一种快速检测白色霞水母的特异性引物及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种快速检测白色霞水母的特异性引物及其 检测方法。
【背景技术】
[0002] 白色霞水母（Cyanea nozakii)隶属鉢水母纲（Scyphomedusae)，旗口水母目 (Semaeostomeae)，霞水母科（Cyaneidae)。白色霞水母是我国沿海广泛分布的一种含毒水 母，白色霞水母生长过程中分泌毒素并缠粘网具，暴发性增殖使海洋生态失衡，因此对海洋 渔业资源造成巨大负面影响。白色霞水母触手上有大量刺丝囊，当受到刺激会释放刺丝和 毒素，各地每年都有大量的游客、渔民或者涉海工作者被蜇伤。因此，白色霞水母已成为国 家海洋局有害水母监测的重点海洋生物之一。
[0003] 然而，白色霞水母具有复杂的生活史，其发育过程经历受精卵、螅状幼体、碟状幼 体、幼水母及成体水母等不同阶段。不同生活史阶段形态差异较大，并且在采集过程中容易 受损，使得传统形态鉴定的方法具有一定的局限性。如：董婧等通过对白色霞水母各发育阶 段的形态和结构研宄发现，白色霞水母与海蜇的螅状幼体从形态上难以区分。分子生物学 检测方面，国内外已有PCR检测方法的相关报道，该方法虽然不受形态差异的限制，但是存 在着检测时间长、操作复杂、仪器要求高等诸多弊端。因此，提供一种简便快捷、灵敏度高的 检测方法对调查不同生活史阶段白色霞水母的种群分布显得尤为重要。
[0004] 环介导等温扩增技术（LAMP)是由Notomi等发明的一种等温扩增特异性核酸片段 的技术。该技术通过针对靶基因六个区域设计的四条特殊引物和具有链置换活性的DNA聚 合酶，使得模板两端引物结合处循环出现环状结构，实现等温条件下引物与模板的链置换 扩增反应。与传统的PCR技术相比，LAMP技术具有简单，扩增效率高和特异性强等优势。另 夕卜，LAMP扩增产物的检测方法简便易行，可通过肉眼观察是否存在焦磷酸镁白色沉淀判断 靶基因的存在，或通过加入SYBR Green I染料观察颜色的变化，也可通过琼脂糖凝胶电泳 进行检测。该技术已在病原微生物的检测、食品安全检查、有害藻类鉴定等方面得到广泛应 用。目前，国内外均未见利用LAMP技术检测白色霞水母方法的相关报道。
【发明内容】
[0005] 本发明目的在于提供一种快速检测白色霞水母的特异性引物及其检测方法。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
[0007] 一种快速检测白色霞水母的特异性引物，引物是CN-F3、CN-B3、CN-FIP、CN-BIP ;
[0008] CN-F3 :5'-ATGCCTGTTCTTATAGGAGG-3'
[0009] CN-B3 :5'-CCATGTCTACAGATCCTCC-3'
[0010] CN-FIP : 5'-TGTTAAGTCTGGGGAAAGCCATATTTGGTAACTGACTTATACCTTTG-3'
[0011] CN-BIP :5'-ATCAGCTTTAATAGAACAAGGTGCATGAATAGATGCTAAAGTGGGATA-3'。
[0012] 一种检测白色霞水母的方法，以CN-F3、CN-B3、CN-FIP、CN-BIP作为特异性引物， 通过LAMP反应进行检测。
[0013] LAMP反应体系包括：0? 5-2. 0yLdNTPs(10mmol/L，终浓度范围：0? 2mmol/ L-0. 8mmol/L)、1. 25-7. 5yL甜菜碱（4mol/L,终浓度范围：0? 2mol/L-l. 2mol/L)、0? 5yL 弓丨物〇^卩3(1011111〇1/1，终浓度：0.211111〇1/1)、0.51^弓丨物〇^83(1011111〇1/1，终浓 度：0? 2ymol/L)、0? 25-4yL引物CN-FIP(20ymol/L，终浓度范围：0? 2-3. 2ymol/L)、 0? 25-4yL引物CN-BIP(20ymol/L，终浓度范围：0? 2-3. 2ymol/L)、4yLMgS04(36mmol/ L，终浓度：6mmol/L)、2.5yLlOXThermoPol缓冲液、lyLBstDNA聚合酶（大片段，8U)、 lyLDNA模板，加灭菌的去离子水至25yL。
[0014] 优选的 LAMP 反应体系包括：2.5yL lOXThermoPol 缓冲液、lyL dNTPs(10mmol/ L，终浓度 0? 4mmol/L)、3. 75 y L 甜菜喊 Betaine (4mol/L，终浓度：0? 6mol/L)、4 y L MgS04(36mmol/L，终浓度：6mmol/L)、0? 5 y L 引物 CN-F3(10 ymol/L，终浓度：0? 2 ymol/L)、 〇? 5 y L 引物 CN-B3 (10 y mol/L，终浓度：0? 2 y mol/L)、2 y L 引物 CN-FIP (20 y mol/L，终浓 度 1. 6 ymol/L)、2 y L 引物 CN-BIP(20 ymol/L，终浓度 1. 6 ymol/L)、1 y L Bst DNA 聚合酶 (大片段，8U)、1 y L DNA模板，加灭菌去离子水至25 y L。
[0015] 所述LAMP反应条件为60-65°C保温30-60min，80°C保温5min结束反应。
[0016] 所述LAMP扩增产物反应体系中加入荧光染料SYBRGreenI，反应产物体系颜色 由红褐色变为绿色，待测样品中含有白色霞水母；反应产物体系颜色始终为红褐色，待测样 品中没有白色霞水母。
[0017] 所述LAMP扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，电泳图像中有连续梯状条带，即待 测样品含有白色霞水母；没有梯形条带产生，即待测样品中不含白色霞水母。
[0018] -种快速检测白色霞水母的特异性引物的应用，所述特异性引物在制备检测白色 霞水母试剂盒中的应用。
[0019] 本发明原理为：①设计一组能特异识别靶DNA的六个不同序列的两个内引物（上 游内引物和下游内引物）和两个外引物（上游外引物和下游外引物），内引物包含靶DNA 的正义链和反义链；②其中一个内引物首先与靶DNA杂交，随后的链置换DNA合成，在具有 高度链置换活性的DNA聚合酶的参与下，由一个外引物启动，释放出单链DNA，并作为由杂 交到靶的另一端的一个内引物和一个外引物启动的DNA合成的模板，产生一个原始的茎环 DNA ;③内引物以原始的茎环DNA为模板，启动链置换DNA的合成，产生一个原始的茎环DNA 和一个新的有两倍茎长度的茎环DNA ;④在等温条件下，内引物以茎环DNA为模板，通过链 置换形成多个含有靶DNA反复重复序列的茎环DNA，在一小时内该循环反应可使靶DNA累积 到1〇 9拷贝，最后通过加入荧光染料来观察扩增结果。
[0020] 本发明所具有的优点：本发明利用环介导等温扩增技术（LAMP)建立起白色霞水 母的快速检测方法，该技术特异性强，灵敏度高、不需昂贵的PCR仪，只需普通的恒温水浴 槽即可，扩增结果使用荧光染料来观察即可，检测方法易行，操作简便，且成本低廉，能够更 加快速、特异、灵敏地检测不同生活史阶段的有害水母白色霞水母。
【附图说明】
[0021] 图1为本发明实施例提供的LAMP方法检测白色霞水母的特异性图，其中A图为肉 眼观察图像；B图为电泳检测结果。
[0022] 图2为本发明实施例提供的LAMP方法检测白色霞水母的灵敏性图；
[0023] 图3为本发明实施例提供的PCR方法检测白色霞水母的灵敏性图。
【具体实施方式】
[0024] 以下实施例来具体解释本发明，但实施例并不对本发明做任何限定。
[0025] 水母样品采集：白色霞水母样品采自青岛发电厂附近的海水养殖区；特异性验 证所用水母采自黄渤海海域，包括：海月水母、沙海蜇、海蜇、Clytia gracilis、半球美 媳水母、厦门和平水母、Corymorpha bigelowi、锡兰和平水母、带玛拉水母、Parisotoma notab i 1 i s、嵊山秀氏水母、灯塔水母、薮枝媳、八斑芮氏水母、棍媳。
[0026] Bst DNA聚合酶（大片段）购自New England Biolabs ;海洋动物组织基因组DNA 提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；PCR试剂（Premix Taq?)购自宝生物工 程（大连）有限公司。
[0027] 实施例1、快速检测白色霞水母的特异性引物设计
[0028] 根据GenBank中白色霞水母的基因保守序列，即白色霞水母线粒体细胞色 素C氧化酶第一亚基（mtCOI)序列，利用在线引物软件PrimerExplorerV4 (http: // primerexplorer. jp/elamp4. 0? 0/index. html)设]r| 套 LAMP 引物，其中 CN-F3、CN-B3 为 外引物，CN-FIP、CN-BIP为内引物，引物交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，弓丨 物序列如下：
[0029] CN-F3 :5'-ATGCCTGTTCTTATAGGAGG-3'
[0030] CN-B3 :5'-CCATGTCTACAGATCCTCC-3'
[0031] CN-FIP :5'-TGTTAAGTCTGGGGAAAGCCATATTTGGTAACTGACTTATACCTTTG-3'
[0032] CN-BIP :5'-ATCAGCTTTAATAGAACAAGGTGCATGAATAGATGCTAAAGTGGGATA-3'。
[0033] 实施例2、快速检测白色霞水母的检测方法
[0034] 一、水母基因组DNA提取
[0035] 参照海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒的操作步骤，提取Clytia gracilis、 半球美媳水母、厦门和平水母、Corymorpha bigelowi、锡兰和平水母、带玛拉水母、 Parisotoma notabilis、嵊山秀氏水母、灯塔水母、薮枝媳、八斑芮氏水母、棍媳、海月水母、 沙海蜇、海蜇和白色霞水母的基因组DNA，提取的各自DNA分别用1-15和17表示，具体是 1-15依次为Clytia gracilis、半球美媳水母、厦门和平水母、Corymorpha bigelowi、锡兰 和平水母、带玛拉水母、Parisotoma notabi 1 is、嵊山秀氏水母、灯塔水母、薮枝媳、八斑芮 氏水母、棍螅、海月水母、沙海蜇、海蜇，17为白色霞水母。
[0036] 二、LAMP反应体系与反应条件优化
[0037] 25yL LAMP 反应体系：0.5-2.0yL dNTPs(10mmol/L，终浓度范围：0.2mmol/ L-0. 8mmol/L)、1. 25-7. 5 y L 甜菜碱（4mol/L,终浓度范围：0? 2mol/L-l. 2mol/L)、0? 5 y L 弓丨物〇^卩3(1011111〇1/1，终浓度：0.211111〇1/1)、0.51^弓丨物〇^83(101111