ADAMTS6基因及其shRNA序列及在抗人肺癌中的应用的制作方法

本发明涉及生物医药领域，具体涉及adamts6基因及其shrna序列及在抗人肺癌中的应用。

背景技术

肺癌已成为我国人群最常见的恶性肿瘤之一，以其高死亡率威胁我国城镇居民健康。随着人口经济社会的高速发展，肺癌的发病率也在急剧增长。许多研究指明，在我国肺癌已成为一种危害公共健康的严重疾病，急切需要行而有效的策略来控制其损害^[1]。

基质金属蛋白酶(adisintegrinandmetalloproteinasewiththrombospondinmotifs，adamts)属于多结构域细胞外蛋白酶家族，根据功能的不同主要包括19个成员，其主要参与分泌多结构基质相关的锌金属内肽酶，其在组织形态发生和病理生理重塑，炎症和血管生物学中具有不同的功能^[2]。在肿瘤研究方面adamts金属蛋白酶显示出肿瘤和抗肿瘤作用，其抗肿瘤作用是蛋白酶依赖性和非依赖性的，并且adamts金属蛋白酶的肿瘤效应主要由它们的蛋白水解活性介导^[3]。例如，rocks等研究者发现adamts-1金属蛋白酶通过体内诱导的基质反应促进肿瘤发展，过表达adamts-1与纤连蛋白、转化生长因子β和白细胞介素-1β的产生增加有关^[4]。dunn等研究者表明具有抗血管生成特性的分泌蛋白酶adamts-8在脑肿瘤中的表达下调，通过qrt-pcr反应检测到在脑肿瘤和脑胶质瘤细胞系中adamts-8的mrna水平较正常全脑水平降低，甲基化特异性pcr显示在24种脑肿瘤以及3种脑胶质瘤中adamts-8启动子呈现高甲基化状态^[5]。chen等研究者表明adamts4在结直肠癌患者组织的呈现高表达状态并且高表达adamts4的患者表现为较差的预后，敲减adamts4可以抑制结直肠癌在裸鼠体内的生长，且通过tcga数据库分析adamts4相关基因主要富集在趋化因子信号通路和细胞因子-细胞因子受体相互作用信号通路^[6]。

adamts6位于5号染色体长臂1区2带3亚带，其表达可受细胞因子tnf-α与tgf-β调节^[6,7]。目前有关于adants6在肿瘤的研究较少，有研究表明adamts6可以通过erk信号传导途径抑制乳腺癌进展，并且作为人乳腺癌的预后标志物^[8]。humanproteinatlas数据库是2003年一项于瑞典启动的质谱组学计划，旨在利用整合各种组学技术，绘制细胞、组织和器官中的所有人类蛋白质图谱，学术界和工业界可公开获取此数据库共享的资源。根据humanproteinatlas网站预测，adamts6在包括肺癌、结肠癌、乳腺癌和子宫内膜癌等多种癌症中高表达且临床患者的5年生存率降低^[9,10]。

基于rnai的治疗剂(包括sirna和shrna)在针对癌基因的特异性治疗中显示出极大的优势，小发夹rna(shorthairpinrna,shrna)是一种形成茎环(hairpinturn)结构的rna序列，可以经由rna干扰(rnainterference,rnai)沉默基因表达^[11]。shrna通常通过质粒、病毒或细菌载体提呈给宿主细胞基因组，从而特异性敲低靶基因在宿主细胞中的表达。shrna具有相对低的降解和转换率，且仅需rnai引导链与靶标间遵循碱基互补配对原则并且快速便捷，因而是rnai技术在生物医药领域的一项重要应用^[12]。在非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer,nsclc)中针对adamts6基因的靶向干扰仍未进行深入研究，因此，本技术旨在利用rnai技术进行adamtd6基因有效稳定的干扰敲减，并为肺癌患者提供新的治疗手段和思路。

参考文献

[1].chenw,zhengr,zengh,zhangs.epidemiologyoflungcancerinchina[j].thoraciccancer.2015；6(2):209-15.

[2].kelwickr,desanlisi,wheelergn,edwardsdr.theadamts(adisintegrinandmetalloproteinasewiththrombospondinmotifs)family[j].genomebiology.2015；16:113.

[3].cals,lópez-otínc.adamtsproteasesandcancer[j].matrixbiology.2015；44-46:77-85.

[4].rocksn,paulisseng,quesada-calvof,munautc,gonzalezml,guedersm,etal.adamts-1metalloproteinasepromotestumordevelopmentthroughtheinductionofastromalreactioninvivo[j].cancerresearch.2008；68(22):9541-50.

[5].dunnjr,reedje,duplessisdg,shawej,reevesp,geeal,etal.expressionofadamts-8,asecretedproteasewithantiangiogenicproperties,isdownregulatedinbraintumours[j].britishjournalofcancer.2006；94:1186.

[6].chenj,luoy,zhouy,qins,qiuy,cuir,etal.promotionoftumorgrowthbyadamts4incolorectalcancer:focusedonmacrophages[j].cellularphysiologyandbiochemistry:internationaljournalofexperimentalcellularphysiology,biochemistry,andpharmacology.2018；46(4):1693-703.

[7].gruberhe,hoelschergl,hanleyen,jr.annuluscellsfrommoredegeneratedhumandiscsshowmodifiedgeneexpressionin3dculturecomparedwithexpressionincellsfromhealthierdiscs[j].thespinejournal:officialjournalofthenorthamericanspinesociety.2010；10(8):721-7.

[8].xiey,gouq,xiek,wangz,wangy,zhengh.adamts6suppressestumorprogressionviatheerksignalingpathwayandservesasaprognosticmarkerinhumanbreastcancer[j].oncotarget.2016；7(38):61273-83.[9].uhlenm,fagerbergl,hallstrombm,lindskogc,oksvoldp,mardinoglua,etal.proteomics.tissue-basedmapofthehumanproteome[j].science(newyork,ny).2015；347(6220):1260419.

[10].uhlenm,oksvoldp,fagerbergl,lundberge,jonassonk,forsbergm,etal.towardsaknowledge-basedhumanproteinatlas[j].naturebiotechnology.2010；28(12):1248-50.

[11].paddisonpj,caudyaa,bernsteine,hannongj,conklinds.shorthairpinrnas(shrnas)inducesequence-specificsilencinginmammaliancells[j].genes&development.2002；16(8):948-58.

[12].kimd,rossij.rnaimechanismsandapplications[j].biotechniques.2008；44(5):613-6.

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种新的抗人肺癌的基因adamts6及其shrna序列，本发明设计的特异性shrna序列可以有效靶向抑制adamts6基因的表达，为未来肺癌基因治疗提供高效和便捷的手段。

本发明的目的可以通过以下措施达到：

本发明提供一种用于抑制抗人肺癌的基因adamts6的shrna，包括如下序列：

shadamts6-1-f:ccugacuuaucuugaacacua(seqidno:2)；

shadamts6-1-r:uaguguucaagauaagucagg(seqidno:3)；

进一步的，上述序列可通过4～10bp的核苷酸形成茎环区、以回文形式相连接而形成发夹结构，如loop结构序列为：uucaagaga。

本发明还提供用于表达所述shrna的dna序列，包括如下序列：

shadamts6-1-f:gatcccctgacttatcttgaacactattcaagagatagtgttcaagataagtcaggttttttg(seqidno:4)；

shadamts6-1-r:aattcaaaaaacctgacttatcttgaacactatctcttgaatagtgttcaagataagtcaggg(seqidno:5)；

本发明还提供上述shrna或上述dna序列在用于制备抗人肺癌疾病药物中的应用。

本发明还提供包含作为活性成分的所述shrna的抗人肺癌组合物。

本发明还提供用于表达所述shrna的重组表达载体。

进一步的，本发明所述的重组表达载体，包含seqidno:4/seqidno:5所述的dna序列。

本发明还提供包含作为活性成分的所述重组表达载体的抗人肺癌组合物。

本发明还提供导入所述重组表达载体的病毒。

本发明构建用于表达所述shrna的重组表达载体，构建adamts6基因敲减稳转肺癌细胞株，均可通过现有技术常规手段进行。检测adamts6的mrna及蛋白质水平的表达也可通过现有基础常规方法，如qrt-pcr及westernblot等现有技术来实现。

本发明还提供基因adamts6在抗人肺癌中的应用。

本发明的有益效果：本shrna的重组表达载体通过在非小细胞肺癌细胞nci-h358的效果可知，可以有效的敲减adamts6的mrna和蛋白水平且抑制效果好。

附图说明

图1是本发明所述干扰序列测序结果，结果显示干扰序列已成功插入lv3-gfp载体。

图2是本发明非小细胞肺癌细胞nci-h358干扰质粒荧光密度图，结果显示干扰序列对细胞株nci-h358的干扰荧光效率高。

图3是本发明非小细胞肺癌细胞nci-h358中adamts6蛋白的mrna水平被干扰序列敲减后较对照组结果，qrt-pcr结果显示adamts6的mrna水平被显著抑制。

图4是本发明非小细胞肺癌细胞包括nci-h358中adamts6的蛋白水平被干扰序列敲减后较对照组结果，westernblot结果显示adamts6的蛋白水平被显著抑制。

具体实施方式

下面，通过本发明的实施例更为详细地描述本发明，但本发明的范围不会受以下实施例的限制。以下实施例中所用试剂和方法，若无特别说明，均为市售产品或本领域的常规方法。

实施例1

1.干扰质粒制备及测序：

通过ncbi网站寻找adamts6基因蛋白质编码序列，如seqidno:1所示，设计adamts6基因的shrna干扰片段的表达dna序列：

shadmats正义链：5′-gatcccctgacttatcttgaacactattcaagagatagtgttcaagataagtcaggttttttg-3′；

shadmats反义链：5′-aattcaaaaaacctgacttatcttgaacactatctcttgaatagtgttcaagataagtcaggg-3′。

并进行干扰质粒克隆(lv3-gfp载体购于上海吉玛有限公司)，将克隆成功的lv3-gfp-shadamts6质粒送至测序公司进行测序，2.敲减质粒进行测序，如图1所示，测序结果显示敲减片段已成功插入lv3-gfp载体。

2.干扰质粒稳定敲减荧光密度观察：

将构建好的lv3-gfp-shadamts6的干扰质粒进行慢病毒包装感染nci-h358细胞，使用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选，通过激光共聚焦显微镜观察细胞干扰病毒后荧光密度，结果如图2所示，对照质粒和敲减干扰质粒已稳定转染入非小细胞肺癌nci-h358细胞中。

3.干扰质粒敲减adamts6基因mrna水平检测：

(1)总rna提取：

a.用pbs洗细胞3次；

b.加入trizol，使其充分接触细胞，将细胞收集入无酶ep管中；

c.加入1/5体积酚氯仿，充分混合；

d.2-8℃,12,000×g转速离心15分钟；

e.取上层水相液体，加入异丙醇，充分混合后，室温静置；

f.在低温离心机中以12,000×g转速离心10分钟，弃上清；

g.使用预冷的75％乙醇进行洗涤，12,000×g转速离心5分钟，倒掉上清后室温干燥rna；

h.加入dnase/rnase-freeddh2o，溶解rna，测定rna浓度。

(2)逆转录

a.以rna总量为1μg为标准，在200μlep管中加入rna、dnase/rnase-freeddh2o及逆转录酶；

b.按照说明书进行逆转录温度设定，将样品放入pcr仪。将rna逆转录成cdna。

(3)荧光实时定量pcr(qrt-pcr)

a.按照说明书将引物、dnase/rnase-freeddh2o、sybrgreen及cdna加入96孔pcr板中；

b.使用abisteponeplus荧光定量pcr仪进行rna定量检测。

(4)结果如图3所示：adamts6干扰序列已经成功将adamts6的mrna在非小细胞肺癌nci-h358细胞中进行稳定敲降，adamts6敲减组下降至对照组的40％左右。(**代表p<0.01)。

4.通过westernblotting实验检测adamts6蛋白敲减水平

(1)蛋白抽提

a.待细胞生长融合至70％-80％，用pbs洗3次；

b.加入含蛋白酶抑制剂cocktail的蛋白裂解液，5分钟后，在冰上刮下细胞；

c.静置30分钟后，充分裂解细胞；

d.4℃，12,000×g，离心15分钟，取上清；

e.用bca法测定蛋白浓度，加入裂解液、蛋白样品、sds制样；

f.煮沸5-10分钟，保存于-20℃冰箱。

(2)免疫蛋白印记

a.跑胶：将预制胶装入垂直电泳槽，倒入runningbuffer，拔出梳齿，每孔上样20ul。

蛋白分子跑浓缩胶时使用60-90mv电压，跑分离胶时使用90-120mv电压。

b.转膜：取出sds-page胶，小心撬开玻璃板，在黑色夹板上垫3-5层滤纸，铺平赶出气泡后依次放sds-page胶、pvdf膜、滤纸，每层注意无气泡，夹紧夹板，放入转膜槽，300ma恒流转膜120分钟。

c.封闭：使用3％bsa封闭pvdf膜2小时。

d.一抗孵育：按说明书比例稀释一抗。将含目的蛋白的条带放入一抗中在冰箱孵育12小时以上。在摇床上洗膜3次。

e.二抗孵育：将目的条带在室温下孵育2小时以上。在摇床上洗膜3次。

f.曝光：小心将目的条带放入曝光机，表面滴加发光显色液，选择合适的曝光时间。

(3)结果如图4所示，adamts6干扰序列已经成功将adamts6蛋白在非小细胞肺癌nci-h358细胞中进行稳定敲减。

序列表

<110>江苏省人民医院

<120>adamts6基因及其shrna序列及在抗人肺癌中的应用

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>3354

<212>dna

<213>人(human)

<400>1

atggaaattttgtggaagacgttgacctggattttgagcctcatcatggcttcatcggaa60

tttcatagtgaccacaggctttcatacagttctcaagaggaattcctgacttatcttgaa120

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tgcagtcgagcatacttcagacagatgtgttgtaagacctgccaaggacactga3354

<210>2

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ccugacuuaucuugaacacua21

<210>3

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

uaguguucaagauaagucagg21

<210>4

<211>63

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gatcccctgacttatcttgaacactattcaagagatagtgttcaagataagtcaggtttt60

ttg63

<210>5

<211>63

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

aattcaaaaaacctgacttatcttgaacactatctcttgaatagtgttcaagataagtca60

ggg63