行传代培养获得ebv-mpo-b细胞；
e:产生pr3抗体的细胞(ebv-pr3-b细胞):从pr3-aav患者外周血中分离pbmc，再以免疫磁珠分步分选b细胞、igg-b细胞，以ebv转化后再以免疫磁珠分选igg4-b细胞，有限稀释法挑选ppa阳性反应克隆及进行传代培养获得ebv-pr3-b细胞。
2、实验分组
a狼疮性肾炎(ln)检验组：
a1:svcar-t细胞+r4a+pdn(lnn组)：1×105个r4a细胞培养接种至6孔板，培养至第2天，加入1×106个svcar-t细胞及不同浓度的pdn(0、0.1、1、10、100、1000pmol/l)共培养；
a2:svcar-t细胞+r4a+pdc(lnc组)：1×105个r4a细胞培养接种至6孔板，培养至第2天，加入1×106个svcar-t细胞及不同浓度的pdc(0、0.1、1、10、100、1000pmol/l)共培养；
b特发膜性肾病(imn)检验组：
b1:svcar-t细胞+dakiki+pan(imnn组)：1×105个dakiki细胞培养接种至6孔板，培养至第2天，加入1×106个svcar-t细胞及不同浓度的pan(0、0.1、1、10、100、1000pmol/l)共培养；
b2:svcar-t细胞+dakiki+pac(imnc组)：1×105个dakiki细胞培养接种至6孔板，培养至第2天，加入1×106个svcar-t细胞及不同浓度的pac(0、0.1、1、10、100、1000pmol/l)共培养；
ciga肾病检验组：
c1:svcar-t细胞+ebv-pla2r-b+ppn(igann组)：1×105个
ebv-pla2r-b细胞培养接种至6孔板，培养至第2天，加入1×106个
svcar-t细胞及不同浓度的ppn(0、0.1、1、10、100、1000pmol/l)共培养；
c2:svcar-t细胞+ebv-pla2r-b+ppn(iganc组)：1×105个
ebv-pla2r-b细胞培养接种至6孔板，培养至第2天，加入1×106个
svcar-t细胞及不同浓度的ppc(0、0.1、1、10、100、1000pmol/l)共培养。
dmpo型-anca相关血管炎(mpo-aav)检验组：
d1:svcar-t细胞+ebv-mpo-b+ppn(man组)：1×105个
ebv-mpo-b细胞培养接种至6孔板，培养至第2天，加入1×106个
svcar-t细胞及不同浓度的pman(0、0.1、1、10、100、1000pmol/l)共培养；
d2:svcar-t细胞+ebv-mpo-b+ppn(mac组)：1×105个
ebv-mpo-b细胞培养接种至6孔板，培养至第2天，加入1×106个
svcar-t细胞及不同浓度的pmac(0、0.1、1、10、100、1000pmol/l)共培养。
epr3型-anca相关血管炎(pr3-aav)检验组：
e1:svcar-t细胞+ebv-pr3-b+ppn(pan组)：1×105个ebv-pr3-b细胞培养接种至6孔板，培养至第2天，加入1×106个svcar-t细胞及不同浓度的ppan(0、0.1、1、10、100、1000pmol/l)共培养；
e2:svcar-t细胞+ebv-pr3-b+ppn(pac组)：1×105个ebv-pr3-b细胞培养接种至6孔板，培养至第2天，加入1×106个svcar-t细胞及不同浓度的ppac(0、0.1、1、10、100、1000pmol/l)共培养。
3、svcar-t细胞靶向杀伤试验
采取ldh释放试验检测培养上清中中的ldh，来判断svcar-t的细胞靶向杀伤能力，实验结果如图2所示，结果显示：在0.1-10pmol/l范围内，随着引导子浓度增加，svcar-t的靶向杀伤能力明显增强；10、100、1000pmol/l时，可以达到将近100％的杀伤效果。
4、svcar-t细胞活性检测
采取酶联免疫吸附测定法检测培养上清中svcar-t细胞释放的il-2，以此来判断svcar-t的细胞活性，实验步骤按人il-2elisa测定试剂盒(ek0397，博士德)说明书操作。实验结果如图3所示，实验结果表明随着引导子浓度增加，svcar-t细胞活性升高。
5、svcar-t细胞被激活比例
svcar-t细胞激活后，会同时表达cd25及cd69。流式细胞术检测svcar-t细胞激活情况，以cd3-fitc、cd25-pe、cd69-apc对细胞进行染色，facscalibur流式细胞仪检测分析svcar-t细胞激活比例。实验结果如图4所示，结果显示：随着引导子浓度增加，cd3+/cd25+/cd69+的svcar-t细胞比例增多；表明随着引导子浓度增加，svcar-t细胞被激活比例增加。
6、细胞靶向杀伤率检测
靶细胞(r4a杂交瘤细胞、dakiki细胞株、ebv-pla2r-b细胞、ebv-mpo-b细胞、ebv-pr3-b细胞)均为cd3阴性、cd19阳性的细胞，可以通过流式分析将svcar-t细胞和靶细胞区分开，从而检测svcar-t细胞的靶向杀伤率。以cd3-fitc、cd19-apc对细胞进行染色，facscalibur流式细胞仪检测分析cd3－/cd19+靶细胞数量。实验结果如图5所示，结果显示：随着引导子浓度增加，cd3－/cd19+的靶细胞比例减少；表明随着引导子浓度增加，靶细胞的杀伤率升高。
实施例六
gcn-sp调控svcar-t细胞的体内免疫学效应研究
1)从小鼠脾脏中制备svcar-t细胞：同实施例1中所述操作方法。
2)荷瘤小鼠模型制备：以cfse分别标记r4a细胞、dakiki、ebv-pla2r-b细胞、ebv-mpo-b细胞及ebv-pr3-b细胞后，将1×106个细胞注入免疫缺陷nsg小鼠(nod.cg-prkdcscidil2rgtm1wjl/szj)模型小鼠尾静脉。
3)6天后，将1×107个svcar-t细胞从上述小鼠尾静脉注入。
4)svcar-t细胞注射6h后，分别向小鼠尾静脉内注入20μl不同浓度的相应gcn-sp；按小鼠总血量2ml计算，gcn-sp终浓度分别为0、0.1、1、10、100、1000pmol/l。
5)在不同时间点检测：
●小鼠体内靶细胞含量检测：在流式细胞仪下检测小鼠血液中，cfse阳性细胞数量。
6)检测结果：
小鼠体内靶细胞含量：随着引导子浓度增加，cfse标记的靶细胞比例减少；表明随着引导子浓度增加，svcar-t细胞对靶细胞的杀伤率升高，实验结果如图6所示。
这些实例的运用仅用于说明本发明而非限制本发明的保护范围。另外，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改或变型，所有的这些等价形式同样属于本申请所要求限定的保护范围之内。
序列表
<110>武汉圣惠康生物医药科技有限责任公司
<120>一种通用性car-t细胞、制备方法及应用
<160>23
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>597
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
gccgtggtgacccaggagagcgccctgaccagcagccccggcgagaccgtgaccctgacc60
tgccgcagcagcaccggcgccgtgaccaccagcaactacgccagctgggtgcaggagaag120
cccgaccacctgttcaccggcctgatcggcggcaccaacaaccgcgcccccggcgtgccc180
gcccgcttcagcggcagcctgatcggcgacaaggccgccctgaccatcaccggcgcccag240
accgaggacgaggccatctacttctgcgtgctgtggtacagcgaccactgggtgttcggc300
ggcggcaccaagctgaccgtgctgggcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggc360
ggcggcggcagcggcggcggcggcagcgacgtgcagctgcaggagagcggccccggcctg420
gtggcccccagccagagcctgagcatcacctgcaccgtgagcggcttcctgctgaccgac480
tacggcgtgaactgggtgcgccagagccccggcaagggcctggagtggctgggcgtgatc540
tggggcgacggcatcaccgactacaacagcgccctgaagagccgcctgagcgtgacc597
<210>2
<211>336
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
agagtgaagttcagccggagcgccgatgcaccagcatatcagcagggacagaatcagctg60
tacaacgagctgaatctgggcaggcgcgaggaatatgacgtgctggataagcgacgagga120
cgggaccccgaaatgggaggaaaacccagaaggaagaaccctcaggaggggctgtataat180
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cgacgggggaagggacacgatgggctgtaccagggactgtcaaccgccactaaagatacc300
tacgacgcactgcacatgcaggctctgcccccaaga336
<210>3
<211>126
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
aaaagggggcgcaagaaactgctgtacatcttcaagcagccttttatgcgcccagtgcag60
acaactcaggaggaagacggatgctcttgtcggttcccagaggaggaggaaggaggctgc120
gagctg126
<210>4
<211>207
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
acaactacccctgctccacgaccacctactccagcacctaccatcgcaagtcagcccctg60
tcactgcgacctgaggcttgccggccagcagctggaggagcagtgcacacccgaggcctg120
gacttcgcatgcgatatctacatttgggcaccactggctggaacctgtggggtcctgctg180
ctgagcctggtcatcaccctgtattgt207
<210>5
<211>36
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
gagagcaagtacggccccccctgccccccctgcccc36
<210>6
<211>66
<212>dna
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