的处理与检测： 将发酵液IOOOOg离心10 min后，取上清250 μ L，加入750 μ L的无水乙醇，超声萃 取20 min，使用0.45 μ m的有机微孔滤膜过滤后，进行高效液相色谱（HPLC)检测。HPLC 检测条件为：色谱柱为255 mmX 4. 6 mm的C18柱，柱温25°C，紫外检测器，检测波长为238 11111，流动相为甲醇：水：磷酸=385:115:0.14 (体积比)，流速11]117111；[11，进样量204]^。
[0029] 经检测得，红曲霉产生的洛伐他汀产量为801 mg/L。
[0030] 实施例3 本发明诱变后红曲霉液态发酵生产洛伐他汀 发酵菌株：紫色红曲霉 种子培养基： 米粉 3 g，葡萄糖 2 g，NaNO3 0.2 g，蛋白胨 1.5 g，MgSO4WH2O 0.05 g，KH2PO4 0. 15 g，加水至100 mL。
[0031] 发酵培养基： 米粉 7 g，甘油 5 mL，NaN03 0.2 g，蛋白胨 1.5 g，MgS04.7H20 0.05 g，KH2P04 0.15 g，加水至100 mL。
[0032] 培养条件： 从平板上刮取红曲霉MPB3孢子转接到装有50 mL种子培养基的三角瓶中，30°C培养3 d。按照15%的接种量，将长好的种子培养基转接到150 mL发酵培养基中，30°C摇床150 r/ m培养3 d后，24°C摇床150 r/m培养20 d. 样品的处理与检测： 将发酵液IOOOOg离心10 min后，取上清250 μ L，加入750 μ L的无水乙醇，超声萃 取20 min，使用0.45 μ m的有机微孔滤膜过滤后，进行高效液相色谱（HPLC)检测。HPLC 检测条件为：色谱柱为255 mmX4.6 mm的C18柱，柱温20-25°C，紫外检测器，检测波长为 238 11111，流动相为甲醇：水：磷酸=385:115:0.14 (体积比)，流速1111171^11，进样量2〇4 1^。
[0033] 经检测得，红曲霉MPB3产生的洛伐他汀产量为1660 mg/L。
[0034] 实施例4 本发明诱变后红曲霉液态发酵生产洛伐他汀 发酵菌株：紫色红曲霉 种子培养基： 米粉 3 g，乳糖 2 g，NaN03 0.2 g，蛋白胨 1.5 g，MgS04*7H20 0.05 g，KH2P04 0.15 g，加水至100 mL。
[0035] 发酵培养基： 米粉 7 g，葡萄糖 5 g，NaNO3 0.2 g，蛋白胨 1.5 g，MgSO4WH2O 0.05 g，KH2PO4 0. 15 g，加水至100 mL。
[0036] 培养条件： 从平板上刮取红曲霉MPB3孢子转接到装有50 mL种子培养基的三角瓶中，30°C培养3 d。按照15%的接种量，将长好的种子培养基转接到150 mL发酵培养基中，30°C摇床150 r/ m培养3 d后，24°C摇床150 r/m培养20 d. 样品的处理与检测： 将发酵液IOOOOg离心10 min后，取上清250 μ L，加入750 μ L的无水乙醇，超声萃 取30 min，使用0.45 μ m的有机微孔滤膜过滤后，进行高效液相色谱（HPLC)检测。HPLC 检测条件为：色谱柱为255 mmX 4. 6 mm的C18柱，柱温25°C，紫外检测器，检测波长为238 11111，流动相为甲醇：水：磷酸=385:115:0.14 (体积比)，流速11]117111；[11，进样量204]^。
[0037] 经检测得，红曲霉MPB3产生的洛伐他汀产量为1680 mg/L。
[0038] 实施例5 诱变后红曲霉液态发酵生产洛伐他汀 发酵菌株：紫色红曲霉 种子培养基： 米粉 3 g，木糖 2 g，NaN03 0.2 g，蛋白胨 1.5 g，MgS04.7H20 0.05 g，KH2P04 0.15 g，加水至100 mL。
[0039] 发酵培养基： 米粉 7 g，甘油 5 mL，NaN03 0.2 g，蛋白胨 1.5 g，MgS04.7H20 0.05 g，KH2P04 0.15 g，加水至100 mL。
[0040] 培养条件： 从平板上刮取红曲霉MPB3孢子转接到装有50 mL种子培养基的三角瓶中，30°C培养2 d。按照15%的接种量，将长好的种子培养基转接到150 mL发酵培养基中，30°C摇床150 r/ m培养2d后，26 °C摇床150 r/m培养20d. 样品的处理与检测： 将发酵液IOOOOg离心10 min后，取上清250 μ L，加入750 μ L的无水乙醇，超声萃 取15 min，使用0.45 μ m的有机微孔滤膜过滤后，进行高效液相色谱（HPLC)检测。HPLC 检测条件为：色谱柱为255 mmX 4. 6 mm的C18柱，柱温25°C，紫外检测器，检测波长为238 11111，流动相为甲醇：水：磷酸=385:115:0.14 (体积比)，流速11]117111；[11，进样量204]^。
[0041] 经检测得，红曲霉MPB3产生的洛伐他汀产量为1730 mg/L。
【主权项】
1. 一种高产洛伐他汀的生产方法，包括下述步骤： 菌种诱变：以生理盐水从初始菌株紫色红曲菌生长斜面上将孢子洗下，制得孢子悬液， 接种种子培养基，培养36 h，取菌悬液以无菌纱布过滤，以玻璃珠震荡打散至单孢子悬液， 收集单孢子悬液然备用； 在无菌试管内加入等体积的单孢子悬液和1%的氯化锂溶液，充分混合，放置3个小时， 最后用无菌磷酸缓冲液稀释100倍，终止反应； 吸取I mL经氯化锂处理过的孢子稀释液注入无菌小皿中，置于激光下照射； 照射时间为8-12min，激光波长：630-640 nm照射功率密度为15-18 mw/cm2; 将诱变处理后的菌液稀释后涂布PDA固体平板，26-32°C培养3-4 d ; 将长出的单菌落转接到固体PDA平板的一侧，26-32°C培养4-5 d后，在平板另一侧转 接构巢曲霉，26-32°C下进行对峙培养7-8 d; 选取构巢曲霉菌落直径为3. 0-5. Ocm的红曲霉菌株，从平板上刮取红曲霉孢子转接 到种子培养基上，26-32°C培养2-5 d，按照12-16%的接种量，将长好的种子培养基转接到 发酵培养基中，26-32°C摇床120-180 r/m培养2-5 d后，20-25°C摇床120-180 r/m培养 18-25d。
2. 根据权利要求1所述的一种高产洛伐他汀的生产方法，其特征在于：所述种子培养 基包括米粉 2-5g、碳源 l-3g、氮源 0· 1-0. 5g、蛋白胨 L 0-2. 0g、MgSO4 · 7H20 0· 02-0. 08g、 KH2PO4 0· 10-0. 20g，力口水至 100 mL。
3. 根据权利要求2所述的一种高产洛伐他汀的生产方法，其特征在于：所述碳源为葡 萄糖、乳糖或木糖，所述氮源为NaNO3。
4. 根据权利要求3所述的一种高产洛伐他汀的生产方法，其特征在于：所述种子培养 基包括米粉 3g、葡萄糖 2g、NaNO3 0· 2g、蛋白胨 I. 5g、MgSO4 · 7H20 0· 05g、KH2PO4 0· 15g，加 水至100 mL。
5. 根据权利要求I所述的一种高产洛伐他汀的生产方法，其特征在于：所述发酵 培养基包括米粉5-10 g、碳源1-5 mL、氮源0. 1-0. 5 g、蛋白胨1. 0-2. 0g、MgSO4 · 7H20 0· 02-0. 08g、KH2PO4 0· 10-0. 20g、加水至 100 mL。
6. 根据权利要求5所述的一种高产洛伐他汀的生产方法，其特征在于：所述碳源为甘 油或葡萄糖，所述氮源为NaN03。
7. 根据权利要求6所述的一种高产洛伐他汀的生产方法，其特征在于：所述发酵培养 基包括米粉 7 g、甘油 5mL、NaN03 0· 2 g、蛋白胨 I. 5g、MgS04 · 7H20 0· 05g、KH2P04 0· 15g、 加水至100 mL。
8. 根据权利要求I所述的一种高产洛伐他汀的生产方法，包括下述步骤： 菌种诱变：以生理盐水从初始菌株Monascus purpureus紫色红曲菌生长斜面上将孢 子洗下，制得孢子悬液，接种种子培养基，培养36 h，取菌悬液以无菌纱布过滤，以玻璃珠震 荡打散至单孢子悬液，收集单孢子悬液然备用； 在无菌试管内加入等体积的单孢子悬液和1%的氯化锂溶液，充分混合，放置3个小时， 最后用无菌磷酸缓冲液稀释100倍，终止反应； 吸取I mL经氯化锂处理过的孢子稀释液注入无菌小皿中，置于激光下照射； 照射时间为l〇min，激光波长：632. 8nm照射功率密度为17. 6 mw/cm2; 将诱变处理后的菌液稀释后涂布PDA固体平板，30°C培养3 d ; 将长出的单菌落转接到固体PDA平板的一侧，30°C培养4 d后，在平板另一侧转接构巢 曲霉，30°C下进行对峙培养8 d; 选取构巢曲霉菌落直径为3. 0-5. Ocm的红曲霉菌株，从平板上刮取红曲霉孢子转接到 种子培养基上，30°C培养3d，按照15%的接种量，将长好的种子培养基转接到发酵培养基 中，30°C摇床150r/m培养3 d后，24°C摇床150 r/m培养20d。
9.根据权利要求1或8所述的一种高产洛伐他汀的生产方法，其特征在于：所述初始 菌株紫色红曲菌Monascus sp.于2012年11月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo. 6807。
【专利摘要】本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种高产洛伐他汀的生产方法及该生产方法所用到的红曲菌，其包括菌种的诱变以及利用该诱变菌种进行发酵，本发明的有益效果是：本发明的诱变菌株及其生产洛伐他汀的方法，与常规红曲霉生产菌株及生产方法相比，其洛伐他汀产量可达到1650mg/L以上，洛伐他汀生产能力更高，提高了洛伐他汀的质量。CGMCC No.68072012.11.13
【IPC分类】C12P17-06, C12R1-66
【公开号】CN104561166
【申请号】CN201410711506
【发明人】赵吉兴, 李纪顺, 吴远征, 李耀, 杨合同, 陈泉, 扈进冬, 王贻莲, 闫芃, 韩岩君
【申请人】山东中惠食品有限公司, 山东省科学院中日友好生物技术研究中心
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月1日