本发明涉及疾病治疗技术领域，具体涉及一种能与pd-1特异性结合的肿瘤抑制肽突变体及其用途。
背景技术：
程序性细胞死亡蛋白-1(programmeddeath-1，pd-1)及其配体(pd-l1)抑制剂是免疫哨点单抗药物，其应答之广度、深度、和持久性均十分罕见，是近年来肿瘤免疫疗法研究的热点。已上市的尼伏单抗(nivolumab)和潘利珠单抗(pembrolizumab)属于pd-1抑制剂，主要用于黑素瘤和非小细胞肺癌的治疗，对肾细胞癌、膀胱癌、霍奇金淋巴瘤等的疗效也较好。
目前，程序性细胞死亡蛋白-1主要的抑制剂为单克隆抗体，最早做抗pd-1抗体的是curetech公司，他与teva联合将抗pd-1抗体推向了二期临床，但是由于战略合作失败等原因，该药物的临床试验已经中止。随后，日本小野制药和bms联合开发抗pd-1抗体nivolumab，该药已经在日本上市，成为世界上首个pd-1药物靶点的单抗药物。bms目前已经在美国申请bla，预计近期上市。此外，bms公司在肿瘤免疫领域布局已久，首个抗免疫检查点抗体-抗ctla-4抗体就是该公司的产品。此外，罗氏、gsk都盯着pd-1这个药物靶点，其抗pd-1抗体都已经进入临床研究阶段。bms在肿瘤免疫治疗领域布局已久，并且其抗ctla-4抗体上市后取得不错的销量。但是，没想到默克公司后来居上，九月份keytruda率先获批。正是基于pd-1抑制剂巨大的市场前景，目前各大药企均纷纷大举杀入。
根据蛋白的空间结构设计多肽，从而在三维结构上抑制蛋白的功能是目前研究的热点，并且也有多个产品已经上市。基于pd-1抗体研究的高投入和不确定性，针对pd-1的特异性抑制肽的研究也是一个新的研究方向。
cn104098651a中公开了一种具有抗肿瘤活性的pd-l1igv亲和肽及其应用，但是该肽结合位点与本发明并不相同，而且其肽的序列与本发明也相差较多，其效果也各不相同。
申请人在之前申请的cn107383174a中公开了一种能与pd-1特异性结合的肿瘤抑制肽及其用途，该抑制肽对肿瘤生长具有较好的的体内抑制效果。
基于现有技术的需求，寻求更好的与pd-1结合的抑制肽是本领域迫切的需求。
技术实现要素：
针对现有技术的缺陷，本发明人经过大量试验针对前期申请cn107383174a中提出的抑制肽进行活性优化，得到了突变的一种短肽抑制剂，其对pd-1具有显著提高的抑制作用，可用作治疗和/或预防与pd-1有关的疾病的药物活性成分。因此，本发明的目的在于提供一种突变的改进型的短肽抑制剂及其用途。
为实现本发明的目的，本发明采用以下技术方案:
在一方面，本发明提供一种短肽抑制剂，其序列中为seqidno:1所示的氨基酸序列。
在另外一方面，本发明提供一种改进的突变的短肽抑制剂，其序列为seqidno:1所示的氨基酸序列基础上，进行突变。本发明突变后的5种情形：(1)seqidno：1多肽，其突变为10h/q；(2)seqidno：1多肽，其突变为40g/r和42l/s；(3)seqidno：1多肽，其突变为44r/q；(4)seqidno：1多肽，其突变为45k/n；(5)seqidno：1多肽，其突变为97h/i。
优选地，所述短肽抑制剂的序列在n段采用酰胺化修饰，c端连接胆固醇修饰。
本发明另外一方面，提供一种抑制肽-纳米颗粒复合系统，通过以下方式制备与修饰的:
(1)抑制肽:通过fmoc/叔丁基策略和hobt/tbtu/nmm偶联的方法化学合成制备(也可直接由生物公司合成)；
(2)18nm金纳米微球的合成:利用柠檬酸钠还原法一步合成18nm金颗粒；
(3)金纳米棒的合成:利用种子生长法合成金纳米棒；
(4)纳米金颗粒的表面多肽修饰；
(5)修饰后纳米金颗粒的表征:经修饰的金颗粒的物理化学性质可通过测量其光谱以及zeta-电势来表征。
在又一个方面，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的突变后的抗pd-1抑制剂，以及可药用载体。
在又一个方面，本发明提供了用于在有需要的对象中治疗或预防癌症或感染性疾病的方法，其包括将本发明的突变后的多肽/或药物组合物施用给所述对象。
在又一个方面，本发明提供了用于在有需要的对象中增强t细胞免疫应答的方法，其包括将本发明的突变后的多肽/或药物组合物施用给所述对象。在一些实施方案中，所述增强t细胞免疫应答包括增强t细胞的细胞因子产生，优选地所述细胞因子包括il-2和/或ifn-γ。在一些优选的实施方案中，所述增强t细胞的细胞因子产生包括抗cd3抗体刺激的t细胞的细胞因子产生。在另一些优选的实施方案中，所述对象是癌症患者，例如pd-l1阳性癌症患者，优选地肺癌和黑素瘤患者。
在又一个方面，本发明提供了用于在有需要的对象中促进t细胞活化的方法，其包括将本发明的突变的多肽/或药物组合物施用给所述对象。优选地，所述方法还包括将抗cd3抗体施用给所述对象。
在又一个方面，本发明提供了用于在有需要的对象中消除pd-l1对t细胞活化之抑制的方法，其包括将本发明的突变的多肽/或药物组合物施用给所述对象。优选地，所述方法还包括将抗cd3抗体施用给所述对象。
在又一个方面，本发明提供了促进t细胞活化的方法(优选体外的)，其包括使本发明的突变的多肽或药物组合物与t细胞相接触。优选地，所述方法还包括使抗cd3抗体与t细胞相接触。
在又一个方面，本发明提供了消除pd-l1对t细胞活化之抑制的方法(优选体外的)，其包括使本发明的突变的多肽/或药物组合物与t细胞相接触。优选地，所述方法还包括使抗cd3抗体与t细胞相接触。
本发明的积极进步效果在于：本发明将前期所述的多肽进行突变优化，获得了比原始多肽具有更好活性的突变肽，其同样与pd-1蛋白具有高度亲和力，所述的多肽具有良好的生物活性。该多肽可以单独或与抗pd-1单克隆抗体或其它抗肿瘤药物联合的肿瘤免疫治疗和pd-1阳性肿瘤病人的诊断和筛查中，即能够运用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病等药物的制备中。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的描述，但它们不是对本发明的进一步限制。
实施例一:抑制肽突变体的制备
根据申请人前期研究，该抑制肽的制备方法为cn107383174a中公开，具体的多肽序列为：
kwqeegqaihstnltqyphrsglrvgchdwrtwphnypcgalprknyslfpqdhtpcyiwyyspdlqhmpnnvkhnssrspdllaskppvtespwwhidtqmsgyma。其中下划线的三处为特异性结合与pd-1的蛋白受体的胞外区，在第11氨基酸与第77位氨基酸之间形成二硫键。
申请人根据该抑制肽与胞外区的结合特性，分别在三处结合位点设计了400个模拟结构，根据蛋白结合等电点以及三维结构模拟数据，最终优化获得了20个优化的突变组合形式，后期经过验证，只有6个具有显著的提高的活性，其中以3个优化形式作为常规的对照。具体的突变形式分别为：6个效果较好的突变为：10h/q，40g/r，42l/s，44r/q，45k/n或97h/i其组合；3个差的42l/g，45k/r，97h/t作为对照。其中h/q表示原始氨基酸h替换为q。
实施例2抑制肽对pd-1的亲合力的测定
(1)将多肽用1×pbs配置成浓度为1mg/ml的溶液、将抗pd-1的多肽配置成100μg/ml的溶液，取2.5μl将其滴在羧基化的spr芯片(购自plexera公司，kx5型spr标配基底)上，通过链霉亲合素和生物素的特异性反应将多肽固定在spr芯片上。而后依次将浓度为0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml的pd-1溶液(1×pbs稀释)作为流动相通过芯片表面，结合时间150s，解离时间130s，重生时间200s。以1×pbs作为解离溶液，以0.5％磷酸作为重生液。在k×5型spr仪(plexera)上记录多肽与tnf-α的结合解离曲线。
(2)以langmuir公式拟合所述多肽与pd-1的spr曲线。经计算可以获得平衡结合/解离常数。结果如下：
所述突变后的五种多肽与原始序列1相比平衡解离常数kd值得到显著的降低，表明该多肽与pd-1的结合能力进一步的得到增强。
实施例3突变多肽抑制剂的生物学活性检测
(1)选择以登记号10298保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的jurkat/pd-1/nfat细胞作为靶细胞，使用dmem/f12+10％fbs培养基照2.5×104个/孔，100μ1/孔的密度均匀铺至96孔板中(corning)，37℃5％co2孵箱中孵育过夜；
(2)使用1640+10％胎牛血清培养基制备不同浓度突变多肽溶液稀释至1μg/ml，然后向下10倍倍比稀释7个浓度点，吸去上述96孔板中的dmem/f12+10％fbs培养基，将配制好的多肽抑制剂溶液按照50μ1/孔加到96孔板中；
(3)使用1640+10％胎牛血清培养基制备靶细胞悬液，并按照5×104个/孔，50μl/孔的密度均匀铺至上述96孔板中，在37℃5％co2孵箱中孵育6小时；
(4)在m200或pherastar酶标仪上使用化学发光读取相对化学发光单位值(rlu)，通过数据处理计算多肽抑制剂的生物学活性，根据四参数回归计算多肽抑制剂半效量浓度。结果如下：
从结果可以看出，本发明突变后的5种情形：(1)seqidno：1多肽，其突变为10h/q；(2)seqidno：1多肽，其突变为40g/r和42l/s；(3)seqidno：1多肽，其突变为44r/q；(4)seqidno：1多肽，其突变为45k/n；(5)seqidno：1多肽，其突变为97h/i，其ec50值得到显著的降低，比原始肽具有更好的效果。
实施例4使用抗抑制剂抗体处理体内肿瘤模型
将抑制肽采用本领域常规操作方法分别在n段采用酰胺化修饰，c端连接胆固醇修饰，命名为pd-1-yzl-c；
另外制备抑制肽-纳米颗粒复合系统，通过以下方式制备与修饰，所述方法均为本领域常规的操作方法:(1)抑制肽:通过直接由生物公司合成；(2)18nm金纳米微球的合成:利用柠檬酸钠还原法一步合成18nm金颗粒；(3)金纳米棒的合成:利用种子生长法合成金纳米棒；(4)纳米金颗粒的表面多肽修饰。命名为pd-1-yzl-nm。
用抑制肽内处理植入有癌性肿瘤的小鼠以检验抗体对肿瘤生长的体内影响。根据体重将6-8周龄之间的雌性aj小鼠随机分成6组。在第0天将溶于200μldmem培养基的2×106个sa1/n纤维肉瘤细胞在右侧皮下植入小鼠。用pbs对照或1mg/kg的抑制肽处理小鼠。在第1、4、8和11天用大约20μl含有抑制肽的pbs或对照通过腹膜内注射给动物剂量给药。每组包含10只动物，各组组成如下:pbs对照组，5组不同的抑制肽类型。对小鼠每周两次监测肿瘤生长，持续大约6周。使用电子测径器对肿瘤进行三维测量(高度x宽度x长度)并计算肿瘤体积。当肿瘤达到肿瘤终点(1500mm3)时将小鼠处死。结果如表1所示：
结果显示突变后的抑制剂多肽将达到肿瘤终点体积(1500mm3)的平均时间从对照组的25天延长到最长的59天，最短的也有55天，比原始的50天有显著的提高。因而，突变的抑制肽处理对肿瘤生长具有显著的提高的体内抑制效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>苏州立豪生物科技有限公司
<120>一种改进的能与pd-1特异性结合的肿瘤抑制肽及其用途
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>107
<212>prt
<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)
<400>1
lystrpglnglugluglyglnalailehisserthrasnleuthrgln
151015
tyrprohisargserglyleuargvalglycyshisasptrpargthr
202530
trpprohisasntyrprocysglyalaleuproarglysasntyrser
354045
leupheproglnasphisthrprocystyriletrptyrtyrserpro
505560
aspleuglnhismetproasnasnvallyshisasnserserargser
65707580
proaspleuleualaserlysproprovalthrgluserprotrptrp
859095
hisileaspthrglnmetserglytyrmetala
100105