repSpinMiniprepKit小提质粒：将Iml菌液倒入 标记好的I. 5ml离心管中，13000rpm，4°C，3分钟，离心弃去上清；加250yIBufferP1，混 匀，加250yIBufferP2,迅速轻轻颠倒4-6次；加入350yIBufferN3,颠倒4-6次混匀， 有白色絮状物析出，13000rpm，4°C，10分钟；把QIAprepspincolumn放于1.5mlEP管中 (收集废液）然后将上清移入QIApr印spincolumn中，8000rpm4°C1分钟；弃去废液，加 750yIBufferPE，13000rpm，4°C，1 分钟，弃去废液，13000rpm，4°C，1 分钟离心，将QIApr印 spincolumn移入新的1.5ml离心管中，竖直加30ylBufferEB于膜上，放置1分钟后， 4°C，13000rpm，Imin离心获得液体单克隆的质粒。测序鉴定正确克隆，即IL21-CD137L细胞 因子质粒。
[0078] (3) IL2细胞因子质粒的制备
[0079] IL2由人工合成获得TA克隆，IL2基因序列如SEQ ID NO. 13所示。
[0080] 用SacI和NotI分别消化pCMV载体（质粒载体示意图见图1)，IL2合成TA克隆， 消化产物分别进行1%琼脂糖电泳（TBE电泳缓冲液：Tris108克、Na2EDTA，2H20 7. 44克、 硼酸55克，去离子水定容至1L);切下回收目标片断和载体至已称重的1.5mlEP管中，用 QIAEXIIGelExtractionKit纯化：加入 3 倍体积的BufferQXl(IOOmg加 300yIQX1)。 加30ylBufferQIAEXII然后50°C水浴10分钟，期间每两分钟漩涡振荡一次。13000rpm 离心30秒，弃去上清，加500yIQIAEXI洗一次，加BufferPE500y1洗两次弃去上清， 空气干燥15分钟直至沉淀变白。加入20yITE漩涡振荡30秒培育5分钟，13000rpm，离心 30秒将上清移入I. 5mlEP管，测量浓度。
[0081] 将酶切纯化的pCMV载体片段和IL2基因片段连接，使用T4连接酶试剂盒：按摩尔 数1:3混合pCMV载体片段和IL2基因片段，加入连接酶1U，IOXLigationBuffer2yl， 纯化水补足至20y1，16°C反应3小时完成反应，取2. 5y1转化至DH5a。
[0082] 经转化的DH5a冰中放置30分钟，42°C加热45秒钟后，再冰中放置1分钟。加入 LB培养基，37°C振荡培养60分钟。取100y1涂在含有氨苄青霉素的L-琼脂平板培养基 上，37°C培养16小时，形成单菌落，挑多个单菌落至2ml含氨苄青霉素LB培养基培养8小 时。
[0083] 将培养8小时的菌液用QIAprepSpinMiniprepKit小提质粒：将Iml菌液倒入 标记好的I. 5ml离心管中，13000rpm，4°C，3分钟，离心弃去上清；加250yIBufferP1，混 匀，加250yIBufferP2,迅速轻轻颠倒4-6次；加入350yIBufferN3,颠倒4-6次混匀， 有白色絮状物析出，13000rpm，4°C，10分钟；把QIAprepspincolumn放于1.5mlEP管中 (收集废液）然后将上清移入QIApr印spincolumn中，8000rpm4°C1分钟；弃去废液，加 750yIBufferPE，13000rpm，4°C，1 分钟，弃去废液，13000rpm，4°C，1 分钟离心，将QIApr印 spincolumn移入新的1.5ml离心管中，竖直加30ylBufferEB于膜上，放置1分钟后， 4<€，13000印111，11]1；[11离心获得液体单克隆的质粒。测序鉴定正确克隆，即112细胞因子质 粒。
[0084] 实施例2制备细胞因子颗粒
[0085]取 48yIgag质粒（0?lug/yI)、20y1 细胞因子质粒（0?lug/y1)混合；加 480ylDMEM(dulbecco'smodifiedeaglemedium)培养基充分混勾，加 120yl磷酸 1?转 染试剂（PolyFectTransfectionKit)混匀，室温静止5?10分钟。293细胞用0?OlMPBS 洗两遍，0.25%TrypsinEDTA消化后，加完全培养基（DMEM培养基+10%胎牛血清）吹打分 散，计数，75ml培养瓶装入800万个细胞并补足培养液终体积9ml，待转染质粒用3. 6ml完 全培养基稀释后加入培养瓶，轻拍，使质粒复合体在细胞悬液中充分混匀。37°C、5%C02培 养箱培养6小时，吸去转染混合液，PBS轻轻洗细胞3遍，加入DMEM培养基继续培养72小 时。收集上清，用〇. 45umPVDF膜过滤，4°C保存，即含有细胞因子颗粒的液体。
[0086] 鉴定：通过细胞免疫荧光实验鉴定细胞因子的表达，并应用相应的商品化的细胞 因子标准品和其相应单抗的酶联免疫反应OD值绘制标准曲线，对所制备细胞因子颗粒进 行定量。实验步骤如下：
[0087] 用PBS轻轻漂洗细胞3遍，然后加入适量5%甲醛覆盖细胞，在4°C放置20分钟； 然后用PBS轻轻漂洗3遍；加入BSA封闭：37°C，室温保持20分钟，用PBS轻轻漂洗3遍； 加入相应细胞因子单抗，4°C过夜，或者37°C孵育2小时；PBS轻轻漂洗3遍；加入标记FITC 荧光标记二抗（相应一抗的抗体），37°C孵育30分钟；PBS轻轻漂洗3遍，荧光显微镜下观 察结果。结果证实实施例1中涉及的细胞因子及共刺激因子在细胞表面表达。
[0088] 用PBS将相应细胞因子单抗配制为浓度2ug/ml，包被至酶标板中，4°C过夜，然后 使用PBS清洗两遍；细胞因子标准品作十倍系列梯度稀释后，将梯度标准品和待测细胞因 子颗粒按每孔50y1等体积分别加入酶标板中，37°C孵育2小时；PBS轻轻漂洗1遍；加入 辣根过氧化物酶标记的细胞因子单抗，37°C孵育30分钟；PBS轻轻漂洗1遍；按每孔50y1 等体积分别加入辣根过氧化物酶底物后，通过酶标仪读取各孔OD值。
[0089] 将梯度标准品的OD值绘制曲线，计算待测细胞因子颗粒的含量，并将细胞因子颗 粒的浓度调整到与常规细胞因子应用的浓度一致，800IU/ml。
[0090] 实施例3细胞因子颗粒IL15-⑶137L刺激单个核细胞分化和扩增为NK细胞
[0091] 单个核细胞（PBMC)采集：使用（肝素/EDTA)抗凝采集外周血50ml，使用淋巴细 胞分离液（ficol)分离PBMC(单个核细胞），并使用（DMEM/1640/生理盐水/PBS)洗2遍； 同时收集血浆，56°C灭活30分钟。
[0092] 培养瓶处理：使用PBS将mAb-⑶16单克隆抗体配置为浓度l-5ug/ml，包被至75cm2 培养瓶，过夜，然后使用生理盐水清洗两遍。4°C保存待用。
[0093]T551培养基分为两组，分别为含细胞因子IL15和⑶137受体的配体蛋白的细胞因 子颗粒IL15-CD137L(800IU/ml)的细胞因子颗粒组和含常规细胞因子IL15和CD137L(各 800IU/ml)的常规细胞因子组。培养条件：温度：37±0. 5°C、湿度：大于90%、C02浓度： 7. 5±0. 5%〇
[0094] 将上述PBMC计数并分组，按I. 0?9. 9XIO6个/ml密度分别使用上述分组的预 热的T551培养基（此时配制含5%的自体灭活血浆）重悬PBMC(-般体积为20ml)。重悬 PBMC加入上述处理的培养瓶中，培养3天。
[0095] 第4-14天：根据体积更换容器（无须进行抗体包被处理），根据细胞生长情况大 约每2-3天按1:1比例补充所在组别的T551培养基（此时配制含1%自体灭活血浆）。每 天取样100y1进行细胞计数，记录细胞数量（参见表1和图2)。
[0096] 通过两组细胞数量变化比较常规细胞因子刺激和细胞因子颗粒刺激的增殖效果， 从表中的数值和统计学检验可以看出，第4-14天细胞因子颗粒刺激的的细胞增殖效果显 著优于常规细胞因子（P〈〇. 05)。
[0097]表I:PBMC增殖细胞计数（IL15-CD137L)
[0098]
【主权项】
1. 一种细胞因子颗粒，其特征在于：所述颗粒包括细胞因子和gag蛋白，优选的，所述 颗粒的表面负载或展示所述细胞因子。
2. 如权利要求1所述的颗粒，所述颗粒通过细胞分泌的方式形成，优选的，所述细胞因 子包括白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、生长因子和/或趋化性细胞因 子，更优选的，所述细胞因子是白细胞介素。
3. 如权利要求1-2任一所述的颗粒，所述颗粒还包括共刺激分子。
4. 一种表达载体系统，其特征在于：包括：（1)包含重组蛋白gag基因的载体和（2)包 含细胞因子基因的载体，优选的，所述细胞因子包括白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、集 落刺激因子、生长因子和/或趋化性细胞因子，更优选的，所述细胞因子是白细胞介素。
5. 如权利要求4所述的表达载体系统，其特征在于：还包括共刺激分子基因。
6. -种宿主细胞，其特征在于：包含权利要求4-5任一所述的表达载体系统。
7. -种权利要求1-3任一所述的颗粒的制备方法，其特征在于：将权利要求6所述的 宿主细胞在合适的条件下表达。
8. 权利要求1-3任一所述的颗粒在制备刺激单个核细胞分化和扩增试剂中的用途。
9. 权利要求1-3任一所述的颗粒在刺激单个核细胞分化和扩增中的用途。
10. -种刺激单个核细胞分化和扩增的方法，使用权利要求1-3任一所述的颗粒体外 刺激单个核细胞。
【专利摘要】本发明提供一种细胞因子颗粒及其应用，其包括细胞因子颗粒制作方法，所述的颗粒包含一个或多个细胞因子以及重组蛋白gag形成的颗粒；以及细胞因子颗粒体外刺激单个核细胞分化的方法，其中包括细胞因子颗粒体外刺激单个核细胞分化为NK细胞或T细胞并扩增其数量。细胞因子颗粒比细胞因子刺激作用更强，效果显著。
【IPC分类】C12N5-0783, C12N15-85, C07K14-475, C07K14-52
【公开号】CN104610442
【申请号】CN201510048164
【发明人】张永辉, 林小靖
【申请人】张永辉, 林小靖
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2015年1月30日