V启动子来表达融合蛋白，并包 含SV40的多聚腺苷酸（PolyA)元件以保证其转录终止。该重组质粒含有新霉素（Neomycin) 抗性基因，以利于其在细菌中的复制以及稳定转染细胞的筛选。将编码所述单链抗体的重 组质粒转化E.coli后加入LB培养基培养过夜，以获取大量重组质粒的拷贝，用质粒提取试 剂盒（Qiagen公司）提取质粒后进行测序鉴定。
[0056] 实施例二本发明单链抗体的表达和纯化
[0057] 本发明中单链抗体是在CHO细胞中表达并分泌到培养液中的，并利用镍柱亲和层 析的方法纯化所得。
[0058]1、单链抗体在CHO细胞中的表达
[0059] 获得高纯度编码⑶3单链抗体的重组质粒后，利用Lipofectamine2000质粒转染 试剂盒（Invitrogen公司）将重组质粒转染CHO细胞，在无血清培养基中培养三天后收集 CHO细胞上清液，可以用免疫印迹检测单链抗体的表达（见图4)，所用检测抗体为抗His6 抗体。
[0060] 上述瞬时表达方法可用于快速地获取少量的抗体蛋白，如希望获取较多量的抗体 蛋白，贝 1J可以在CHO细胞中稳定表达。将编码抗体的重组质粒用Lipofectamine2000质粒 转染试剂盒（Invitrogen公司）转染CHO细胞，培养两天后加入新霉素，采用有限稀释法进 行细胞克隆培养，大约14天后挑取新霉素抗性的细胞克隆进行细胞的扩大培养，并选取状 态良好的细胞在液氮中冷冻保存。稳定转染后的CHO细胞可以在滚动细胞培养瓶中进一步 扩大培养以生产大量的抗体蛋白。
[0061] 2、抗体的纯化
[0062] 在本实施例中，包含单链抗体的细胞培养液通过镍柱亲和层析的方法进行纯化。 镍层析柱（GEHealthcare公司）按照说明书以缓冲液平衡后，将超滤器浓缩过的CHO细胞 培养上清液进样，以A280(nm)进行监测，用清洗液洗至未结合的蛋白全部被洗脱，然后用 洗脱液洗脱目标抗体。包含单链抗体的洗脱液经缓冲液置换为PBS，并进一步超滤浓缩后， 可以用考马斯亮蓝法蛋白测定试剂盒和蛋白凝胶电泳测定其浓度和纯度（见图4)。纯化后 的抗体可置于4°C短期保存，也可置于-20°C长期保存。
[0063] 实施例三本发明单链抗体与CD3阳性细胞的结合活性检测
[0064] 本发明的单链抗体在体外能够结合相应的革El细胞。本发明以Jurkat细胞作为CD3 阳性的细胞，并以本发明中的单链抗体CD3ScFv-VHVL来检测细胞结合活性。
[0065] 将本实施例得到的单链抗体与Jurkat细胞混合于含0. 02%叠氮钠的PBS缓冲液 中，至冰上孵育1小时。细胞用PBS缓冲液洗涤1次，然后与异硫氰酸荧光素（FITC)标记的 鼠抗His6抗体至冰上孵育30分钟。阳性对照采用商品化的FITC-标记的⑶3抗体。阴性 对照一方面采用FITC-标记的鼠抗His6抗体孵育Jurkat细胞；另一方面采用本发明抗体 和FITC-标记的鼠抗His6抗体孵育⑶3阴性的IfepG2细胞。细胞用缓冲液洗涤3次后，用 流式细胞仪（BDFACSCalibur)进行分析。结果显示，本发明的单链抗体能够特异结合⑶3 阳性的Jurkat细胞（见图5)，而不结合CD3阴性的H印G2细胞（见图5)。
[0066] 实施例四本发明单链抗体的重链和轻链可变区的排列方式变化及连接肽不同的 结合活性试验
[0067] 本发明单链抗体的重链可变区（VH)和轻链可变区（VL)的排列方式，不仅可以是 VH-VL，而且还可以是VL-VH，单链抗体内部的连接肽也可以采用本领域常用的其他连接肽， 本实例通过实验进行了验证。
[0068] 在本实施例中，参照按照实施例一和实施例二中所描述的方法生产本发明的另 一种可选的CD3单链抗体，其可变区的排列方式为VL-VH，内部采用另一种可选的连接肽 (VEGGSGGSGGSGGSGGVD)，表示为CD3ScFv-VLVH(编码核苷酸序列如SEQIDNO. 7所示，氨基 酸序列如序列表中SEQIDNO. 8所示）。本实施例采用ELISA方法检测⑶3ScFv-VHVL和 ⑶3ScFv-VLVH这2种排列方式和连接肽不同的⑶3单链抗体对T淋巴细胞的特异结合活 性。
[0069] 单链抗体CD3ScFv-VHVL、CD3ScFv-VLVH和牛血清白蛋白（BSA)分别与CD3阳性细 胞T淋巴细胞（Tcell)和⑶3阴性细胞K562混合于含0. 02%叠氮钠的PBS缓冲液中，至 冰上孵育1小时。细胞用PBS缓冲液洗涤2次，然后与辣根过氧化物酶（HRP)标记的鼠抗 His6抗体至冰上孵育30分钟。细胞用缓冲液洗涤3次后，离心到96孔板，加入TMB显色 试剂室温避光孵育20分钟。显色完成后，用2M硫酸终止显色，在450nm波长下检测光密度OD值。结果显示，⑶3ScFv-VHVL和⑶3ScFv-VLVH都能够特异结合T淋巴细胞（见图6)， 而不结合CD3阴性的K562细胞（见图6)。
[0070] 上述实例表明，本发明的人源⑶3单链抗体可以在CHO细胞中表达，能够进一步通 过亲和层析纯化。所得到的抗体可以结合CD3阳性的T淋巴细胞，具备良好的生物学活性。
【主权项】
1. 抗人CD3的抗体轻链可变区，其特征在于：氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 4所 不O
2. 抗人⑶3的抗体重链可变区，其特征在于：氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 2所 不O
3. 抗人CD3的单链抗体，其特征在于：由权利要求所述的抗人CD3的抗体轻链可变区 和权利要求2所述的抗人CD3的抗体重链可变区连接而成。
4. 根据权利要求3所述的抗人CD3的单链抗体，其特征在于：在抗人CD3的抗体轻链 可变区和抗人CD3的抗体重链可变区之间通过连接肽进行连接。
5. 根据权利要求3或4所述的抗人CD3的单链抗体，其特征在于其结构为：轻链可变 区-重链可变区、重链可变区-轻链可变区、轻链可变区-连接肽-重链可变区或重链可变 区-连接肽-轻链可变区。
6. 根据权利要求4或5所述的抗人CD3的单链抗体，其特征在于所述的连接肽的氨基 酸序列为 GGGGSGGGGSGGGGS 或 VEGGSGGSGGSGGSGGVD。
7. 根据权利要求6所述的抗人CD3的单链抗体，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中 SEQ ID NO. 6 或 SEQ ID NO. 8 所述。
8. 编码权利要求1所述抗人CD3的抗体轻链可变区的基因、编码权利要求1所述抗人 CD3的抗体重链可变区的基因或编码权利要求3-7任一项所述的抗人CD3的单链抗体的基 因。
9. 根据权利要求8所述的基因，特征在于其核苷酸序列见序列表中的SEQ ID NO. 1，3， 5, 7所述。
10. 含有权利要求8所述基因的重组载体。
11. 包含权利要求6所述重组载体的宿主细胞。
12. 权利要求3-7中任一项所述的抗人CD3的单链抗体在制备T淋巴细胞结合剂中的 应用。
【专利摘要】本发明涉及基因工程和蛋白质工程技术领域。具体涉及编码包含人源CD3抗体可变区片段的重组融合蛋白的DNA、其所编码的融合蛋白、该融合蛋白的生产方法、该融合蛋白的应用。本发明提供了包含人源CD3单链抗体的蛋白，其能够结合CD3阳性的T淋巴细胞，不结合CD3阴性细胞，显示出特异的靶向结合活性，具有良好的应用前景。
【IPC分类】C12N15-13, A61K39-395, C07K16-28, A61P35-00
【公开号】CN104558180
【申请号】CN201410853530
【发明人】勾蓝图, 杨金亮, 魏于全
【申请人】四川大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月31日