0mmol/L阿拉伯糖、氯霉素25yg/mL、卡那霉素 50yg/mL)，30°C培养3-4h左右，至0D_约为0. 4 ;4°C，4000Xg离心5min，收集菌体；弃上 清，加入预冷的10%甘油，洗涤菌体；重复一次；用100UL冰冷的10%甘油重悬菌体，分装 成2管，作为电转感受态。
[0034] 大肠杆菌BW25113内包含pIJ790质粒，在阿拉伯糖的诱导下，能够表达A噬菌体 的Reda和Y重组酶，可以使两端各具有39bp同源序列的线性化片段与环状质粒发生 同源重组，称为LCHR(Linear-CircleHomologousRecombination)。通过该方法可以在无 需考虑酶切位点的情况下，一步法替换掉质粒上位于两个39bp同源序列之间的序列，称为 PCR-targeting技术。
[0035] 有益效果：
[0036] 1、将同源臂长度增加至10kb以上，大大提高了发生同源重组的效率，构建得到了 新型大片段同源重组质粒，该重组质粒不但可以快速、有效的对节杆菌中的基因进行敲除， 而且不引入抗性基因，不影响后续对菌株的分子操作。
[0037] 2、遗传稳定性实验显示，同源重组敲除的菌株基因型稳定，在不含抗生素的培养 基中连续培养10代以上，并未发现菌株回复突变的现象。
[0038] 3、基因敲除菌株AR-dPDE结果显示，其cAMP合成能力分别比出发菌株CGMCC3584 提高了约120%，说明消除菌体内cAMP的分解途径，更有利于cAMP的积累。
【附图说明】
[0039]图lArthrobacterCGMCC3584 基因组DNA提取；1 :DL10000marker，2:基因组 DNA，3 :40kb片段。
[0040] 图2基因组酶切和线性化载体扩增，1 :HindIII酶切基因组DNA，2 :MP-fusion-F 和IMP-fusion-R扩增线性化载体，M:DL10000marker。
[0041] 图3-步克隆后质粒提取；1-5 :pUK-gMP重组质粒，；M :DL10000 marker。
[0042] 图4 一步克隆后质粒PCR验证；1-5 :pUK-gMP质粒PCR，6 :基因组酶切回收片段 PCR阳性对照，M:DL5000marker
[0043]图 5PCR扩增安普霉素抗性基因；1:PCRfragment，M:DL5000marker。
[0044] 图 6 质粒PCR验证；1 :pUK-dMP-AP质粒PCR，M:DL5000marker。
[0045] 图7PCR验证新型同源重组质粒，1-4 :pUK-dMP质粒PCR验证；M:DL5000marker。
[0046] 图8新型同源重组质粒图谱。
[0047] 图9重组菌连续培养十代后菌落PCR ; 1 :AR-dMP重组菌菌落PCR，2 :出发菌对照 (IMPDH) ；M：DL2000 marker〇
[0048] 图10松弛实验流程示意图。
[0049] 图11重组节杆菌AR-dMP发酵过程曲线。
[0050]图 12pARK质粒图。
【具体实施方式】
[0051] 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本 发明。
[0052] 本发明中所用的菌株节杆菌CMCC3584已经在申请号为201010191515. 6的专利中 详细公开过。
[0053] 本发明中使用的大肠杆菌Gbdir、大肠杆菌BW25113/pIJ790均可以购买得到。
[0054] 本发明中涉及的核苷酸序列及编号。
【主权项】
1. 一种肌苷酸脱氢酶基因缺陷型的节杆菌的构建方法，其特征在于，该方法包括如下 步骤： ⑴大片段获取：提取节杆菌基因组DNA，用限制性内切酶HindIII酶切该基因组DNA， 回收酶切得到的DNA片段； (2) 同源线性化载体扩增：以pARK质粒为模板，扩增得到线性化载体，所述pARK质粒 其核苷酸序列如SEQ ID NO :9 ; (3) 利用Rec-ET系统连接线性化载体与大片段：制备大肠杆菌Gbdir感受态，将步骤 (1)得到的DNA片段和步骤⑵得到的线性化载体同时转化大肠杆菌Gbdir感受态细胞，涂 布卡那霉素抗性平板，得到的阳性克隆中含有pUK-gMP重组质粒； (4) PCR-targeting替换目的基因：将pUK-gMP重组质粒转化大肠杆菌BW25113/ PIJ790感受态细胞，再将含有pUK-gMP重组质粒的大肠杆菌BW25113/pIJ790进一步制备 成感受态； 以PIJ773质粒为模板，SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示的序列为引物，扩增安普霉素 抗性基因，并回收PCR得到的片段，将该安普抗性基因片段电转化含有pUK-gMP重组质粒 的大肠杆菌BW25113/pIJ790感受态细胞，涂布含有卡那霉素和安普霉素双重抗性的平板， 得到的阳性克隆中含有impdh基因部分被安普抗性霉素抗性基因替换的pUK-gMP-AP质 粒； (5) 删除插入片段：用SpeI酶切pUK-gMP-AP质粒，去除安普抗性基因，回收大片段 后，自连环化，转化大肠杆菌DH5a感受态，得到的阳性克隆中含有pUK-dMP质粒； (6) 双交换重组子筛选：将pUK-dMP质粒电转化节杆菌，涂布含有卡那霉素抗性的平 板，对得到的阳性转化子进行松弛实验，直到筛选得到发生双交换的重组子，该发生双交换 的重组子即肌苷酸脱氢酶基因缺陷型节杆菌。
2. 根据权利要求1所述的肌苷酸脱氢酶基因缺陷型的节杆菌的构建方法，其特征在 于，步骤（6)中，所述的节杆菌的保藏号为CGMCC NO. 3584。
3. 根据权利要求1所述的肌苷酸脱氢酶基因缺陷型的节杆菌的构建方法，其特征在 于，步骤（6)中，所述的松弛实验按照如下方法进行： 将步骤(6)中阳性转化子挑至不含卡那霉素的LB液体培养基中，培养至菌液浑浊，划 线至不含卡那霉素的LB平板培养基，分出单菌落，双挑至含有卡那霉素抗性平板和不含卡 那霉素的LB平板培养基，观察转化子生长情况； 若抗性平板上生长的菌体，应当是发生单交换的转化子，保留了载体上的卡那抗性基 因，若发生双交换，则载体上的卡那抗性基因会丢失，因此只能在无抗性平板上生长； 如没有符合要求的转化子出现，则重新将不含卡那霉素的LB平板培养基上的转化子， 挑至不含抗性的LB液体培养基，进行第二轮松弛，直至筛选到在卡那霉素抗性平板上不 长，在无抗性平板上生长的节杆菌转化子。
4. 根据权利要求1~3任一所述的肌苷酸脱氢酶基因缺陷型的节杆菌的构建方法构建 得到的磷酸二酯酶缺陷型节杆菌。
5. 权利要求4所述的肌苷酸脱氢酶基因缺陷型节杆菌在制备cAMP中的应用。
6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括如下步骤： (Ia)将肌苷酸脱氢酶基因缺陷型节杆菌在固体节杆菌培养基上划线活化，再挑单菌落 于液体节杆菌培养基中，培养19~24h ; (2a)将液体节杆菌培养基中的肌苷酸脱氢酶基因缺陷型节杆菌转接到发酵培养基中， 在发酵罐中，发酵产cAMP。
7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的节杆菌培养基的组成为：葡萄糖 1~15g/L，蛋白胨1~20g/L，酵母膏5~20g/L，牛肉膏10g/L，pH 7. 2,溶剂为水； 所述的发酵培养基的组成为：葡萄糖30~60g/L，K2HP0415~25g/L，KH2PO4I~IOg/ L，MgSO4 ? 7H20 0? 1~0? 5g/L，尿素10~15g/L，CoCl20.0 1~0? 02g/L，NaF0? 1~lg/L， 生物素〇? 01~〇? 〇5g/L，次黄嘌呤5~10g/L，黄嘌呤0? 1~0? 2g/L，pH 7. 0,溶剂为水。
8. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤（2a)中，发酵过程中，发酵罐的搅拌 转速 250 ~400rpm。
9. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤（2a)中，发酵过程中，发酵罐的通气 量为5~15L/min。
【专利摘要】本发明公开了一株肌苷酸脱氢酶基因缺陷型的节杆菌，该菌株是通过构建大片段同源重组质粒，然后将该质粒转化节杆菌使其与节杆菌基因组中肌苷酸脱氢酶基因进行双交换，得到肌苷酸脱氢酶基因缺陷型的节杆菌。该大片段同源重组质粒的同源臂的长度大于10kb，提高了同源重组的效率，利用该方法进行基因敲除，不会向菌株中引入新的抗性基因。重组菌AR-dIMP最高cAMP产量为9.37g/L，比出发菌株提高了120％。
【IPC分类】C12N15-74, C12N1-21, C12P19-32, C12N15-53, C12R1-06
【公开号】CN104745616
【申请号】CN201510186254
【发明人】应汉杰, 童鹏, 牛欢青, 李楠, 郭亭, 柳冬
【申请人】南京工业大学
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2015年4月17日