br>[0055] 比对GenBank中PRV gD、gG、gE基因序列，选取PRV gD、gG、gE基因高度保守且 具有型特异性基因序列为模板，设计PRV gD、gG、gE基因特异性引物对，分别命名为PRV gD-F(Pl)、PRV gD-R(P2)、CDV-R(P2)、PRV gG-F(P3)、PRV gG-R(P4)、PRV gE-F(P5)、PRV gE-R(P6)，由宝生物工程（大连）有限公司合成，用于PRV gD/gG/gE基因三重PCR扩增的 引物序列如下：
[0056] P1 :3, -GGAGGACGAG CTGGG GCTGC-5，
[0057] P2 :3' -CCACGCCCCG CTTGA AGCTG-5'
[0058] P3 :3, -ACACCCGCAC GCGCATCGAC-5，
[0059] P4 :3, -TCTCGGCGGC GGTCACGTTC-5，
[0060] P5 :3, -GTCACCGAGG TCCCGAGTCC-5，
[0061] P6 :3, -GCGTGTAGAG GCCCGTGTCG-5，。
[0062] 1. 2. 2 总 DNA 的制备
[0063] 以灭活的PRV细胞（PK15细胞）培养物、PRV gE基因缺失疫苗毒、PRV gG基因缺 失疫苗毒为阳性对照，正常PKjffl胞为阴性对照，与含有PRV的三叉神经节或脑组织待检样 品提取总DNA，具体操作如下：分别取灭活的PRV细胞培养物、PRV gE基因缺失疫苗毒、PRV gG基因缺失疫苗毒、阴性对照及待检样品（如为组织时先加适量PBS研磨后取上清）各 100 y L于1. 5ml离心管中，加入500 y L消化液（含终浓度10mM Tris-HCl (pH 8. 0)、终浓度 25mM EDTA (pH 8. 0)、终浓度 0? 5 % SDS (w/v)、终浓度 lOOmM NaCl)和 10 y L 蛋白酶 K (终浓 度20mg/mL)混匀；置55°C水浴30min~lh，加入500 y L Tris平衡酚/氯仿/异戊醇（体 积比为25 :24 :1)混合液抽提，离心后吸取上清液加入等体积经一 20°C预冷的异丙醇沉淀 DNA，用质量百分比75%乙醇洗涤沉淀，干燥，最后加入20 y L TE缓冲液溶解沉淀，一20°C 冻存备用。
[0064] 1. 2. 3PRV标准品的制备
[0065] 将含有PRV标准株gD、gG、gE基因的阳性扩增产物分别克隆入pGEM-T Easy载体 中，筛选阳性重组质粒送宝生物工程（大连）有限公司采用17和SP6引物进行测序。测序 正确的PRV标准株gD、gG、gE基因重组阳性质粒应用分光光度计测定其00 26。和OD 28Q值及 OD26Q/OD2iJt，共重复 5 次，pGEM-T/PRV gD 和 pGEM-T/PRV gG、pGEM-T/PRV gE 质粒标准品 〇D26Q平均值分别为 6. 745、6. 537 和 6. 836, OD 28Q平均值分别为 1. 932、1. 996 和 1. 941，OD 26Q/ 〇D28(l平均值分别为1. 892、1. 8882和1. 905 ;参考质粒DNA拷贝数计算方法，计算pGEM-T/ PRV gD 和 pGEM-T/PRV gG、pGEM-T/PRV gE 质粒 DNA 溶液的浓度分别为 9. 58X 101Q拷贝 / y L、9. 42 X 101?拷贝 / y L 和 9. 65 X 10 1?拷贝 / y L，定量并稀释至 1. 0 X 10 ?~1. 0 X 10 1(1 拷 贝/ yL，一 20°C保存备用。
[0066] 1. 2. 4PRV gD/gG/gE基因三重PCR反应条件的优化
[0067] 将步骤1. 2. 3所得的pGEM-T/PRV gD、pGEM-T/PRV gG和PRV gE重组质粒分别稀 释至终浓度1. 0 X 105拷贝/ y L作为检测模板，P1/P2、P3/P4、P5/P6引物对分别稀释为终浓 度0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8和1.011111〇1/1，应用？〇?仪（德国扮〇1116^^ 公司）采用矩阵法筛选不同浓度的P1/P2、P3/P4、P5/P6引物组合，得到针对PRV gD/gG/gE 三重PCR最佳引物浓度和最佳反应条件。
[0068] 25yL 反应体系，其中：？1/?2、？3/?4、？5/?6终浓度各0.411111〇1/1，2.5臟〇1/ L dNTPs 4yL，2XGC Buffer I 12.5yL，5U/yL Ex Taq 酶 0.25yL，猪伪狂犬病毒 DNA 2yL，用去离子水补至 25yL;反应条件为：94°C 5min 后，94°C 30s，63°C 30s，72°C 30s，35 个循环；72°C lOmin。PCR扩增产物进行电泳鉴定，结果见图1。图中，M. lOObp梯度DNA分 子量标记，PI. PRV阳性对照，P2. gG基因缺失疫苗毒阳性对照，P3. gE基因缺失疫苗毒阳性 对照，N.阴性对照。
[0069] 1. 2. 5敏感性试验
[0070] 将步骤1. 2. 3所得的pGEM-T/PRV gD、pGEM-T/PRV gG和PRV gE重组质粒分别作 10倍系列稀释，两种质粒1:1比例混合，每种质粒终浓度调整为1. 0X107~1. 0X 10 °拷贝 / y L，共8个稀释度，按步骤1. 2. 4优化的PCR反应条件进行PRV gD/gG/gE三重PCR敏感 性试验。
[0071] PRV gD/gG/gE 三重 PCR 对 pGEM-T/PRV gD、pGEM-T/PRV gG 和 PRV gE 三种质粒最 低检出限为100个拷贝/ U L，出现大小为212bp、315bp和472bp的目的条带，表明所建立的 PRV gD/gG/gE三重PCR检测方法可检测最低限度为100个拷贝/ y L。（结果见图2)
[0072] 1. 2. 6特异性试验
[0073]按步骤1. 2. 2所述方法对猪瘟病毒（CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株 (LP-PRRSV)、猪日本乙型脑炎病毒（JEV)等提取RNA进行反转录，猪细小病毒（PPV)、猪链 球菌2型（SS2)等则直接提取DNA，同时设已经灭活的PRV细胞培养物、PRV gG基因缺失 疫苗毒、PRV gE基因缺失疫苗毒为阳性对照为阳性对照，正常PKjffl胞为阴性对照，按步骤 1. 2. 4优化的PCR反应条件进行PCR扩增以验证该方法的特异性。
[0074] 采用所建立的PRV gD/gG/gE三重PCR检测方法对PRV进行扩增可获得大小 为212bp、315bp和472bp的目的片段，对PRVgE基因缺失疫苗毒进行扩增可获得大小为 212bp、315bp的目的片段，对PRVgG基因缺失疫苗毒进行扩增可获得大小为212bp、472bp的 目的片段；但正常PK15细胞培养液、猪细小病毒、猪蓝耳病病毒、猪瘟病毒、猪日本乙型脑 炎病毒、猪链球菌2型均未能扩增出任何条带，验证结果见图3,图中，M. lOObp梯度DNA分 子量标记，PI. PRV阳性对照，P2. gG基因缺失疫苗毒阳性对照，P3. gE基因缺失疫苗毒阳性 对照，N?阴性对照，1. LP-PRRSV，2. CSFV，3. PPV，4. JEV，5. SS2。
[0075] 1. 2. 7稳定性和重复性试验
[0076] 分别将4个浓度的10倍系列稀释的pGEM-T/PRV gD、pGEM-T/PRV gG和PRV gE重 组等量质粒混合物（每种质粒终浓度1. 〇 X 103~1. 0 X 10 °)按照步骤1，2,4优化的PCR反 应条件进行PCR扩增，每个系列设定3个重复，以验证该方法的稳定性和重复性。
[0077] 重复性试验结果表明，浓度为107_102拷贝/yL 6个浓度的3次重复均为阳性，浓 度为1.0X101拷贝/yL和1.0X10°拷贝/yL 3次重复试验结果均为阴性。说明建立的 PRV gD/gG/gE三重PCR检测方法具有很好的稳定性和重复性。
[0078] 1.2. 8应用试验
[0079] 依据建立的 PRV gD/gG/gE 三重 PCR 和 PRV gD、PRV gG、PRVgE 单一基因 PCR 检测 方法（参照GB/T 18641-2002)，配制检测试剂，以经灭活的PRV细胞培养物、PRVgE基因缺 失疫苗毒、PRVgG基因缺失疫苗毒为阳性对照，正常PKjffl胞为阴性对照，对35份临床疑似 PRV感染样品（样品编号为：1~35进行了应用检测，检测结果见图4-7,对这两种方法的 检测结果进行比较分析。
[0080] 结果表明，采用本发明所建立的方法对35份临床怀疑样品进行三重RT-PCR扩增， 结果PRV gD/gG/gE三重阳性样品为14份，PRV gD/gG二重（gE基因缺失）阳性样品为7 份，PRV gD/gE二重（gG基因缺失）阳性样品为5份，9份样品为阴性。
[0081] 采用PRV gD PCR扩增阳性样品为26份，采用PRV gG PCR扩增阳性样品为21份， 采用PRV gE PCR扩增阳性样品为19份，表明本发明建立的PRV gD/gG/gE三重PCR方法比 与单一 PCR方法的灵敏性一样高，该PCR方法检测结果与PRV病毒分离鉴定和PRV gD、gG、 gE基因测序结果符合率为100%。
[0082] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 鉴别PRV强毒和PRVgG、PRVgE基因缺失疫苗毒的PCR引物，其特征在于，所述引 物包括： Pl:3'-GGAGGACGAGCTGGGGCTGC-5' P2 :3'-CCACGCCCCGCTTGAAGCTG-5' P3 :3'-ACACCCGCACGCGCATCGAC-5' P4 :3'-TCTCGGCGGCGGTCACGTTC-5' P5 :3'-GTCACCGAGGTCCCGAGTCC-5' P6 :3'-GCGTGTAGAGGCCCGTGTCG-5'。
2. 含有权利要求1所述引物的用于鉴别PRV强毒和PRVgG、PRVgE基因缺失疫苗毒 的试剂盒。
3. 权利要求1所述引物或权利要求2所述试剂盒在PCR鉴别PRV强毒和PRVgG、PRV gE基因缺失疫苗毒中的应用。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，包括以下步骤： 1) 提取待测样品总DNA; 2) 以提取的待测样品总DNA为模板，以PUP2、P3、P4、P5、P6为扩增引物，进行PCR扩 增反应获得扩增产物； 3) 对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，进行PCR扩增反应使用的反应体系以 25 1^计为屮1、？2、？3、？4、？5、卩6的终浓度各为0.411111〇1/1，2\6〇811打61'112.5 1^，5。/ yLExTaq酶0. 25yL，猪伪狂犬病毒DNA2yL，用去离子水补至25yL。
6. 根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，PCR扩增反应条件为：94°C5min后， 94。〇3〇8,63。〇3〇8,72。〇3〇8,35个循环；721：1〇111111。
【专利摘要】本发明提供鉴别猪伪狂犬病毒PRV强毒和PRV gG、PRV gE基因缺失疫苗毒的PCR引物，所述引物包括P1、P2、P3、P4、P5和P6，本发明基于所述引物建立的三重PCR检测可实现一个反应同时对猪伪狂犬病毒强毒和PRV gG基因缺失疫苗毒、PRV gE基因缺失疫苗毒进行快速鉴别检测，可在3h内完成检测，具有快速、特异、敏感、高通量等优点，能满足大批量、快速鉴别检测猪伪狂犬病毒强毒和PRV gG基因缺失疫苗毒、PRV gE基因缺失疫苗毒的要求。
【IPC分类】C12Q1-68, C12R1-93, C12Q1-70, C12N15-11
【公开号】CN104789699
【申请号】CN201510154094
【发明人】吴志明, 闫若潜, 赵明军, 赵雪丽, 刘梅芬, 郑岩, 刘慧 , 程果, 王东方, 刘光辉, 程俊贞, 韩楠, 项黎黎, 郭育培, 谢霞, 梁松林, 宋松林
【申请人】河南省动物疫病预防控制中心
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年4月2日