一种在枯草芽孢杆菌的芽孢表面高效展示海藻糖合酶的方法与流程

本发明涉及一种在枯草芽孢杆菌的芽孢表面高效展示海藻糖合酶的方法，属于基因工程和发酵工程技术领域。

背景技术：

海藻糖是一种普遍存在的非还原性双糖，由葡萄糖通过α-1,1-糖苷键连接，并广泛存在于植物、动物和微生物中。自1974年海藻糖作为能量储存物质和细胞壁组成物质被认识后，其功能和应用也逐渐被开发。随着对海藻糖认知程度的增加，海藻糖在各方面的应用得到不断拓展，在医药、食品、农业等领域得到广泛推广。研究表明，海藻糖的功能主要有以下三点：(1)作为碳源和能量储存物质；(2)作为蛋白和膜结构的稳定和保护物质；(3)作为细菌细胞壁的一种结构组成成分。海藻糖对生物体具有特殊的保护作用，其在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣条件下，能够在细胞表面形成独特的保护膜，有效保护蛋白分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征。这一独特功能使得海藻糖除了作为蛋白质药物、酶、疫苗和其他生物制品的活性保护剂外，还是保持细胞活性、保湿类化妆品的重要成分，更可作为防止食品变质、保持食品新鲜风味、提升食品品质的独特食品配料。

随着海藻糖应用的不断探索，其功能和效果得到认可，这使得海藻糖的市场需求量逐渐增加，目前海藻糖的市场价格仍高于其他双糖，如蔗糖和麦芽糖。由于其生产工艺的复杂性，原材料的限制性以及工业化生产的实用性等方面的因素，使得海藻糖的生产量难以满足市场需求，因此对其生产各方面仍需不断创新和提高。

海藻糖合酶能够将由α,α-1,4-糖苷键连接的麦芽糖直接转化为由α,α-1,1-糖苷键连接的海藻糖，该反应不需要磷酸盐的存在，不需要消耗高能物质，且底物专一性强，只作用于麦芽糖生成海藻糖及其逆反应，反应倾向于生成海藻糖方向，转化率约为70％-80％。目前麦芽糖制备工艺已非常纯熟，不仅制备成本低，且麦芽糖溶液纯度高，因此利用海藻糖合酶制备海藻糖具有原料优势，便于海藻糖的生产应用。海藻糖转化法通过一步转化，工艺简单，便于调控，目前被认为是海藻糖工业化生产的最优方法。

芽孢表面展示系统是将目的基因与芽孢衣壳蛋白编码基因进行融合，利用大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭型质粒或整合型质粒作为载体，将其转化到枯草芽孢杆菌中，诱导菌株产生芽孢后，目的基因能在芽孢衣壳蛋白基因启动子或其他启动子的控制下实现与芽孢衣壳蛋白的融合表达，从而在芽孢衣壳蛋白的锚定作用下使外源蛋白展示在芽孢表面。枯草芽孢杆菌的芽孢作为表面展示系统具有以下优点：(1)枯草芽孢杆菌是好氧微生物，并且是典型的革兰氏阳性微生物，属于gras分类，生长所需营养要求低；(2)芽孢是在母细胞中自然形成的；(3)细胞质中的分子伴侣可适当促进异源蛋白的正确折叠。

中国专利文献cn105132450a(申请号201510571328.3)公开了一种枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白cot表面展示海藻糖合酶的方法。该发明利用cot系列芽孢衣壳蛋白作为芽孢表面展示外源蛋白的分子载体，设计出cot分子载体的系列引物，通过双酶切既可以替换分子载体又可以更改外源目的蛋白，最后通过基因技术将海藻糖合酶展示于枯草芽孢杆菌芽孢表面，筛选出可以高效展示海藻糖合酶的芽孢衣壳蛋白。虽然该技术方案中采用cot系列芽孢衣壳蛋白作为芽孢表面展示外源蛋白的分子载体可以表面展示海藻糖合酶，但展示效率太低，无法满足工业化应用的要求。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，提供一种在枯草芽孢杆菌的芽孢表面高效展示海藻糖合酶的方法。本发明通过筛选，发现当五种不同的枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白同时作为分子载体，在整合型质粒pdg1730的基础上构建一个可以高效芽孢表面展示海藻糖合酶的载体，通过电转化的方法将重组载体转化到枯草芽孢杆菌中，从而得到一种可以高效芽孢表面展示海藻糖合酶的枯草芽孢杆菌。

本发明技术方案如下：

一种芽孢表面高效展示海藻糖合酶的枯草芽孢杆菌工程菌，利用整合载体pdg1730将芽孢衣壳蛋白cota、cotc、cote、cotg、coth分别与海藻糖合酶基因tres进行融合获得的融合基因片段at-ct-et-gt-ht，然后转化枯草芽孢杆菌wb800n，即得。

根据本发明优选的，所述融合基因片段at-ct-et-gt-ht核苷酸序列如seqidno.1所示。

上述芽孢表面高效展示海藻糖合酶的枯草芽孢杆菌工程菌的构建方法，步骤如下：

(1)以枯草芽孢杆菌wb800n基因组为模板，pcr扩增芽孢衣壳蛋白中cota，cotc，cote，cotg和coth蛋白的基因序列；以恶臭假单胞菌pseudomonasputidap06为模板扩增分别与上述芽孢衣壳蛋白中cota，cotc，cote，cotg和coth蛋白的基因序列对应的重叠pcr扩增海藻糖合酶tres的基因序列；

所述cota蛋白基因的扩增引物如下所示：

cota-faaaactggtctgatcggatcccgacccgatatcctgccttabamhi

cota-rgctgggtcattttatggggatcagttatatccatcg

所述cotc蛋白基因的扩增引物如下所示：

cotc-faccaccaccaccactgaggtggcggtggctcgggc

cotc-rggctgggtcatgtagtgttttttatgctttttatactctacaa

所述cote蛋白基因的扩增引物如下所示：

cote-fcaccaccaccactgacgagctcgctctctaaacacg

cote-rtcctgaagaaatgacccagcccgacccg

所述cotg蛋白基因的扩增引物如下所示：

cotg-faccactgagtttaaaccgtaaagcggtaaattggattgapmei

cotg-rcgggctgggtcattttgtatttctttttgactacccagc

所述coth蛋白基因的扩增引物如下所示：

coth-fcaccaccaccactgacgagctcgccttctttttttg

coth-rcgggtcgggctgggtcattaaaatacttaaatgat

所述与cota蛋白基因pcr重叠扩增的海藻糖合酶tres基因序列的扩增引物如下所示：

cota-tres-ftccccataaaatgacccagcccgacccg

cota-tres-racctcagtggtggtggtggtggt

所述与cotc蛋白基因pcr重叠扩增的海藻糖合酶tres基因序列的扩增引物如下所示：

cotc-tres-faaacactacatgacccagcccgacccg

cotc-tres-rtttagagagcgagctcgtcagtggtggtggtggtggt

所述与cote蛋白基因pcr重叠扩增的海藻糖合酶tres基因序列的扩增引物如下所示：

cote-tres-fgtttttagtgggagatcctgaagaaatgacccagcccgac

cote-tres-rctgcaggaattcgataagcttgtttaaactcagtggtggtggtggtggthindiii、pmei

所述与cotg蛋白基因pcr重叠扩增的海藻糖合酶tres基因序列的扩增引物如下所示：

cotg-tres-fatacaaaatgacccagcccgacccg

cotg-tres-raaaagaaggcgagctcgtcagtggtggtggtggtggt

所述与coth蛋白基因pcr重叠扩增的海藻糖合酶tres基因序列的扩增引物如下所示：

coth-tres-fcacaatacctcaaagatcatttaagtattttaatgacccagcccgac

coth-tres-rctgcaggaattcgataagctttcagtggtggtggtggtggthindiii

(2)分别采用重叠pcr将步骤(1)制得的芽孢衣壳蛋白cota、cotc、cote、cotg、coth与其对应的海藻糖合酶基因片段tres分别融合，制得cota-tres(at)、cotc-tres(ct)、cote-tres(et)、cotg-tres(gt)和coth-tres(ht)五种融合基因片段；所述cota-tres融合基因片段核苷酸序列如seqidno.2所示，所述cotc-tres融合基因片段核苷酸序列如seqidno.3所示，所述cote-tres融合基因片段核苷酸序列如seqidno.4所示，所述cotg-tres融合基因片段核苷酸序列如seqidno.5所示，所述coth-tres融合基因片段核苷酸序列如seqidno.6所示；

(3)将整合型质粒pdg1730经限制性内切酶bamhi和hindiii双酶切后，同时与步骤(2)中制得的融合基因片段cota-tres、cotc-tres、cote-tres进行无缝克隆连接，并转入大肠杆菌dh5α中，制得重组质粒pdg1730-at-ct-et；

(4)将步骤(3)制得的重组质粒pdg1730-at-ct-et经限制性内切酶pmei和hindiii双酶切后，同时与骤(2)中制得的融合基因片段cotg-tres和coth-tres进行无缝克隆连接，并转入大肠杆菌dh5α中，制得重组质粒pdg1730-at-ct-et-gt-ht；

(5)将步骤(4)中制得的重组质粒pdg1730-at-ct-et-gt-ht通过电转化的方法转入枯草芽孢杆菌wb800n中，通过壮观霉素平板筛选后，制得芽孢表面高效展示海藻糖合酶的枯草芽孢杆菌工程菌。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，pcr扩增cot蛋白基因序列的反应体系如下：

2×phantamaxmastermix25μl，浓度10μmol/l上游引物cot-f2.5μl，浓度10μmol/l下游引物cot-r2.5μl，模板2.5μl，用ddh2o补足至50μl；

pcr反应程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中pcr扩增对应海藻糖合酶tres基因的反应体系如下：

2×phantamaxmastermix25μl，浓度10μmol/l上游引物cot-tres-f2.5μl，浓度10μmol/l下游引物cot-tres-r2.5μl，模板2.5μl，用ddh2o补足至50μl；

pcr反应程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火1min10s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，重叠pcr的初次扩增体系为25μl：

cot蛋白基因片段4μl，对应的海藻糖合酶基因片段tres4μl，2×phantamaxmastermix12.5μl，ddh2o4.5μl；

所述重叠pcr的初次扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，65℃退火15s，72℃延伸1min30s，5个循环；72℃延伸5min；

所述重叠pcr的补充体系为25μl：

上游引物cot-f2μl，下游引物cot-tres-r2μl，2×phantamaxmastermix12.5μl，ddh2o8.5μl；

所述重叠pcr补充扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火15s，72℃延伸1min30s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

根据本发明优选的，所述步骤(5)中，电转化的条件如下：

将6μl重组质粒加入60μl枯草芽孢杆菌感受态细胞中，2500v，5ms，电击一次。

上述芽孢表面高效展示海藻糖合酶的枯草芽孢杆菌工程菌在制备海藻糖中的应用。

上述应用，步骤如下：

(i)将芽孢表面高效展示海藻糖合酶的重组枯草芽孢杆菌在tb培养基中扩大培养，35～38℃发酵45～50h，离心，取芽孢，制得在芽孢表面固定化的海藻糖合酶；

(ii)将步骤(i)中制得的在芽孢表面固定化的海藻糖合酶用磷酸盐缓冲液重悬，然后加入麦芽糖溶液，在23～27℃条件下，转化3.5～5h，纯化，制得海藻糖。

根据本发明优选的，所述步骤(i)中，tb培养基组份如下：

20g/l葡萄糖，30g/l大豆蛋白胨，2.5g/lmgcl2，17mmkh2po4，72mmk2hpo4。

根据本发明优选的，所述步骤(i)中，离心条件为：4℃、7500rpm的条件下离心10min。

根据本发明优选的，所述步骤(ii)中，磷酸盐缓冲液ph8.0，浓度10mm。

根据本发明优选的，所述步骤(ii)中，反应体系中麦芽糖的质量百分比浓度为25～40％。

有益效果

1、本发明首次同时利用特定的5种不同的芽孢衣壳蛋白作为分子载体将海藻糖合酶展示到枯草芽孢杆菌芽孢表面上，通过基因工程手段将海藻糖合酶tres基因分别与芽孢衣壳蛋白cota、cotc、cote、cotg和coth编码基因融合，利用枯草芽孢杆菌整合型质粒作为载体，转化到枯草芽孢杆菌中，从而得到一种可以高效芽孢表面展示海藻糖合酶的基因工程菌，极大地提高了海藻糖合酶在芽孢表面展示的效率，而在采用其他芽孢衣壳蛋白进行类似展示海藻糖合酶分子时，未发现该现象，这为后续提高海藻糖合酶在芽孢表面展示的效率提供了新的途径；

2、本发明所述工程菌直接将外源蛋白展示在芽孢表面，无需对细胞破碎，且芽孢可回收重复利用，所采用的枯草芽孢杆菌是食品安全菌株，其遗传背景清楚，遗传操作系统完善而精确，可保证最终的表达系统达到食品安全级的标准，为下游海藻糖工业化生产奠定了基础；

3、本发明采用整合型重组质粒芽孢表面展示海藻糖合酶，可以将目的基因整合到枯草芽孢杆菌基因组中，使其不会在传代过程中丢失，实现了枯草芽孢杆菌中海藻糖合酶的遗传稳定性。

附图说明

图1是pdg1730-at-ct-et-gt-ht载体构建示意图；

图2a是cota、cotc、cote、cotg和coth基因的琼脂糖凝胶电泳图；

图2b是海藻糖合酶基因tres的琼脂糖凝胶电泳图；

图3是融合基因片段at、ct、et、gt和ht的琼脂糖凝胶电泳图；

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

生物材料来源：

枯草芽孢杆菌wb800n购自杭州宝赛生物有限公司；

整合型质粒pdg1730购自淼灵生物科技有限公司；

恶臭假单胞菌(pseudomonasputidap06)购自中国科学院微生物菌种保藏中心(cgmcc)；

实施例1：构建重组质粒

(1)克隆得到芽孢衣壳蛋白基因片段

以枯草芽孢杆菌wb800n基因组为模板，设计引物进行pcr扩增得到5种芽孢衣壳蛋白的基因片段；

所述cota蛋白基因序列的pcr扩增，引物核苷酸序列如下：

cota-f：5’-aaaactggtctgatcggatcccgacccgatatcctgcctta-3’

cota-r：5’-gctgggtcattttatggggatcagttatatccatcg-3’

所述pcr反应体系如下：

2×phantamaxmastermix25μl，10μmol/l上游引物cota-f2.5μl，10μmol/l下游引物cota-r2.5μl，模板2.5μl，用ddh2o补足至50μl；

上述pcr反应按照如下程序进行：

95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

所述cotc蛋白基因序列的pcr扩增，引物核苷酸序列如下：

cotc-f：5’-accaccaccaccactgaggtggcggtggctcgggc-3’

cotc-r：5’-ggctgggtcatgtagtgttttttatgctttttatactctacaa-3’

所述pcr反应体系如下：

2×phantamaxmastermix25μl，10μmol/l上游引物cotc-f2.5μl，10μmol/l下游引物cotc-r2.5μl，模板2.5μl，用ddh2o补足至50μl；

上述pcr反应按照如下程序进行：

95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

所述cote蛋白基因序列的pcr扩增，引物核苷酸序列如下：

cote-f：5’-caccaccaccactgacgagctcgctctctaaacacg-3’

cote-r：5’-tcctgaagaaatgacccagcccgacccg-3’

所述pcr反应体系如下：

2×phantamaxmastermix25μl，10μmol/l上游引物cote-f2.5μl，10μmol/l下游引物cote-r2.5μl，模板2.5μl，用ddh2o补足至50μl；

上述pcr反应按照如下程序进行：

95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

所述cotg蛋白基因序列的pcr扩增，引物核苷酸序列如下：

cotg-f：5’-accactgagtttaaaccgtaaagcggtaaattggattga-3’

cotg-r：5’-cgggctgggtcattttgtatttctttttgactacccagc-3’

所述pcr反应体系如下：

2×phantamaxmastermix25μl，10μmol/l上游引物cotg-f2.5μl，10μmol/l下游引物cotg-r2.5μl，模板2.5μl，用ddh2o补足至50μl；

上述pcr反应按照如下程序进行：

95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

所述coth蛋白基因序列的pcr扩增，引物核苷酸序列如下：

coth-f：5’-caccaccaccactgacgagctcgccttctttttttg-3’

coth-r：5’-ttttaatgacccagcccgacccg-3’

所述pcr反应体系如下：

2×phantamaxmastermix25μl，10μmol/l上游引物coth-f2.5μl，10μmol/l下游引物coth-r2.5μl，模板2.5μl，用ddh2o补足至50μl；

上述pcr反应按照如下程序进行：

95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

pcr结束后通过质量百分比浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳分析片段长短，根据片段大小切下目的条带，使用上海生工胶回收试剂盒回收切胶产物。

(2)克隆得到海藻糖合酶基因片段

以恶臭假单胞菌pseudomonasputidap06为模板，设计分别pcr扩增与5种cot基因重叠的海藻糖合酶tres的基因序列的引物，进行pcr扩增：

与cota基因重叠的海藻糖合酶tres基因序列的pcr扩增，引物核苷酸序列如下：

cota-tres-f：5’-tccccataaaatgacccagcccgacccg-3’

cota-tres-r：5’-acctcagtggtggtggtggtggt-3’

pcr反应体系如下：

2×phantamaxmastermix25μl，10μmol/l上游引物cota-tres-f2.5μl，10μmol/l下游引物cota-tres-r2.5μl，模板2.5μl，用ddh2o补足至50μl；

上述pcr反应按照如下程序进行：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火1min10s，72℃延伸1min30s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

与cotc基因重叠的海藻糖合酶tres基因序列的pcr扩增，引物核苷酸序列如下：

cotc-tres-f：5’-aaacactacatgacccagcccgacccg-3’

cotc-tres-r：5’-tttagagagcgagctcgtcagtggtggtggtggtggt-3’

pcr反应体系如下：

2×phantamaxmastermix25μl，10μmol/l上游引物cotc-tres-f2.5μl，10μmol/l下游引物cotc-tres-r2.5μl，模板2.5μl，用ddh2o补足至50μl；

上述pcr反应按照如下程序进行：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火1min10s，72℃延伸1min30s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

与cote基因重叠的海藻糖合酶tres基因序列的pcr扩增，引物核苷酸序列如下：

cote-tres-f：5’-gctgggtcatttcttcaggatctcccactaaaaac-3’

cote-tres-r：5’-ctgcaggaattcgataagcttgtttaaactcagtggtggtggtggtggt-3’

pcr反应体系如下：

2×phantamaxmastermix25μl，10μmol/l上游引物cote-tres-f2.5μl，10μmol/l下游引物cote-tres-r2.5μl，模板2.5μl，用ddh2o补足至50μl；

上述pcr反应按照如下程序进行：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火1min10s，72℃延伸1min30s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

所述与cotg基因重叠的海藻糖合酶tres基因序列的pcr引物如下：

cotg-tres-f：5’-atacaaaatgacccagcccgacccg-3’

cotg-tres-r：5’-aaaagaaggcgagctcgtcagtggtggtggtggtggt-3’

pcr反应体系如下：

2×phantamaxmastermix25μl，10μmol/l上游引物cotg-tres-f2.5μl，10μmol/l下游引物cotg-tres-r2.5μl，模板2.5μl，用ddh2o补足至50μl；

上述pcr反应按照如下程序进行：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火1min10s，72℃延伸1min30s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

所述与coth基因重叠的海藻糖合酶tres基因序列的pcr引物如下：

coth-tres-f：5’-cacaatacctcaaagatcatttaagtattttaatgacccagcccgac-3’

coth-tres-r：5’-ctgcaggaattcgataagctttcagtggtggtggtggtggt-3’

利用上述引物进行pcr扩增，pcr反应体系如下：

2×phantamaxmastermix25μl，10μmol/l上游引物coth-tres-f2.5μl，10μmol/l下游引物coth-tres-r2.5μl，模板2.5μl，用ddh2o补足至50μl；

上述pcr反应按照如下程序进行：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火1min10s，72℃延伸1min30s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

pcr结束后通过质量百分比为1％的琼脂糖凝胶电泳分析片段长短，根据片段大小切下目的条带，使用上海生工胶回收试剂盒回收切胶。

(3)将步骤(1)制得的5种cot片段与步骤(2)制得的对应的海藻糖合酶基因片段分别进行重叠pcr，制得at、ct、et、gt和ht融合片段；

at融合片段的制备：

重叠pcr的初次扩增体系为25μl；

与cota基因重叠的海藻糖合酶序列tres4μl；cota蛋白基因序列4μl；2×phantamaxmastermix12.5μl；ddh2o4.5μl；

所述重叠pcr的初次扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，65℃退火15s，72℃延伸1min30s，5个循环；72℃延伸5min；

所述重叠pcr的补充体系为25μl：

上游引物cota-f2μl，下游引物cota-tres-r2μl，2×phantamaxmastermix12.5μl，ddh2o8.5μl；

所述重叠pcr补充扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火15s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

ct融合片段的制备：

重叠pcr的初次扩增体系为25μl；

与cotc基因重叠的海藻糖合酶序列tres4μl；cotc蛋白基因序列4μl；2×phantamaxmastermix12.5μl；ddh2o4.5μl；

所述重叠pcr的初次扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，65℃退火15s，72℃延伸1min30s，5个循环；72℃延伸5min；

所述重叠pcr的补充体系为25μl：

上游引物cotc-f2μl，下游引物cotc-tres-r2μl，2×phantamaxmastermix12.5μl，ddh2o8.5μl；

所述重叠pcr补充扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火15s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

et融合片段的制备：

重叠pcr的初次扩增体系为25μl；

与cote基因重叠的海藻糖合酶序列tres4μl；cote蛋白基因序列4μl；2×phantamaxmastermix12.5μl；ddh2o4.5μl；

所述重叠pcr的初次扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，65℃退火15s，72℃延伸1min30s，5个循环；72℃延伸5min；

所述重叠pcr的补充体系为25μl：

上游引物cote-f2μl，下游引物cote-tres-r2μl，2×phantamaxmastermix12.5μl，ddh2o8.5μl；

所述重叠pcr补充扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火15s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

gt融合片段的制备：

重叠pcr的初次扩增体系为25μl；

与cotg基因重叠的海藻糖合酶序列tres4μl；cotg蛋白基因序列4μl；2×phantamaxmastermix12.5μl；ddh2o4.5μl；

所述重叠pcr的初次扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，65℃退火15s，72℃延伸1min30s，5个循环；72℃延伸5min；

所述重叠pcr的补充体系为25μl：

上游引物cotg-f2μl，下游引物cotg-tres-r2μl，2×phantamaxmastermix12.5μl，ddh2o8.5μl；

所述重叠pcr补充扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火15s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

ht融合片段的制备：

重叠pcr的初次扩增体系为25μl；

与coth基因重叠的海藻糖合酶序列tres4μl；coth蛋白基因序列4μl；2×phantamaxmastermix12.5μl；ddh2o4.5μl；

所述重叠pcr的初次扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，65℃退火15s，72℃延伸1min30s，5个循环；72℃延伸5min；

所述重叠pcr的补充体系为25μl：

上游引物coth-f2μl，下游引物coth-tres-r2μl，2×phantamaxmastermix12.5μl，ddh2o8.5μl；

所述重叠pcr补充扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火15s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

(4)将整合型质粒pdg1730经bamhi和hindiii双酶切与步骤(3)中制得的at、ct、et融合片段利用多片段无缝克隆连接，转入大肠杆菌dh5α中；鉴定成功并测序正确后，将制得的重组载体命名为pdg1730-at-ct-et。

所述pdg1730质粒酶切体系为：

pdg1730质粒16μl；bamhi1μl；hindiii1μl；10×buffer2.5μl；ddh2o4.5μl；

反应条件：37℃反应2h。

质粒双酶切后的产物经质量百分比为1％琼脂糖凝胶电泳检测，并使用dna胶回收试剂盒进行回收。

所述多片段无缝克隆连接体系为：

pdg1730质粒152ng；cotc-tres52ng；cotg-tres56ng；exnase2μl；5×cebuffer4μl；ddh2o补足至20μl

反应条件：37℃反应30min。

将无缝克隆连接产物转化导入大肠杆菌dh5α感受态细胞中。

(5)将步骤(4)中制得的重组载体经pmei和hindiii双酶切与步骤(3)中制得的gt和ht融合片段利用多片段无缝克隆连接，转入大肠杆菌dh5α中；鉴定成功并测序正确后，将制得的重组载体命名为pdg1730-at-ct-et-gt-ht。经检测，含有五种芽孢衣壳蛋白cota、cotc、cote、cotg和coth及其与海藻糖合酶融合基因的载体核苷酸序列如seqidno.1所示。

所述重组载体pdg1730-at-ct-et的酶切体系为：

pdg1730-at-ct-et质粒16μl；pmei1μl；hindiii1μl；10×buffer2.5μl；ddh2o4.5μl；

反应条件：37℃反应2h。

质粒双酶切后的产物经质量百分比为1％琼脂糖凝胶电泳检测，并使用dna胶回收试剂盒进行回收。

所述多片段无缝克隆连接体系为：

pdg1730-at-ct-et质粒320ng；cotc-tres52ng；cotg-tres56ng；exnase2μl；5×cebuffer4μl；ddh2o补足至20μl

反应条件：37℃反应30min。

将无缝克隆连接产物转化导入大肠杆菌dh5α感受态细胞中。

实施例2：枯草芽孢杆菌wb800n电转感受态细胞的制备

挑取新鲜lb固体培养基表面的枯草芽孢杆菌wb800n单菌落于5mllb培养基中，过夜培养。取1ml过夜培养物接入50mlgm培养基(lb+0.5m山梨醇)中，37℃振荡培养至od600为1.0。将菌液冰水浴10min，5000rpm，4℃离心8min，收集菌体。用20ml预冷的etm培养基(0.5m山梨醇+0.5m甘露醇+10％甘油)重悬菌体，5000rpm，4℃离心8min，去上清，如此洗涤3次。将洗涤后的菌体重悬于500μletm培养基中，分装与ep管中，每管分装60μl。

实施例3：将重组质粒转入枯草芽孢杆菌wb800n中

将6μl重组质粒加入到60μl感受态细胞中，冰上孵育5min，加入预冷的电转杯(2mm)中，在2500v、5ms条件下进行电转化。电击完毕后，立即在电转杯中加入1ml37℃预热的rm培养基(lb+0.5m山梨醇+0.38m甘露醇)，37℃振荡复苏培养3h，涂布于含壮观霉素的lb平板上。37℃倒置培养，筛选抗壮观霉素的菌株。

实施例4：阳性重组菌的培养基鉴定

将上述阳性重组菌落接种到lb液体培养基(含壮观霉素)中培养过夜，利用上海生物工程有限公司提供的试剂盒提取基因组dna，以获得的基因组dna位模板，分别以五种对应的cot-f和cot-tres-r为引物进行pcr扩增。

所述菌落pcr扩增体系为20μl：

上游引物1μl；下游引物1μl；模板1μl；2×phantamaxmastermix10μl；ddh2o7μl；

所述菌落pcr扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，63℃退火15s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存；

琼脂糖凝胶电泳证明外源片段at-ct-et-gt-ht已转入枯草芽孢杆菌wb800n中，将重组菌命名为wb800n/at-ct-et-gt-ht。

实施例5：阳性重组菌的发酵

将实施例4构建好的重组菌wb800n/at-ct-et-gt-ht接种于lb液体培养基(含浓度为100μg/ml的壮观霉素)，37℃过夜培养，次日按1％接种量转接与tb培养基中，37℃培养48h，4℃，7500rpm离心10min，用终浓度2mg/ml的溶菌酶37℃处理2h后离心，沉淀即为重组芽孢。

上述lb液体培养基配方为：

蛋白胨10g，酵母浸粉5g，nacl10g，ph7.0。

上述tb培养基每升组分如下：

20g葡萄糖，30g大豆蛋白胨，2.5gmgcl2，17mmolkh2po4，72mmolk2hpo4，ph7.5。

实施例6：海藻糖合酶酶活检测

将菌体沉淀用5mlph8.0的磷酸盐缓冲液重悬，加入5ml质量浓度为60％的麦芽糖溶液，25℃条件下反应4h。通过高效液相色谱测定转化体系中所生成的海藻糖的浓度，测定过程中采用氨基柱；柱温为40℃；流动相采用乙腈与水的混合溶液，二者体积比为3:1；流速为1ml/min；检测器为示差检测器；检测时间为15min。按照如下公式计算海藻糖合酶的酶活。

根据高效液相色谱中海藻糖的峰面积，计算其的浓度，其中c为转化体系中生成海藻糖的浓度(g/l)，v为转化体积(l)，m为海藻糖的相对分子质量，t为转化时间(h)，m为转化体系中菌体干重(g)。

结果表明，本发明所构建的海藻糖合酶基因工程菌能够实现在枯草芽孢杆菌中高效芽孢表面展示海藻糖合酶。重组芽孢中海藻糖合酶的比酶活可达5238.98u/g，具有广泛的应用前景。

对比例1

以枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白cotc作为分子载体，将海藻糖合酶tres展示到枯草芽孢杆菌芽孢表面，利用整合型质粒pdg1730，将cotc-tres融合基因整合到枯草芽孢杆菌基因组中。结果显示，其展示的海藻糖合酶的比酶活为974.52u/g。

对比例2

以枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白cotg作为分子载体，将海藻糖合酶tres展示到枯草芽孢杆菌芽孢表面，利用整合型质粒pdg1730，将cotg-tres融合基因整合到枯草芽孢杆菌基因组中。结果显示，其展示的海藻糖合酶的比酶活为783.93u/g。

对比例3

以枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白cote作为分子载体，将海藻糖合酶tres展示到枯草芽孢杆菌芽孢表面，利用整合型质粒pdg1730，将cote-tres融合基因整合到枯草芽孢杆菌基因组中。结果显示，其展示的海藻糖合酶的比酶活为921.69u/g。

对比例4

以枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白coth作为分子载体，将海藻糖合酶tres展示到枯草芽孢杆菌芽孢表面，利用整合型质粒pdg1730，将coth-tres融合基因整合到枯草芽孢杆菌基因组中。结果显示，其展示的海藻糖合酶的比酶活为763.64u/g。

对比例5

以枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白cota作为分子载体，将海藻糖合酶tres展示到枯草芽孢杆菌芽孢表面，利用整合型质粒pdg1730，将cota-tres融合基因整合到枯草芽孢杆菌基因组中。结果显示，其展示的海藻糖合酶的比酶活为937.68u/g。

对比例6

以枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白cotc和cotg同时作为分子载体，将海藻糖合酶tres展示到枯草芽孢杆菌芽孢表面，利用整合型质粒pdg1730，将cotc-tres-cotg-tres融合基因整合到枯草芽孢杆菌基因组中。结果显示，其展示的海藻糖合酶的比酶活为2376.16u/g。

对比例7

以枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白cotc作为分子载体，将海藻糖合酶tres展示到枯草芽孢杆菌芽孢表面，利用整合型质粒pdg1730，将cotc-tres重复五次，制备cotc-tres-cotc-tres-cotc-tres-cotc-tres-cotc-tres融合基因整合到枯草芽孢杆菌基因组中。结果显示，其展示的海藻糖合酶的比酶活为991.62u/g。

对比例8

如实施例所述的重组菌，不同之处在于，重组质粒为pdg1730-at-ct-et-gt-xt。其中cotx及其相连的tres的pcr扩增引物如下：

cotx-f：5’-caccaccaccactgacgagctcgggaaaaacgataa-3’

cotx-r：5’-ttttagaggacaagagtgataactaggatggct-3’

cotx-tres-f：5’-gtagccatcctagttatcactcttgtcctcatgacccagcccgac-3’

cotx-tres-r：5’-ctgcaggaattcgataagctttcagtggtggtggtggtggt-3’

结果显示，其展示的海藻糖合酶的比酶活为4351.26u/g。

结果分析

如实施例与对比例1-7的比酶活结果可以看出，以枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白cota、cotc、cote、cotg和coth同时作为分子载体所构建的重组菌酶活的显著提高并非是at、ct、et、gt、ht各自作用的简单效果叠加，比如对比例7中，采用单一作用酶活最高的cotc-tres进行五次重复后，效果显著低于实施例，从对比例6可以看出，cotc-tres-cotg-tres片段也显著高于对比例1和对比例2的结果，也显著高于对比例1与对比例2二者酶活之和。而实施例的酶活也显著高于对比例1-5的酶活之和。而实施例和对比例8的数据可以看出，将coth-tres替换为一个具有类似功能的cotx-tres后，展示的海藻糖合酶的比酶活显著降低。

序列表

<110>齐鲁工业大学

<120>一种在枯草芽孢杆菌的芽孢表面高效展示海藻糖合酶的方法

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>23020

<212>dna

<213>人工序列(人工序列)

<400>1

gatcccgacccgatatcctgccttaatgctgatcaaatcctaaacggcctgccgtttagg60

attttgttattttcttcttcgggcgggctgcagcacgaagattttttgtaaccatcacgt120

ccttattgtcattaactatagtaccaatttggaaaatttagataaggacagatgaaaatg180

acacttgaaaaatttgtggatgctctcccaatcccagatacactaaagccagtacagcaa240

tcaaaagaaaaaacatactacgaagtcaccatggaggaatgcactcatcagctccatcgc300

gatctccctccaacccgcctgtggggctacaacggcttatttccgggaccgaccattgag360

gttaaaagaaatgaaaacgtatatgtaaaatggatgaataaccttccttccacgcatttc420

cttccgattgatcacaccattcatcacagtgacagccagcatgaagagcccgaggtaaag480

actgttgttcatttacacggcggcgtcacgccagatgatagtgacgggtatccggaggct540

tggttttccaaagactttgaacaaacaggaccttatttcaaaagagaggtttatcattat600

ccaaaccagcagcgcggggctatattgtggtatcacgatcacgccatggcgctcaccagg660

ctaaatgtctatgccggacttgtcggtgcatatatcattcatgacccaaaggaaaaacgc720

ttaaaactgccttcagacgaatacgatgtgccgcttcttatcacagaccgcacgatcaat780

gaggatggttctttgttttatccgagcgcaccggaaaacccttctccgtcactgcctaat840

ccttcaatcgttccggctttttgcggagaaaccatactcgtcaacgggaaggtatggcca900

tacttggaagtcgagccaaggaaataccgattccgtgtcatcaacgcctccaatacaaga960

acctataacctgtcactcgataatggcggagattttattcagattggttcagatggaggg1020

ctcctgccgcgatctgttaaactgaattctttcagccttgcgcctgctgaacgttacgat1080

atcatcattgacttcacagcatatgaaggagaatcgatcattttggcaaacagcgcgggc1140

tgcggcggtgacgtcaatcctgaaacagatgcgaatatcatgcaattcagagtcacaaaa1200

ccattggcacaaaaagacgaaagcagaaagccgaagtacctcgcctcatacccttcggta1260

cagcatgaaagaatacaaaacatcagaacgttaaaactggcaggcacccaggacgaatac1320

ggcagacccgtccttctgcttaataacaaacgctggcacgatcccgtcacagaaacacca1380

aaagtcggcacaactgaaatatggtccattatcaacccgacacgcggaacacatccgatc1440

cacctgcatctagtctccttccgtgtattagaccggcggccgtttgatatcgcccgttat1500

caagaaagcggggaattgtcctataccggtccggctgtcccgccgccgccaagtgaaaag1560

ggctggaaagacaccattcaagcgcatgcaggtgaagtcctgagaatcgcggcgacattc1620

ggtccgtacagcggacgatacgtatggcattgccatattctagagcatgaagactatgac1680

atgatgagaccgatggatataactgatccccataaaatgacccagcccgacccgtcatac1740

gtcaaatggctcgaagaccgcgccatgctcaaggcctcccaggaccgggccagcctgtac1800

tcaggccagtcgcgcctgtggcagcaaccctatgccgaggcccagccccgccgcgccacc1860

gaaatcgcctcggtgtggctgacggtctaccccgacgccatcatcgcgcccgagggttgc1920

tcggtgctcggtgccctggcccacgaagcgttgtggaagcgcctgtcggagatcggcgta1980

cagggcctgcacaccggcccgatcaaactgtccggtggcatccgcggccgcgaactcacc2040

cccagcgtggacggcaacttcgaccgcatcagcttcgacatcgacccactgtacggcagc2100

gagcaggaactgatccagatgagccgcatggccgctgcgcacaatgccgtgaccatcgac2160

gacctgatcccctcgcacaccggcaagggcgccgacttccgcctggccgagctcgcccat2220

ggcccctacccggggctgtaccacatggtcgagatccgcgaagaagactgggcgctgctg2280

cccgaggtgcccgccgggcgcgatgcggtcaatctgctgccagctcagtgtgacgagctg2340

aaggcgcgccattacatcgttggccagctgcaacgggtaatcttcttcgagccgggcgtg2400

aaggaaaccgactggagcgccacgccgccgatcacaggcgtcgacggcaagacccgccgc2460

tgggtgtacctgcattacttcaaggaaggccagccctcgctgaactggctggaccctacc2520

ttcgccgcccaacagatgatcattggtgacgcactgcacgcgctggactgcctgggtgca2580

cgcggcctgcgcctggacgccaacggctttctcggcgtggaaacccgcgccagcggcacc2640

gcctggtcggaaagccacccgctgtcgctcgtcggcaaccagctgatcggtggcatgatc2700

cgcaaggccggcggtttcagcttccaggagctgaacctgaccctcgatgacattgcgcag2760

atgtccaagggtggtgccgacctgtcctacgatttcattacccggccggcctaccagcat2820

gcgctgctgacgggcgacaccgagttcctgcgcctgatgctcaaggagatgcacgccttc2880

ggcatcgacccggcctcgctcatccatgccctgcaaaaccatgacgagctgaccgtggag2940

ctggtgcacttctggacactgcacgcgcacgatatgtacctgtacaagggccaaaccctg3000

cctggcagcatcctgcgcgaacatattcgcgaagagatctacgaacggctgtcgggggaa3060

catgcgccgtacaacctgcgcttcgtgaccaacggcattgcctgcaccaccgccagcctg3120

atcgctgctgcactgggtattcgcgacctcgaacagattggtgtagcggatatcgaactg3180

atcaagaaggtgcacctgctgctggtcatgtacaacgccatgcagccgggggtggtcgcc3240

ttgtccggctgggacctggtcggtgccctgcccttgcccgccgaagcggttgccgaacgc3300

atgctcgatggcgatacccgctggattcaccggggcggctatgacctggccgggcttgac3360

ccacaggcagaggcttctgtgcggggcatgccgcgtgcccgggcgctatacggcagcctg3420

gacaggcagctggacgagagtgattcatttgcctgcaaggtgaagaaactgctggctgtg3480

cgccaggcctacggcatcgccaccagccgtcaggtgctggtacctgaggtgagcagcccg3540

gggctgctggtgatggtgcatgagctgccagccgggcgcggtatccagatcactgcgctg3600

aacttcggccaggacgcgattgccgaggaactgctgttgaccgggttcacacctgggccg3660

gtggtcgacatgatcaacgagacggtcgaaggcgatttgaccgaggacgggcgcctgatg3720

gtgaacctggacccgtacgaggcgctgtgcctgcggatcgtcaacagcagcgggcatgtt3780

caccaccaccaccaccactgaggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcggataaatcg3840

tttgggccgatgaaaaatcggctctttattttgatttgtttttgtgtcatctgtcttttt3900

ctatcatttggacagcccttttttccttctatgattttaactgtccaagccgcaaaatct3960

actcgccgtataataaagcgtagtaaaaataaaggaggagtatatatgggttattacaaa4020

aaatacaaagaagagtattatacggtcaaaaaaacgtattataagaagtattacgaatat4080

gataaaaaagattatgactgtgattacgacaaaaaatatgatgactatgataaaaaatat4140

tatgatcacgataaaaaagactatgattatgttgtagagtataaaaagcataaaaaacac4200

tacggtaccatgacccagcccgacccgtcatacgtcaaatggctcgaagaccgcgccatg4260

ctcaaggcctcccaggaccgggccagcctgtactcaggccagtcgcgcctgtggcagcaa4320

ccctatgccgaggcccagccccgccgcgccaccgaaatcgcctcggtgtggctgacggtc4380

taccccgacgccatcatcgcgcccgagggttgctcggtgctcggtgccctggcccacgaa4440

gcgttgtggaagcgcctgtcggagatcggcgtacagggcctgcacaccggcccgatcaaa4500

ctgtccggtggcatccgcggccgcgaactcacccccagcgtggacggcaacttcgaccgc4560

atcagcttcgacatcgacccactgtacggcagcgagcaggaactgatccagatgagccgc4620

atggccgctgcgcacaatgccgtgaccatcgacgacctgatcccctcgcacaccggcaag4680

ggcgccgacttccgcctggccgagctcgcccatggcccctacccggggctgtaccacatg4740

gtcgagatccgcgaagaagactgggcgctgctgcccgaggtgcccgccgggcgcgatgcg4800

gtcaatctgctgccagctcagtgtgacgagctgaaggcgcgccattacatcgttggccag4860

ctgcaacgggtaatcttcttcgagccgggcgtgaaggaaaccgactggagcgccacgccg4920

ccgatcacaggcgtcgacggcaagacccgccgctgggtgtacctgcattacttcaaggaa4980

ggccagccctcgctgaactggctggaccctaccttcgccgcccaacagatgatcattggt5040

gacgcactgcacgcgctggactgcctgggtgcacgcggcctgcgcctggacgccaacggc5100

tttctcggcgtggaaacccgcgccagcggcaccgcctggtcggaaagccacccgctgtcg5160

ctcgtcggcaaccagctgatcggtggcatgatccgcaaggccggcggtttcagcttccag5220

gagctgaacctgaccctcgatgacattgcgcagatgtccaagggtggtgccgacctgtcc5280

tacgatttcattacccggccggcctaccagcatgcgctgctgacgggcgacaccgagttc5340

ctgcgcctgatgctcaaggagatgcacgccttcggcatcgacccggcctcgctcatccat5400

gccctgcaaaaccatgacgagctgaccgtggagctggtgcacttctggacactgcacgcg5460

cacgatatgtacctgtacaagggccaaaccctgcctggcagcatcctgcgcgaacatatt5520

cgcgaagagatctacgaacggctgtcgggggaacatgcgccgtacaacctgcgcttcgtg5580

accaacggcattgcctgcaccaccgccagcctgatcgctgctgcactgggtattcgcgac5640

ctcgaacagattggtgtagcggatatcgaactgatcaagaaggtgcacctgctgctggtc5700

atgtacaacgccatgcagccgggggtggtcgccttgtccggctgggacctggtcggtgcc5760

ctgcccttgcccgccgaagcggttgccgaacgcatgctcgatggcgatacccgctggatt5820

caccggggcggctatgacctggccgggcttgacccacaggcagaggcttctgtgcggggc5880

atgccgcgtgcccgggcgctatacggcagcctggacaggcagctggacgagagtgattca5940

tttgcctgcaaggtgaagaaactgctggctgtgcgccaggcctacggcatcgccaccagc6000

cgtcaggtgctggtacctgaggtgagcagcccggggctgctggtgatggtgcatgagctg6060

ccagccgggcgcggtatccagatcactgcgctgaacttcggccaggacgcgattgccgag6120

gaactgctgttgaccgggttcacacctgggccggtggtcgacatgatcaacgagacggtc6180

gaaggcgatttgaccgaggacgggcgcctgatggtgaacctggacccgtacgaggcgctg6240

tgcctgcggatcgtcaacagcagcgggcatgttcaccaccaccaccaccactgacgagct6300

cgctctctaaacacggtgcctttacaggcccgtgtttttttatcatttgtgcggttaaaa6360

atgaactaaataatctatgtaccaaatgttcaattggtttttctgtgctcagccgcgtat6420

aaactttatcgcacttataagtaaagtttctaggcacccctgcatacaatggaacagaaa6480

ctttgtatttttatattttatttataaaaatgcacactagacaaatgcccagcataagat6540

aacacgaagaagaacaaggaggcatgccggaatgtctgaatacagggaaattattacgaa6600

ggcagtagtagcgaaaggccgaaaattcacccaatgcaccaacaccatctcgcctgagaa6660

aaaaccgagcagcattttgggtggttggattattaaccacaagtatgacgctgaaaaaat6720

tggaaaaacggtagaaattgaagggtattatgatataaacgtatggtactcttacgcgga6780

caacacaaagacagaggttgtcacagaacgggtaaaatatgtagatgtcattaaactcag6840

atacagagacaataattacttagatgatgagcatgaagtgattgccaaagtgcttcagca6900

gccaaactgccttgaagtgaccatttcgccgaatggaaataaaatcgttgtgcaggcaga6960

aagagaatttttggcggaagtggtaggggaaacaaaggtagttgttgaggtcaatcctga7020

ctgggaagaggatgacgaggaagattgggaagatgagcttgatgaagagcttgaagacat7080

caacccggagtttttagtgggagatcctgaagaaatgacccagcccgacccgtcatacgt7140

caaatggctcgaagaccgcgccatgctcaaggcctcccaggaccgggccagcctgtactc7200

aggccagtcgcgcctgtggcagcaaccctatgccgaggcccagccccgccgcgccaccga7260

aatcgcctcggtgtggctgacggtctaccccgacgccatcatcgcgcccgagggttgctc7320

ggtgctcggtgccctggcccacgaagcgttgtggaagcgcctgtcggagatcggcgtaca7380

gggcctgcacaccggcccgatcaaactgtccggtggcatccgcggccgcgaactcacccc7440

cagcgtggacggcaacttcgaccgcatcagcttcgacatcgacccactgtacggcagcga7500

gcaggaactgatccagatgagccgcatggccgctgcgcacaatgccgtgaccatcgacga7560

cctgatcccctcgcacaccggcaagggcgccgacttccgcctggccgagctcgcccatgg7620

cccctacccggggctgtaccacatggtcgagatccgcgaagaagactgggcgctgctgcc7680

cgaggtgcccgccgggcgcgatgcggtcaatctgctgccagctcagtgtgacgagctgaa7740

ggcgcgccattacatcgttggccagctgcaacgggtaatcttcttcgagccgggcgtgaa7800

ggaaaccgactggagcgccacgccgccgatcacaggcgtcgacggcaagacccgccgctg7860

ggtgtacctgcattacttcaaggaaggccagccctcgctgaactggctggaccctacctt7920

cgccgcccaacagatgatcattggtgacgcactgcacgcgctggactgcctgggtgcacg7980

cggcctgcgcctggacgccaacggctttctcggcgtggaaacccgcgccagcggcaccgc8040

ctggtcggaaagccacccgctgtcgctcgtcggcaaccagctgatcggtggcatgatccg8100

caaggccggcggtttcagcttccaggagctgaacctgaccctcgatgacattgcgcagat8160

gtccaagggtggtgccgacctgtcctacgatttcattacccggccggcctaccagcatgc8220

gctgctgacgggcgacaccgagttcctgcgcctgatgctcaaggagatgcacgccttcgg8280

catcgacccggcctcgctcatccatgccctgcaaaaccatgacgagctgaccgtggagct8340

ggtgcacttctggacactgcacgcgcacgatatgtacctgtacaagggccaaaccctgcc8400

tggcagcatcctgcgcgaacatattcgcgaagagatctacgaacggctgtcgggggaaca8460

tgcgccgtacaacctgcgcttcgtgaccaacggcattgcctgcaccaccgccagcctgat8520

cgctgctgcactgggtattcgcgacctcgaacagattggtgtagcggatatcgaactgat8580

caagaaggtgcacctgctgctggtcatgtacaacgccatgcagccgggggtggtcgcctt8640

gtccggctgggacctggtcggtgccctgcccttgcccgccgaagcggttgccgaacgcat8700

gctcgatggcgatacccgctggattcaccggggcggctatgacctggccgggcttgaccc8760

acaggcagaggcttctgtgcggggcatgccgcgtgcccgggcgctatacggcagcctgga8820

caggcagctggacgagagtgattcatttgcctgcaaggtgaagaaactgctggctgtgcg8880

ccaggcctacggcatcgccaccagccgtcaggtgctggtacctgaggtgagcagcccggg8940

gctgctggtgatggtgcatgagctgccagccgggcgcggtatccagatcactgcgctgaa9000

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