[0031] 1.2溶磷菌株的纯化与筛选
[0032] 于2014年3月采集于黑龙江省齐齐哈尔市禾本科作物的植物根际土壤，采用抖土 法收集根表面土壤，放入无菌袋中，于4°C冰箱内保存备用。分别称取根系混合土壤lg，按 无菌操作投入装有9ml无菌水和8粒无菌玻璃珠的250ml三角瓶中，置恒温振荡器中，在 25°C、170r/min条件下振荡20min得到10% (KT1)浓度的土壤悬液，进行浓度梯度稀释，分 别得到KT4、l(T5、l(r6浓度的土壤悬液。分别吸取不同梯度的土壤悬液0.lml涂布到固体 PK0培养基中。每个梯度设定3组平行，存放于28°C恒温箱内培养5d，挑取具有溶磷圈的单 菌落进行纯化。
[0033] 将纯化后的菌株使用灭菌牙签分别点植于平板上，在28°C培养箱中培养10d，测 量溶磷圈直径（D)和菌落直径（d)，根据D/d值比较各菌株溶磷能力（HettiarachchiR P，DharmakeerthiRS，SeneviratneG，etal.Phosphatesolubilizingbacteriaand fungiisolatedfromrubber(Heveabrasiliensis)rootrhizosphere,theirbiofilm formationandphosphatesolubilizingabilities[C].Proceedingsofinternational forestryandenvironmentsymposium. 2014，18;李蓉，周德明，吴毅，等?杉木根际溶磷菌 筛选及其部分特性的初步研究[J].中南林业科技大学学报，2012,32(4) :95-99)，筛选出 溶磷能力较高的菌株。
[0034] 1. 3菌株鉴定与生长曲线测定
[0035] 对筛选菌株进行形态和16SrDNA分类鉴定，采用Mega5. 0制作进化树^挑取筛 选菌株单菌落接种于100ml液体PKO培养基中，28°C，120r/min摇瓶培养，每4h测定吸光值 (0D_J，制作菌株生长曲线。
[0036] 1. 4溶磷菌株的溶磷能力测定
[0037] 1. 4. 1磷含量标准曲线的绘制
[0038]分别将 2yg/ml的磷标准液以 0? 0ml、0. 5ml、l. 0ml、3. 0ml、5. 0ml、10. 0ml加入 25ml的比色管中，超纯水定容至25ml，得到含磷量为0. 00yg/ml、0. 04yg/ml、0. 08yg/ ml、0. 24yg/ml、0. 40yg/ml、0. 80yg/ml、1. 20yg/ml标准液。在室温下加入钼铺抗显色 剂，显色时间20min，测得吸光值并制作标准曲线。测定标准曲线为y= 0. 5256X+0. 0359， 相关系数R2= 〇. 99。
[0039] 1. 4. 2溶磷能力测定
[0040]将筛选菌株单菌落接入液体PK0培养基制作种子液，培养4d后按1 %的接种 量接入液体PK0培养基，在28°C、120r/min的摇床中进行培养。每隔24h取5ml菌悬液 在4000r/min下离心20min，取上清液0. 25ml稀释100倍定容至25ml，通过钼铺抗比色 法（WangJB，ChenZH，ChenLJ，etal.Surfacesoilphosphorusandphosphatase activitiesaffectedbytillageandcropresidueinputamounts[J].Plant,Soiland Environment，2011，57 (6) :251-257.)进行溶磷能力的测定，同时测定pH值。每个处理均 以无菌液体培养基作为对照，并用接菌培养基含磷浓度减去对照磷浓度，计算细菌的溶磷 能力。
[0041] 1.5IAA分泌量测定
[0042] 1. 5. 1IAA标准曲线测定
[0043] 标准曲线采用分析纯IAA进行制备，将50yg/ml的IAA标准液梯度稀释为0yg/ ml、10yg/ml、20yg/ml、30yg/ml、40yg/ml、50yg/ml，测定标曲，得到标准曲线为y= 0? 0115x+0. 003,相关系数R2= 0? 9934。
[0044] 1. 5. 2植物生长素分泌定量测定
[0045] 将筛选菌株制作种子液，按1 %的接种量接入含有200mg/L色氨酸的液体蒙金娜 培养基中，在28°C、120r/min的摇床中进行培养，采用Salkowski显色法测量IAA量。
[0046] 1. 6溶磷菌株对西瓜幼苗的影响
[0047] 1. 6. 1菌悬液的制备
[0048] 筛选菌株接入PK0液体培养基中，培养到一定浓度（0D_= 0. 5)后备用。
[0049] 1. 6. 2培养与测定
[0050] 土壤取自齐齐哈尔大学生物园，供试土壤的理化性质为有机质含量24. 59g/kg、土 壤速效磷含量146. 46mg/kg、土壤pH值6. 69、EC0? 74ms/cm。待种西瓜种子使用0? 1%的 升汞消毒l〇min，再用无菌水清洗5次。将种子播种于灭菌土中，每盆播种3枚种子，用无菌 水与菌悬液分别浇灌，以浇灌无菌水的种子作为对照组（CK)，浇灌菌悬液的种子为实验组 (实验组使用菌悬液只浇灌一次，每盆30ml，之后用无菌水浇灌），做三组平行，置于智能人 工气候箱内培养（28°C/光照12h，18°C/黑暗12h，湿度为60% )。培养30d，采用根系分析 仪（LA-S2400)扫描根长度、根体积、根表面积，测量根系直径分别在0-0. 5mm、0. 5-1. 0_、 1. 0-1. 5mm、1. 5-2mm、2_2. 5mm、2. 5_3mm范围内的根长，烘干后称量根系干重，由总根长和总 干重的比值得到西瓜幼苗的比根长。
[0051] 2结果与分析
[0052] 2. 1溶磷菌株的筛选
[0053] 通过表1可知，分离纯化得到7株溶磷菌，其中HYL01的D/d= 1. 52±0. 08,优势 明显高于其它菌株，因此选择其进行之后的各项检测。
[0054] 表1HYL01溶磷圈比值
【主权项】
1. 一株经分离获得的菠萝泛菌（Pantoeaananatis)菌株，命名为菠萝泛菌HYL01，保 藏在中国典型培养物保藏中心，地址在武汉大学，其微生物保藏号是CCTCCNO.M2014530， 保藏日期为2014年10月29日。
2. 权利要求1所述的菠萝泛菌菌株在促进西瓜根系生长中的应用。
3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的促进西瓜根系生长包括促进西瓜的根 长、根表面积、根体积、比根长以及根系直径为大于0至小于等于0. 5_范围内的西瓜幼苗 毛根根长所占的比例。
【专利摘要】本发明公开了一株经分离获得的菠萝泛菌HYL01菌株及其在促进西瓜根系生长中的应用。本发明的一株经分离获得的菠萝泛菌(Pantoea ananatis)菌株，命名为菠萝泛菌HYL01，保藏在中国典型培养物保藏中心，地址在武汉大学，其微生物保藏号是CCTCC NO.M 2014530，保藏日期为2014年10月29日。研究结果表明，菌株HYL01具有较强的溶磷能力，溶解Ca3(PO4)3的有效量为140.26mg/L，同时还具有分泌IAA的能力，IAA最大分泌量11.39mg/L。HYL01菌剂施用后，能够显著促进西瓜幼苗的总根长、根表面积、根体积以及比根长的增长，并且显著增加了根系直径为大于0至小于等于0.5mm范围内的西瓜幼苗毛根根长所占的比例，因此，本发明获得的一株经分离获得的菠萝泛菌菌株HYL01具有制备促进西瓜根系生长的复合微生物菌肥的潜力。CCTCC NO. M 201453020141029
【IPC分类】A01P21-00, C12R1-01, A01N63-00, C12N1-20
【公开号】CN104694422
【申请号】CN201510072393
【发明人】王志刚, 徐伟慧, 李珊珊, 胡云龙, 胡影, 刘帅, 王春龙
【申请人】齐齐哈尔大学
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年2月11日