芽孢杆菌属微生物的可溶性胞外聚合物的制备方法与应用与流程

本发明涉及芽孢杆菌属微生物的可溶性胞外聚合物的制备方法与应用，属于微生物技术领域。

背景技术：

结垢是困扰工业冷却循环装置和海水淡化装置使用的主要问题之一。这也是一些工业过程，即能源生产中的一个主要关切问题。污垢覆盖在金属表面不仅会导致垢下腐蚀，而且会大大降低其传热效率，造成能源的损失和浪费，甚至带来许多安全事故。在法国，与扩大规模有关的非生产性开支估计为每年15亿欧元；同样的费用在英国约为8亿美元，在日本约为30亿美元，在美国为90亿美元；而我国每年结垢导致经济损失超700亿元,远超世界平均水平^[4]；此外，腐蚀不仅会带来重大的安全事故，也会造成严重的经济损失，2014年我国的腐蚀总成本包括腐蚀带来的损失和防腐蚀投入，约占当年gdp的3.34％，总额超2.1万亿人民币，相当于每个中国人当年承担1555多元的腐蚀成本。因此，开发高性能材料或找到有效的方法来防止碳酸钙和硫酸钙形成并减缓金属腐蚀是非常重要。有机分子作为缓蚀剂是解决腐蚀和结垢问题的最流行、最有效和最实用的方法之一。然而，这些物质往往是不可生物降解，不可再生的，多数有机缓蚀剂都有毒易造成环境污染以及合成成本高。因此，开发具有可再生、可生物降解、廉价和无毒等特性的生态友好的抑制剂是非常迫切的。

技术实现要素：

针对现有技术中缓蚀阻垢剂的技术问题，本发明提出芽孢杆菌属微生物的可溶性胞外聚合物的制备方法与应用，即制备绿色的双功能生物缓蚀与阻垢剂，解决工业冷却循环和海水淡化装置中的腐蚀和结垢问题。本发明可溶性胞外聚合物作为一种双功能的生物缓蚀剂和阻垢剂。

芽孢杆菌属微生物的可溶性胞外聚合物的制备方法，具体步骤如下：

(1)调节luria-bertani液体培养基的ph值为7.0～8.0，高温灭菌后作为luria-bertani液体发酵培养基，采用固体luria-bertani培养基，对芽孢杆菌进行活化培养24～48h后，接种至luria-bertani液体发酵培养基中培养24～36h得到芽孢杆菌属微生物发酵液；

(2)将步骤(1)的芽孢杆菌属微生物发酵液置于温度为4～8℃条件下离心处理，静置取上层清液，上层清液经透析袋透析即得可溶性胞外聚合物溶液；

(3)将步骤(2)的可溶性胞外聚合物溶液冷冻干燥得到可溶性胞外聚合物粉末；

(4)将步骤(3)可溶性胞外聚合物粉末溶解于蒸馏水中配制成预设浓度的可溶性胞外聚合物水溶液，备用。

所述步骤(1)高温灭菌的温度为100～121℃，高温灭菌时间为30～40min。

所述步骤(1)芽孢杆菌为蜡样芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌。

所述步骤(2)透析袋的分子截留量为10000～14000kda。

所述步骤(2)离心处理的转速为8000～12000r/s，离心处理的时间为20～30min。

所述可溶性胞外聚合物作为缓蚀剂在金属抗腐蚀中的应用。

进一步地，可溶性胞外聚合物抑制金属腐蚀的浓度为10～200mg/l。

所述可溶性胞外聚合物作为阻垢剂在防止钙垢中的应用。

进一步地，可溶性胞外聚合物作为阻垢剂抑制钙垢的浓度为100～400mg/l。

所述可溶性胞外聚合物作为缓蚀阻垢剂在冷却循环工业和海水淡化装置中的应用。

本发明的原理：芽孢杆菌属微生物的可溶性胞外聚合物含有蛋白质、核酸、多糖、酯类等高分子化合物，这些化合物分子内含有氨基、羧基、羟基、酰胺基、酯基等带负电的功能官能团，能有效地吸附在不锈钢和钛合金表面，与金属离子发生矿化，形成生物矿化膜，阻碍腐蚀性离子对金属表面的攻击，从而起到减缓金属的腐蚀作用。此外，芽孢杆菌属中可溶性胞外聚合物中含有大量酸性功能官能团与钙离子结合，形成稳定的有机金属化合物。由于酸性功能官能团与钙离子具有较强的螯合能力，其结合常数远远大于钙离子与碳酸根和硫酸根离子的结合常数，因此阻止了碳酸钙和硫酸钙晶体的形成。

本发明的有益效果：

(1)本发明的芽孢杆菌属微生物在自然界中广泛存在且易培养，其可溶性的胞外聚合物提取方法简单，环保，且成本低；

(2)本发明可溶性的胞外聚合物是一种可再生的，绿色的，低成本的高分子材料，与目前化学合成的缓蚀阻垢剂相比，不存在使用后的环境问题，对环境和生物无毒无害，可作为绿色缓蚀阻垢剂；

(3)本发明的绿色缓蚀阻垢剂适用于冷却循环工业和海水淡化装置中的不锈钢及其钛合金的防腐和除垢，可有效的抑制上述金属的腐蚀以及防止钙垢的形成。其中对腐蚀的抑制效率高达91％以上且长期有效，对钙垢的抑制效率高达89％。

附图说明

图1为实施例1蜡样芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物的功能官能团红外光谱图；

图2为实施例1蜡样芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物对不锈钢腐蚀的影响的sem图；

图3为实施例4巨大芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物的功能官能团红外光谱图；

图4为实施例4不同浓度的巨大芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物抑制碳酸钙垢形成的效率；

图5为实施例7枯草芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物的功能官能团红外光谱图；

图6为实施例7不同浓度的枯草孢杆菌的可溶性胞外聚合物抑制不锈钢腐蚀的电化学阻抗谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不限于所述内容。

本发明实施例中可溶性胞外聚合物作为缓蚀剂抑制金属腐蚀的应用方法：

(1)采用不同等级的碳化硅砂纸(600#至3000#)将不锈钢或钛合金逐级打磨至光亮，去除其表面污物；

(2)将处理后的不锈钢或钛合金试样分别置于250ml人工海水和添加有浓度为10～200mg/l芽孢杆菌属微生物的可溶性胞外聚合物的250ml人工海水中反应1～30d后观察其腐蚀情况；

本发明实施例中可溶性胞外聚合物作为阻垢剂抑制钙垢的应用方法：

将芽孢杆菌属微生物的可溶性胞外聚合物加入cacl2溶液和nahco3溶液的混合溶液中形成反应体系a，静置于温度为20～80℃的水浴锅中反应15～30h后，过滤，滤液用滴定法分析其钙离子的含量；其中反应体系a中可溶性胞外聚合物浓度为100～400mg/l；

将芽孢杆菌属微生物的可溶性胞外聚合物加入cacl2溶液和na2so4溶液的混合溶液中形成反应体系b，静置于温度为30-70℃的水浴锅中反应16～48h后，过滤，滤液用滴定法分析其钙离子的含量；其中反应体系b中可溶性胞外聚合物浓度为100～400mg/l。

实施例1：本实施例为蜡样芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物的制备和应用

芽孢杆菌属微生物的可溶性胞外聚合物的制备方法，具体步骤如下：

(1)调节luria-bertani液体培养基的ph值为7.0，置于温度为121℃条件下高温灭菌30min后作为luria-bertani液体发酵培养基，采用固体luria-bertani培养基，对蜡样芽孢杆菌进行活化培养24h后，接种至luria-bertani液体发酵培养基中培养36h得到芽孢杆菌属微生物发酵液；

(2)将步骤(1)的芽孢杆菌属微生物发酵液置于温度为4℃条件下离心处理，静置取上层清液，上层清液经透析袋透析即得可溶性胞外聚合物溶液；其中透析袋的分子截留量为10000kda，离心处理的转速为8000r/s，离心处理的时间为30min；

(3)将步骤(2)的可溶性胞外聚合物溶液冷冻干燥得到可溶性胞外聚合物粉末；采用傅里叶变换红外光谱分析可溶性胞外聚合物的化学成份；本实施例蜡样芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物的功能官能团红外光谱图见图1，从图1可知，蜡样芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物的红外光谱中鉴定出五个主要峰。蜡样芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物样品的主要官能团推导如下:2960-3300cm^-1(o-h，n-h基团)，1620cm^-1(酰胺i)，1400cm^-1(羧基)，1120cm^-1(c-o-c拉伸振动)。其中，2960-3300cm^-1范围内的宽拉伸振动带被分配给蛋白质的n-h氨基和碳水化合物的o-h基团。1400cm^-1的峰是具有离子基团的羧酸的对称拉伸峰。1620cm^-1处的吸收带对应于多肽酰胺i的拉伸振动。1120cm^-1附近的条带归因于碳水化合物和芳香族化合物的碳-氧-碳拉伸振动。660cm^-1处的吸附峰与卤代烷的拉伸有关。结果表明，蜡样芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物是一种复杂的高分子量聚合物混合物，即腐殖物质、糖醛酸和核酸。由于它在官能团(氧-氢、碳-氧-碳)和酰胺i中含有氧原子，符合典型缓蚀剂的一般标准，样芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物具有潜在的防腐性能；

(4)将步骤(3)可溶性胞外聚合物粉末溶解于蒸馏水中配制成浓度为100mg/l的可溶性胞外聚合物水溶液，备用；

蜡样芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物抗腐蚀性能

(1)配制250ml人工海水模拟液，并灭菌保存备用；其中人工海水成份为：17.6g/lnacl，0.04g/lkbr，0.008g/lsrcl2·6h2o，0.08g/lnahco3，0.6107g/lcacl2·6h2o，0.010g/lna2hpo4·12h2o，0.01g/lfeso4·7h2o，1.87g/lmgcl2·6h2o，0.25g/lkcl，1.47g/lna2so4，0.008g/lh2bo3；

(2)用#600至#3000的sic砂纸将316l不锈钢或钛合金逐级打磨至光亮，用蒸馏清洗，干燥后密封保存；

(3)将处理后的不锈钢或钛合金试样分别置于250ml人工海水中记为空白组，添加可溶性胞外聚合物的250ml人工海水中记为实验组，其中实验组中可溶性胞外聚合物的浓度为10mg/l，20mg/l，30mg/l，40mg/l，50mg/l，60mg/l，70mg/l，80mg/l，120mg/l，160mg/l，200mg/l一系列不同可溶性胞外聚合物的浓度；浸泡15d后，将样品取出用sem观察它们的表面形貌，用电化学法研究其腐蚀动力学；

本实施例蜡样芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物(浓度为20mg/l)对不锈钢腐蚀的影响的sem图见图2，从图2可知，蜡样芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物能抑制不锈钢的点蚀；

通过电化学法研究发现蜡样芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物能降低不锈钢或钛合金的腐蚀速率可知，蜡样芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物对不锈钢和钛合金的腐蚀均具有明显的抑制作用，可溶性胞外聚合物的浓度为10mg/l、20mg/l、30mg/l、40mg/l、50mg/l、60mg/l、70mg/l、80mg/l、120mg/l、160mg/l、200mg/l时，不锈钢的缓蚀效率依次分别高达38.02％、46.70％、48.2％、50.60％、67.18％、79.23％、87.58％、88.02％、89.60％、92.02％、92.12％、91.08％，钛合金的缓蚀效率高达36.12％、45.50％、49.21％、54.53％、57.08％、69.13％、72.23％、78.12％、83.68％、87.62％、92.12％、90.08％；

蜡样芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物抑制钙垢的形成

按照《gb/t16632-2008水处理剂阻垢性能的测定》碳酸钙和硫酸钙沉积法，研究可溶性胞外聚合物对碳酸钙和硫酸钙的阻垢性能；

溶液配制：称取13.86g无水cacl2溶于去离子水中，用容量瓶定容于1l(ca²⁺计5.00mg/l)标记为1号cacl2；称取10.5gnahco3溶于去离子水中，用容量瓶定容于1l(hco3^-计7.63mg/l)；称取83.25g无水cacl2溶于去离子水中，用容量瓶定容于1l(ca²⁺计30mg/l)标记为1号cacl2；称取108.5gna2so4溶于去离子水中，用容量瓶定容于1l(so4^2-计73.37mg/l)；称取3.8g十四水硼酸钠配制成ph＝9的硼砂缓冲溶液；配制0.005mol/l的edta标准溶液；

碳酸钙阻垢测试：

取200mlh2o于500ml的锥形瓶中，加入10ml1号cacl2溶液加入10ml硼砂缓冲溶液，随后缓慢的加入10mlnahco3溶液，加水稀释至250ml，记为空白组。取200mlh2o于500ml的锥形瓶中，加入10ml1号cacl2溶液，加入2～10ml浓度为40mg/l，60mg/l，80mg/l，100mg/l，120mg/l，160mg/l，180mg/l，220mg/l，260mg/l等一系列不同的浓度的可溶性胞外聚合物摇匀后，加入10ml硼砂缓冲溶液，随后缓慢的加入10mlnahco3溶液，加水稀释至250ml，记为实验组。之后将锥形瓶静置在20～80℃的水浴锅中15～30h后，过滤，滤液收集备用；滤渣，冷冻干重测量后对其进行形貌和成分分析；

取25ml蒸馏水于250ml的锥形瓶中，加入2ml氢氧化钠，随后加入15ml一定浓度的滤液和3mg钙指示剂，用edta进行滴点，并记录滴定终点；所有的实验平行3组；浓度依次为40mg/l、60mg/l、80mg/l、100mg/l、120mg/l、160mg/l、180mg/l、220mg/l、260mg/l的可溶性胞外聚合物，阻垢效率依次高达36.50％、47.8％、59.03％、67.58％、78.02％、84.60％、89.02％、90.03％、87.08％；

硫酸钙阻垢测试：

取200mlh2o于500ml的锥形瓶中，加入10ml2号cacl2溶液以及10mlna2so4溶液，加水稀释至250ml，记为空白组；取200mlh2o于500ml的锥形瓶中，加入10ml2号cacl2溶液，加入加入2～10ml浓度为40mg/l，60mg/l，80mg/l，100mg/l，120mg/l，160mg/l，180mg/l，220mg/l，260mg/l等一系列不同的浓度的可溶性胞外聚合物的可溶性胞外聚合物，随后加入10mlna2so4溶液，加水稀释至250ml，记为实验组；之后将锥形瓶静置在30～70℃的水浴锅中16～48h后，过滤，滤液收集备用；滤渣，冷冻干重测量后对其进行形貌和成分分析；

取25ml蒸馏水于250ml的锥形瓶中，加入2ml氢氧化钠，随后加入15ml一定浓度的滤液和3mg钙指示剂，用edta进行滴点，并记录滴定终点；所有的实验平行3组。浓度依次为40mg/l、60mg/l、80mg/l、100mg/l、120mg/l、160mg/l、180mg/l、220mg/l、260mg/l的可溶性胞外聚合物，阻垢效率依次高达37.05％、39.06％、53.56％、61.08％、78.09％、89.78％、89.03％、88.06％、88.69％。

实施例2：本实施例为蜡样芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物的制备和应用

芽孢杆菌属微生物的可溶性胞外聚合物的制备方法，具体步骤如下：

(1)调节luria-bertani液体培养基的ph值为7.4，置于温度为110℃条件下高温灭菌35min后作为luria-bertani液体发酵培养基，采用固体luria-bertani培养基，对蜡样芽孢杆菌进行活化培养30h后，接种至luria-bertani液体发酵培养基中培养28h得到芽孢杆菌属微生物发酵液；

(2)将步骤(1)的芽孢杆菌属微生物发酵液置于温度为5℃条件下离心处理，静置取上层清液，上层清液经透析袋透析即得可溶性胞外聚合物溶液；其中透析袋的分子截留量为11000kda，离心处理的转速为10000r/s，离心处理的时间为26min；

(3)将步骤(2)的可溶性胞外聚合物溶液冷冻干燥得到可溶性胞外聚合物粉末；采用傅里叶变换红外光谱分析可溶性胞外聚合物的化学成份；本实施例蜡样芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物的功能官能团红外光谱图可知，蜡样芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物的红外光谱中鉴定出五个主要峰。蜡样芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物样品的主要官能团推导如下:2960-3300cm^-1(o-h，n-h基团)，1620cm^-1(酰胺i)，1400cm^-1(羧基)，1120cm^-1(c-o-c拉伸振动)。其中，2960-3300cm^-1范围内的宽拉伸振动带被分配给蛋白质的n-h氨基和碳水化合物的o-h基团。1400cm^-1的峰是具有离子基团的羧酸的对称拉伸峰。1620cm^-1处的吸收带对应于多肽酰胺i的拉伸振动。1120cm^-1附近的条带归因于碳水化合物和芳香族化合物的碳-氧-碳拉伸振动。660cm^-1处的吸附峰与卤代烷的拉伸有关。结果表明，蜡样芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物是一种复杂的高分子量聚合物混合物，即腐殖物质、糖醛酸和核酸。由于它在官能团(氧-氢、碳-氧-碳)和酰胺i中含有氧原子，符合典型缓蚀剂的一般标准，样芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物具有潜在的防腐性能；

(4)将步骤(3)可溶性胞外聚合物粉末溶解于蒸馏水中配制成浓度为100mg/l的可溶性胞外聚合物水溶液，备用。

实施例3：本实施例为蜡样芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物的制备和应用

芽孢杆菌属微生物的可溶性胞外聚合物的制备方法，具体步骤如下：

(1)调节luria-bertani液体培养基的ph值为8.0，置于温度为100℃条件下高温灭菌40min后作为luria-bertani液体发酵培养基，采用固体luria-bertani培养基，对蜡样芽孢杆菌进行活化培养48h后，接种至luria-bertani液体发酵培养基中培养24h得到芽孢杆菌属微生物发酵液；

(2)将步骤(1)的芽孢杆菌属微生物发酵液置于温度为8℃条件下离心处理，静置取上层清液，上层清液经透析袋透析即得可溶性胞外聚合物溶液；其中透析袋的分子截留量为814000kda8，离心处理的转速为12000r/s，离心处理的时间为20min；

(3)将步骤(2)的可溶性胞外聚合物溶液冷冻干燥得到可溶性胞外聚合物粉末；采用傅里叶变换红外光谱分析可溶性胞外聚合物的化学成份；本实施例蜡样芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物的功能官能团红外光谱图可知，蜡样芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物的红外光谱中鉴定出五个主要峰。蜡样芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物样品的主要官能团推导如下:2960―3300cm^-1(o-h，n-h基团)，1620cm^-1(酰胺i)，1400cm^-1(羧基)，1120cm^-1(c-o-c拉伸振动)。其中，2960―3300cm^-1范围内的宽拉伸振动带被分配给蛋白质的n-h氨基和碳水化合物的o-h基团。1400cm^-1的峰是具有离子基团的羧酸的对称拉伸峰。1620cm^-1处的吸收带对应于多肽酰胺i的拉伸振动。1120cm^-1附近的条带归因于碳水化合物和芳香族化合物的碳-氧-碳拉伸振动。660cm^-1处的吸附峰与卤代烷的拉伸有关。结果表明，蜡样芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物是一种复杂的高分子量聚合物混合物，即腐殖物质、糖醛酸和核酸。由于它在官能团(氧-氢、碳-氧-碳)和酰胺i中含有氧原子，符合典型缓蚀剂的一般标准，样芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物具有潜在的防腐性能；

(4)将步骤(3)可溶性胞外聚合物粉末溶解于蒸馏水中配制成浓度为100mg/l的可溶性胞外聚合物水溶液，备用。

实施例4：本实施例为巨大芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物的制备和应用

芽孢杆菌属微生物的可溶性胞外聚合物的制备方法，具体步骤如下：

(1)调节luria-bertani液体培养基的ph值为7.2，置于温度为105℃条件下高温灭菌38min后作为luria-bertani液体发酵培养基，采用固体luria-bertani培养基，对巨大芽孢杆菌进行活化培养28h后，接种至luria-bertani液体发酵培养基中培养32h得到芽孢杆菌属微生物发酵液；

(2)将步骤(1)的芽孢杆菌属微生物发酵液置于温度为4℃条件下离心处理，静置取上层清液，上层清液经透析袋透析即得可溶性胞外聚合物溶液；其中透析袋的分子截留量为10000kda，离心处理的转速为8000r/s，离心处理的时间为30min；

(3)将步骤(2)的可溶性胞外聚合物溶液冷冻干燥得到可溶性胞外聚合物粉末；采用傅里叶变换红外光谱分析可溶性胞外聚合物的化学成份；本实施例蜡样芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物的功能官能团红外光谱图见图3，从图3可知，巨大孢杆菌的可溶性胞外聚合物的红外光谱中3340，和3430cm^-1峰归属于蛋白质的氨基和碳水化合物的o-h基团。1410，1460cm^-1的峰是羧酸的对称拉伸峰。1610cm^-1处的吸收带对应于多肽酰胺i的拉伸振动。1010cm^-1附近的条带归因于碳水化合物和芳香族化合物的碳-氧-碳拉伸振动。结果表明，蜡样芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物是一种复杂的高分子量聚合物混合物，即腐殖物质、糖醛酸和核酸。它含有合典型缓蚀剂的一般标准的官能团，巨大孢杆菌的可溶性胞外聚合物具有潜在的防腐性能；

(4)将步骤(3)可溶性胞外聚合物粉末溶解于蒸馏水中配制成浓度为100mg/l的可溶性胞外聚合物水溶液，备用；

巨大芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物抗腐蚀性能

(1)配制250ml人工海水模拟液，并灭菌保存备用；其中人工海水成份为：17.6g/lnacl，0.04g/lkbr，0.008g/lsrcl2·6h2o，0.08g/lnahco3，0.6107g/lcacl2·6h2o，0.010g/lna2hpo4·12h2o，0.01g/lfeso4·7h2o，1.87g/lmgcl2·6h2o，0.25g/lkcl，1.47g/lna2so4，0.008g/lh2bo3；

(2)用#600至#3000的sic砂纸将316l不锈钢或钛合金逐级打磨至光亮，用蒸馏清洗，干燥后密封保存；

(3)将处理后的不锈钢或钛合金试样分别放于250ml人工海水中，以及含有10mg/l，20mg/l，30mg/l，40mg/l，50mg/l，60mg/l，70mg/l，80mg/l，120mg/l，160mg/l，200mg/l一系列不同的浓度的可溶性胞外聚合物的人工海水中浸泡15天后，取出不锈钢或钛合金样品用sem观察它们的表面形貌；用电化学测量腐蚀情况；本实施例巨大芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物对不锈钢和钛合金的腐蚀均具有明显的抑制作用，可溶性胞外聚合物的浓度为10mg/l、20mg/l、30mg/l、40mg/l、50mg/l、60mg/l、70mg/l、80mg/l、120mg/l、160mg/l、200mg/l时，不锈钢的缓蚀效率依次分别高达不锈钢的缓蚀效率依次分别高达32.16％、43.50％、49.63％、59.31％、68.88％、78.63％、84.48％、89.62％、92.08％、91.12％、91.09％、90.20％，钛合金的缓蚀效率高达29.02％、35.44％、48.01％、57.21％、60.33％、67.20％、73.83％、77.01％、82.98％、88.02％、92.38％、89.08％；

巨大芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物抑制钙垢的形成

按照《gb/t16632-2008水处理剂阻垢性能的测定》碳酸钙和硫酸钙沉积法，研究可溶性胞外聚合物对碳酸钙和硫酸钙的阻垢性能；

溶液配制：称取13.86g无水cacl2溶于去离子水中，用容量瓶定容于1l(ca²⁺计5.00mg/l)标记为1号cacl2；称取10.5gnahco3溶于去离子水中，用容量瓶定容于1l(hco3^-计7.63mg/l)；称取83.25g无水cacl2溶于去离子水中，用容量瓶定容于1l(ca²⁺计30mg/l)标记为1号cacl2；称取108.5gna2so4溶于去离子水中，用容量瓶定容于1l(so4^2-计73.37mg/l)；称取3.8g十四水硼酸钠配制成ph＝9的硼砂缓冲溶液；配制0.005mol/l的edta标准溶液；

碳酸钙阻垢测试：

取200mlh2o于500ml的锥形瓶中，加入10ml1号cacl2溶液加入10ml硼砂缓冲溶液，随后缓慢的加入10mlnahco3溶液，加水稀释至250ml，记为空白组。取200mlh2o于500ml的锥形瓶中，加入10ml1号cacl2溶液，加入2～10ml浓度为40mg/l，60mg/l，80mg/l，100mg/l，120mg/l，160mg/l，180mg/l，220mg/l，260mg/l等一系列不同的浓度的可溶性胞外聚合物的可溶性胞外聚合物摇匀后，加入10ml硼砂缓冲溶液，随后缓慢的加入10mlnahco3溶液，加水稀释至250ml，记为实验组。之后将锥形瓶静置在20～80℃的水浴锅中15～30h后，过滤，滤液收集备用；滤渣，冷冻干重测量后对其进行形貌和成分分析；研究发现巨大芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物改变了碳酸钙的形貌；

取25ml蒸馏水于250ml的锥形瓶中，加入2ml氢氧化钠，随后加入15ml的滤液和3mg钙指示剂，用edta进行滴点，并记录滴定终点；所有的实验平行3组；计算其阻垢效率；

本实施例巨大芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物抑制碳酸钙垢形成的效率图见图4，从图4可知，巨大芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物能明显抑制碳酸钙的形成，浓度依次为40mg/l、60mg/l、80mg/l、100mg/l、120mg/l、160mg/l、180mg/l、220mg/l、260mg/l的可溶性胞外聚合物，阻垢效率依次高达38.65％、42.09％、57.92％、63.08.08％、77.92％、89.04％、88.53％、87.26％、87.19％；随着巨大芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物浓度的增加抑制碳酸钙的形成的效率不断增大；

硫酸钙阻垢测试：

取200mlh2o于500ml的锥形瓶中，加入10ml2号cacl2溶液以及10mlna2so4溶液，加水稀释至250ml，记为空白组。取200mlh2o于500ml的锥形瓶中，加入10ml2号cacl2溶液，加入2～10ml浓度为40mg/l，60mg/l，80mg/l，100mg/l，120mg/l，160mg/l，180mg/l，220mg/l，260mg/l等一系列不同的浓度的可溶性胞外聚合物的可溶性胞外聚合物，随后加入10mlna2so4溶液，加水稀释至250ml，记为实验组。之后将锥形瓶静置在30-70℃的水浴锅中16～48h后，过滤，滤液收集备用；滤渣，冷冻干重测量后对其进行形貌和成分分析；

取25ml蒸馏水于250ml的锥形瓶中，加入2ml氢氧化钠，随后加入15ml的滤液和3mg钙指示剂，用edta进行滴点，并记录滴定终点；所有的实验平行3组；计算其阻垢效率；巨大芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物对硫酸钙的形成具有一定的抑制作用，浓度依次为40mg/l、60mg/l、80mg/l、100mg/l、120mg/l、160mg/l、180mg/l、220mg/l、260mg/l的可溶性胞外聚合物，阻垢效率依次高达36.71％、40.13％、50.26％、60.38％、68.99％、76.28％、89.26％、87.24％、86.45％。

实施例5：本实施例为巨大芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物的制备和应用

芽孢杆菌属微生物的可溶性胞外聚合物的制备方法，具体步骤如下：

(1)调节luria-bertani液体培养基的ph值为7.5，置于温度为110℃条件下高温灭菌35min后作为luria-bertani液体发酵培养基，采用固体luria-bertani培养基，对巨大芽孢杆菌进行活化培养32h后，接种至luria-bertani液体发酵培养基中培养26h得到芽孢杆菌属微生物发酵液；

(2)将步骤(1)的芽孢杆菌属微生物发酵液置于温度为5℃条件下离心处理，静置取上层清液，上层清液经透析袋透析即得可溶性胞外聚合物溶液；其中透析袋的分子截留量为12000kda，离心处理的转速为11000r/s，离心处理的时间为24min；

(3)将步骤(2)的可溶性胞外聚合物溶液冷冻干燥得到可溶性胞外聚合物粉末；采用傅里叶变换红外光谱分析可溶性胞外聚合物的化学成份；本实施例蜡样芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物的功能官能团红外光谱图可知，巨大孢杆菌的可溶性胞外聚合物的红外光谱中3340，和3430cm^-1峰归属于蛋白质的氨基和碳水化合物的o-h基团。1410，1460cm^-1的峰是羧酸的对称拉伸峰。1610cm^-1处的吸收带对应于多肽酰胺i的拉伸振动。1010cm^-1附近的条带归因于碳水化合物和芳香族化合物的碳-氧-碳拉伸振动。结果表明，蜡样芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物是一种复杂的高分子量聚合物混合物，即腐殖物质、糖醛酸和核酸。它含有合典型缓蚀剂的一般标准的官能团，巨大孢杆菌的可溶性胞外聚合物具有潜在的防腐性能；

(4)将步骤(3)可溶性胞外聚合物粉末溶解于蒸馏水中配制成浓度为100mg/l的可溶性胞外聚合物水溶液，备用。

实施例6：本实施例为巨大芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物的制备和应用

芽孢杆菌属微生物的可溶性胞外聚合物的制备方法，具体步骤如下：

(1)调节luria-bertani液体培养基的ph值为8.0，置于温度为121℃条件下高温灭菌32min后作为luria-bertani液体发酵培养基，采用固体luria-bertani培养基，对巨大芽孢杆菌进行活化培养30h后，接种至luria-bertani液体发酵培养基中培养28h得到芽孢杆菌属微生物发酵液；

(2)将步骤(1)的芽孢杆菌属微生物发酵液置于温度为8℃条件下离心处理，静置取上层清液，上层清液经透析袋透析即得可溶性胞外聚合物溶液；其中透析袋的分子截留量为14000kda，离心处理的转速为12000r/s，离心处理的时间为20min；

(3)将步骤(2)的可溶性胞外聚合物溶液冷冻干燥得到可溶性胞外聚合物粉末；采用傅里叶变换红外光谱分析可溶性胞外聚合物的化学成份；本实施例蜡样芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物的功能官能团红外光谱图可知，巨大孢杆菌的可溶性胞外聚合物的红外光谱中3340，和3430cm^-1峰归属于蛋白质的氨基和碳水化合物的o-h基团。1410，1460cm^-1的峰是羧酸的对称拉伸峰。1610cm^-1处的吸收带对应于多肽酰胺i的拉伸振动。1010cm^-1附近的条带归因于碳水化合物和芳香族化合物的碳-氧-碳拉伸振动。结果表明，蜡样芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物是一种复杂的高分子量聚合物混合物，即腐殖物质、糖醛酸和核酸。它含有合典型缓蚀剂的一般标准的官能团，巨大孢杆菌的可溶性胞外聚合物具有潜在的防腐性能；

(4)将步骤(3)可溶性胞外聚合物粉末溶解于蒸馏水中配制成浓度为100mg/l的可溶性胞外聚合物水溶液，备用。

实施例7：本实施例为枯草芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物的制备和应用

芽孢杆菌属微生物的可溶性胞外聚合物的制备方法，具体步骤如下：

(1)调节luria-bertani液体培养基的ph值为7.0，置于温度为115℃条件下高温灭菌36min后作为luria-bertani液体发酵培养基，采用固体luria-bertani培养基，对枯草芽孢杆菌进行活化培养26h后，接种至luria-bertani液体发酵培养基中培养32h得到芽孢杆菌属微生物发酵液；

(2)将步骤(1)的芽孢杆菌属微生物发酵液置于温度为5℃条件下离心处理，静置取上层清液，上层清液经透析袋透析即得可溶性胞外聚合物溶液；其中透析袋的分子截留量为13000kda，离心处理的转速为9000r/s，离心处理的时间为30min；

(3)将步骤(2)的可溶性胞外聚合物溶液冷冻干燥得到可溶性胞外聚合物粉末；采用傅里叶变换红外光谱分析可溶性胞外聚合物的化学成份；本实施例蜡样芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物的功能官能团红外光谱图见图5，从图5可知，枯草孢杆菌的可溶性胞外聚合物的红外光谱中3320的峰归属于蛋白质的氨基和碳水化合物的o-h基团。1400cm^-1的峰是羧酸的对称拉伸峰。1640cm^-1，1530cm^-1处的吸收带对应于多肽酰胺i和肽酰胺ii。1070cm^-1附近的条带归因于碳水化合物和芳香族化合物的碳-氧-碳拉伸振动。结果表明，枯草芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物是一种复杂的高分子量聚合物混合物(腐殖物质、核酸等)；它含有合典型缓蚀剂的一般标准的官能团，因此，枯草孢杆菌的可溶性胞外聚合物具有潜在的防腐性能；

(4)将步骤(3)可溶性胞外聚合物粉末溶解于蒸馏水中配制成浓度为100mg/l的可溶性胞外聚合物水溶液，备用；

枯草芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物抗腐蚀性能

(1)配制250ml人工海水模拟液，并灭菌保存备用；其中人工海水成份为：17.6g/lnacl，0.04g/lkbr，0.008g/lsrcl2·6h2o，0.08g/lnahco3，0.6107g/lcacl2·6h2o，0.010g/lna2hpo4·12h2o，0.01g/lfeso4·7h2o，1.87g/lmgcl2·6h2o，0.25g/lkcl，1.47g/lna2so4，0.008g/lh2bo3；

(2)用#600至#3000的sic砂纸将316l不锈钢或钛合金逐级打磨至光亮，用蒸馏清洗，干燥后密封保存；

(3)将处理后的不锈钢或钛合金试样分别置于250ml人工海水中记为空白组，添加可溶性胞外聚合物的250ml人工海水中记为实验组，其中实验组中含有10mg/l，20mg/l，30mg/l，40mg/l，50mg/l，60mg/l，70mg/l，80mg/l，120mg/l，160mg/l，200mg/l一系列不同的浓度的可溶性胞外聚合物；浸泡15d后，将样品取出用sem观察它们的表面形貌，用电化学法研究其腐蚀动力学；不同浓度的枯草孢杆菌的可溶性胞外聚合物抑制不锈钢腐蚀的电化学阻抗谱图见图6，从图6可知，本实施例枯草芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物对两种金属的点蚀具有良好的抑制作用；对不锈钢和钛合金的腐蚀均具有明显的抑制作用，可溶性胞外聚合物的浓度为10mg/l、20mg/l、30mg/l、40mg/l、50mg/l、60mg/l、70mg/l、80mg/l、120mg/l、160mg/l、200mg/l时，不锈钢的缓蚀效率依次分别高达40.06％、43.05％、56.09％、60.38％、78.98％、80.36％、92.62％、92.03％、92.32％、91.86％、91.78％，钛合金的缓蚀效率高达39.09％、41.66％、53.28％、69.78％、72.09％、79.32％、86.32％、92.54％、91.94％、91.02％、89.03％；枯草芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物能明显抑制不锈钢的腐蚀，而且随着枯草芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物浓度的增加电阻值不断增大，其抑制腐蚀的效率不断增大；

枯草芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物抑制钙垢的形成

按照《gb/t16632-2008水处理剂阻垢性能的测定》碳酸钙和硫酸钙沉积法，研究可溶性胞外聚合物对碳酸钙和硫酸钙的阻垢性能；

溶液配制：称取13.86g无水cacl2溶于去离子水中，用容量瓶定容于1l(ca²⁺计5.00mg/l)标记为1号cacl2；称取10.5gnahco3溶于去离子水中，用容量瓶定容于1l(hco3^-计7.63mg/l)；称取83.25g无水cacl2溶于去离子水中，用容量瓶定容于1l(ca²⁺计30mg/l)标记为1号cacl2；称取108.5gna2so4溶于去离子水中，用容量瓶定容于1l(so4^2-计73.37mg/l)；称取3.8g十四水硼酸钠配制成ph为9的硼砂缓冲溶液；配制0.005mol/l的edta标准溶液；

碳酸钙阻垢测试：

取200mlh2o于500ml的锥形瓶中，加入10ml1号cacl2溶液加入10ml硼砂缓冲溶液，随后缓慢的加入10mlnahco3溶液，加水稀释至250ml，记为空白组。取200mlh2o于500ml的锥形瓶中，加入10ml1号cacl2溶液，加入2～10ml浓度为40mg/l，60mg/l，80mg/l，100mg/l，120mg/l，160mg/l，180mg/l，220mg/l，260mg/l等一系列不同的浓度的可溶性胞外聚合物的可溶性胞外聚合物摇匀后，加入10ml硼砂缓冲溶液，随后缓慢的加入10mlnahco3溶液，加水稀释至250ml，记为实验组；之后将锥形瓶静置在20～80℃的水浴锅中15～30h后，过滤，滤液收集备用；滤渣，冷冻干重测量后对其进行形貌和成分分析；

取25ml蒸馏水于250ml的锥形瓶中，加入2ml氢氧化钠，随后加入15ml的滤液和3mg钙指示剂，用edta进行滴点，并记录滴定终点，所有的实验平行3组，计算其阻垢效率；枯草芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物对硫酸钙的形成具有一定的抑制作用，浓度依次为40mg/l、60mg/l、80mg/l、100mg/l、120mg/l、160mg/l、180mg/l、220mg/l、260mg/l的可溶性胞外聚合物，阻垢效率依次高达40.25％、51.03％、59.89％、68.74％、75.06％、89.32％、89.06％、88.25％、88.03％；

硫酸钙阻垢测试：

取200mlh2o于500ml的锥形瓶中，加入10ml2号cacl2溶液以及10mlna2so4溶液，加水稀释至250ml，记为空白组；取200mlh2o于500ml的锥形瓶中，加入10ml2号cacl2溶液，加入2～10ml浓度为40mg/l，60mg/l，80mg/l，100mg/l，120mg/l，160mg/l，180mg/l，220mg/l，260mg/l等一系列不同的浓度的可溶性胞外聚合物的可溶性胞外聚合物，随后加入10mlna2so4溶液，加水稀释至250ml，记为实验组；之后将锥形瓶静置在温度为30～70℃的水浴锅中16～48h后，过滤，滤液收集备用；滤渣，冷冻干重测量后对其进行形貌和成分分析；研究发现枯草芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物改变了碳酸钙的形貌；

取25ml蒸馏水于250ml的锥形瓶中，加入2ml氢氧化钠，随后加入15ml的滤液和3mg钙指示剂，用edta进行滴点，并记录滴定终点；所有的实验平行3组；计算其阻垢效率；枯草芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物能抑制硫酸钙的形成，浓度依次为40mg/l、60mg/l、80mg/l、100mg/l、120mg/l、160mg/l、180mg/l、220mg/l、260mg/l的可溶性胞外聚合物，阻垢效率依次高达34.02％、38.99％、49.08％、60.23％、72.89％、89.60％、86.03％、89.01％、84.06％。

实施例8：本实施例为枯草芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物的制备和应用

芽孢杆菌属微生物的可溶性胞外聚合物的制备方法，具体步骤如下：

(1)调节luria-bertani液体培养基的ph值为7.5，置于温度为100℃条件下高温灭菌40min后作为luria-bertani液体发酵培养基，采用固体luria-bertani培养基，对枯草芽孢杆菌进行活化培养30h后，接种至luria-bertani液体发酵培养基中培养28h得到芽孢杆菌属微生物发酵液；

(2)将步骤(1)的芽孢杆菌属微生物发酵液置于温度为8℃条件下离心处理，静置取上层清液，上层清液经透析袋透析即得可溶性胞外聚合物溶液；其中透析袋的分子截留量为10000kda，离心处理的转速为11000r/s，离心处理的时间为25min；

(3)将步骤(2)的可溶性胞外聚合物溶液冷冻干燥得到可溶性胞外聚合物粉末；采用傅里叶变换红外光谱分析可溶性胞外聚合物的化学成份；本实施例蜡样芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物的功能官能团红外光谱图可知，枯草孢杆菌的可溶性胞外聚合物的红外光谱中3320的峰归属于蛋白质的氨基和碳水化合物的o-h基团。1400cm^-1的峰是羧酸的对称拉伸峰。1640cm^-1，1530cm^-1处的吸收带对应于多肽酰胺i和肽酰胺ii。1070cm^-1附近的条带归因于碳水化合物和芳香族化合物的碳-氧-碳拉伸振动。结果表明，枯草芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物是一种复杂的高分子量聚合物混合物(腐殖物质、核酸等)；它含有合典型缓蚀剂的一般标准的官能团，因此，枯草孢杆菌的可溶性胞外聚合物具有潜在的防腐性能；

(4)将步骤(3)可溶性胞外聚合物粉末溶解于蒸馏水中配制成浓度为100mg/l的可溶性胞外聚合物水溶液，备用。

实施例9：本实施例为枯草芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物的制备和应用

芽孢杆菌属微生物的可溶性胞外聚合物的制备方法，具体步骤如下：

(1)调节luria-bertani液体培养基的ph值为8.0，置于温度为121℃条件下高温灭菌30min后作为luria-bertani液体发酵培养基，采用固体luria-bertani培养基，对枯草芽孢杆菌进行活化培养38h后，接种至luria-bertani液体发酵培养基中培养24h得到芽孢杆菌属微生物发酵液；

(2)将步骤(1)的芽孢杆菌属微生物发酵液置于温度为6℃条件下离心处理，静置取上层清液，上层清液经透析袋透析即得可溶性胞外聚合物溶液；其中透析袋的分子截留量为14000kda，离心处理的转速为8000r/s，离心处理的时间为30min；

(3)将步骤(2)的可溶性胞外聚合物溶液冷冻干燥得到可溶性胞外聚合物粉末；采用傅里叶变换红外光谱分析可溶性胞外聚合物的化学成份；本实施例蜡样芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物的功能官能团红外光谱图可知，枯草孢杆菌的可溶性胞外聚合物的红外光谱中3320的峰归属于蛋白质的氨基和碳水化合物的o-h基团。1400cm^-1的峰是羧酸的对称拉伸峰。1640cm^-1，1530cm^-1处的吸收带对应于多肽酰胺i和肽酰胺ii。1070cm^-1附近的条带归因于碳水化合物和芳香族化合物的碳-氧-碳拉伸振动。结果表明，枯草芽孢杆菌的可溶性胞外聚合物是一种复杂的高分子量聚合物混合物(腐殖物质、核酸等)；它含有合典型缓蚀剂的一般标准的官能团，因此，枯草孢杆菌的可溶性胞外聚合物具有潜在的防腐性能；

(4)将步骤(3)可溶性胞外聚合物粉末溶解于蒸馏水中配制成浓度为100mg/l的可溶性胞外聚合物水溶液，备用。