提供了所述二联手足口病灭活疫 苗的制备方法。
[0030] 一种二联手足口病灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
[0031] 步骤1 :将保藏编号为CGMCCNo. 7753的人肠道71型病毒株CC-09和保藏编号为 CGMCCNo. 7752的柯萨奇A16型病毒株CC-16分别接种于扩大传代培养的Vero细胞或人胚 肺二倍体细胞中培养；
[0032] 步骤2 :分别收获两种病毒培养液，除杂质后浓缩、灭活、纯化得到两种病毒原液；
[0033] 步骤3 :取步骤2制备的两种病毒原液除菌，混合即得所述二联手足口病灭活疫 苗。
[0034] 本发明所述二联手足口病灭活疫苗的制备方法首先将两种病毒株接种于扩大传 代培养的Vero细胞或人胚肺二倍体细胞中培养以获得病毒培养液。
[0035]Vero细胞是非洲绿猴肾细胞是一种异倍体细胞，经猕猴肾细胞培养衍化后产生， 是常用的疫苗生产细胞系，常作为培养病毒的宿主细胞。
[0036] 人胚肺二倍体细胞是常用的疫苗生产细胞系。优选的，所述人胚肺二倍体细胞为 MRC-5、2BS等细胞株。
[0037] 优选的，所述Vero细胞或人胚肺二倍体细胞的扩大传代培养为利用生物反应器 或多层细胞工厂进行扩大传代培养。应用生物反应器或多层细胞工厂培养细胞，细胞密度 高，接种病毒后，病毒产量高，从而提高疫苗产量。
[0038] 优选的，所述病毒培养时所用的培养基为199培养基，所述培养基不含有血清，接 种病毒后获得的病毒培养液牛血清白蛋白含量低，疫苗安全性高。
[0039] 作为优选，步骤1所述接种按0. 001M0I~0. 1M0I比例接种病毒。其中，M0I是 multiplicityofinfection的缩写，中文译为感染复数，普遍用于病毒感染细胞的研宄 中。一般认为M0I是一个比值，没有单位，其实其隐含的单位是pfunumber/cell，含义是 感染时病毒与细胞数量的比值。即步骤1所述接种优选为按照病毒与细胞数量为1:10~ 1:1000的比例接种。
[0040] 进一步的，步骤1所述培养为33°C~36°C培养72~120小时。即两种病毒株的 培养条件为33°C~36°C培养72~120小时。
[0041] 本发明所述二联手足口病灭活疫苗的制备方法培养病毒后收获两种病毒培养液 后，除杂质、浓缩、灭活、纯化得到两种病毒原液。
[0042] 其中，所述除杂质优选为通过离心或多级过滤器过滤除杂质。
[0043] 进一步的，所述离心为6000rpm离心30min;所述多级过滤器所用滤柱孔径大小为 0. 1um~ 0. 5um。
[0044] 本发明所述病毒培养液浓缩为超滤浓缩，进一步的，所述超滤浓缩的超滤膜的截 留分子量为100KD~300KD。
[0045] 病毒培养液经浓缩后灭活以使其在保留免疫原性的同时失去繁殖能力。作为优 选，所述灭活为用甲醛溶液或丙内酯溶液灭活。
[0046] 进一步的，所述用甲醛溶液灭活的具体条件为甲醛溶液中的甲醛与水的浓度比为 1 : 2000~1 : 4000,灭活温度为35°C~37°C，灭活时间为6天~12天。
[0047] 进一步的，所述用0-丙内酯溶液灭活具体条件为0-丙内酯溶液中的0-丙内 酯与灭活病毒液的浓度比为1 : 2000~1 : 4000,灭活温度为4°C灭活时间2天~5天。
[0048] 本发明所述制备方法在灭活病毒后对病毒进行纯化，其中所述纯化优选为阴离子 交换层析、分子筛凝胶过滤层析、复合模式介质层析中的一种或多种，以得到高纯度的EV71 和CA16病毒原液。
[0049] 进一步的，步骤2所述纯化为先采用阴离子交换层析再采用分子筛凝胶过滤层 析。采用阴离子交换对病毒灭活液进行初步纯化，以去除宿主细胞DNA，再应用分子筛凝胶 过滤的纯化方法进行精制纯化，去除各种杂质蛋白，得到纯度较高的病毒原液。
[0050] 本发明所述制备方法取纯化制得的两种病毒原液除菌，混合即得所述二联手足口 病灭活疫苗。
[0051] 优选的，所述除菌为经0. 2ym滤膜除菌。
[0052] 为增强灭活疫苗免疫原性，通常需要加入佐剂。佐剂又称非特异性免疫增生剂，本 身不具抗原性，但同抗原一起或预先注射到机体内能增强免疫原性或改变免疫反应类型。 因此本发明所述二联手足口病灭活疫苗的制备方法步骤3所述混合为将除菌后的两种病 毒原液混合后吸附佐剂；或者为将除菌后的两种病毒原液分别吸附佐剂然后再混合。
[0053] 优选的，所述佐剂为氢氧化铝溶液。氢氧化铝在疫苗中使用不仅可以提高机体的 免疫应答而且具有较好的安全性。
[0054] 优选的，所述混合的比例为保藏编号为CGMCCNo. 7753的人肠道71型病毒株 CC-09的病毒原液和保藏编号为CGMCCNo. 7752的柯萨奇A16型病毒株CC-16的病毒原液 按1:0. 5~1:2. 5的混合。
[0055] 为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。实施例1:病毒 株的筛选及毒株的毒力的测定
[0056] 1、病毒株筛选：
[0057] 从手足口患者咽拭子中分尚出EV71阳性的病毒共15株，CA16阳性的病毒共20 株，分别进行适应Vero培养，并对其生物学特性逐一进行分析研宄，挑选出现蚀斑大并典 型、感染性滴度高、交叉保护范围广的病毒2~3株作为首轮疫苗候选株。
[0058] 对首轮疫苗候选株进行蚀斑克隆纯化，挑取多个克隆株进行全序列测定，选取与 原始毒株序列一致的建立原始种子批，进行试验性疫苗工艺研宄，最终确定人肠道71型病 毒株CC-09和柯萨奇A16型病毒株CC-16作为疫苗生产株。
[0059] 2、病毒株毒力测定
[0060] 毒力测定方法：分别选取7. 0LgCCID5(l/ml的人肠道71型病毒株CC-09、 6. 0LgCCID5Q/ml的柯萨奇A16型病毒株CC-16病毒，通过颅腔注射的方法对1日龄ICR乳 鼠（购自吉林大学基础医学院动物实验中心）进行攻毒，同时采用PBS作为对照，整个实验 过程按照动物保护和使用指导方针进行。每组攻毒10只乳鼠，10UL/只。每天观察记录乳 鼠临床症状，共观察21天。
[0061] 毒力测定结果：颅腔注射人肠道71型病毒株CC-09病毒和柯萨奇A16型病毒株 CC-16病毒3天即可发现小鼠出现精神状态不佳，行动迟缓、嗜睡等临床症状，4天个别小鼠 出现四肢瘫痪的典型手足口临床症状，随后其他小鼠也都表现出四肢瘫痪的症状，6天时开 始出现死亡，第7天小鼠无存活，而对照组小鼠无上述临床症状出现。据此判断所述人肠道 71型病毒株CC-09和柯萨奇A16型病毒株CC-16两株病毒为强毒株。
[0062] 将上述两种病毒株CC-09和CC-16进行生物保藏，其相关信息如下：
[0063] 病毒株CC-09:分类命名：肠道病毒71型，于2013年6月13日保藏在中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学 院微生物研宄所，保藏编号为CGMCCNo. 7753。
[0064] 病毒株CC-16 :分类命名：柯萨奇A16型病毒，于2013年6月13日保藏在中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国 科学院微生物研宄所，保藏编号为CGMCCNo. 7752。
[0065] 实施例2 :本发明所述二联手足口灭活疫苗的制备
[0066] (1)疫苗制备：取长满单层的转瓶培养的非洲绿猴肾细胞（Vero)，经0.25%胰蛋 白酶（含EDTA)消化，按一定细胞数接种生物反应器，培养3-5天，取EV71或CA16毒株工 作种子批毒种经适当稀释，接种生物反应器中的Vero细胞，35°C±0. 5°C培养72~120小 时，收获病毒培养液，置_20°C冷库冻融，经0. 1ym~0. 5ym孔径滤器过滤去除细胞碎片， 300KD截留分子量的超滤膜浓缩50倍，在无菌条件下加入终浓度为1 : 4000的甲醛37°C 灭活10天，将灭活后的病毒液，用〇. 〇2mol/LPB缓冲液（pH5. 0~7. 0)平衡后，采用阴离 子交换层析纯化，用〇. 〇2mol/LPBS缓冲液（pH7. 0)洗脱，收集病毒峰，为粗纯化的病毒 液；再用O.Olmol/LPBS缓冲液（pH7.0)平衡后，应用分子筛凝胶过滤的方法精制纯化，用 0.Olmol/LPBS缓冲液（pH7. 0)洗脱，收集病毒峰，为精制纯化病毒液，再经0. 2ym滤膜除 菌过滤。根据病毒抗原性滴度水平做适当稀释，使EV71、CA16病毒蛋白的终含量在5yg~ 10ug之间、按体积比1:1的比例将两种病毒液混合、吸附氢氧化铝佐剂即得。进一步检定 合格后，将半成品分装于无菌的西林瓶中或预充式注射器，制成成品疫苗。
[0067] (2)制备的二联手足口病