度条件下的GFP强度结果图。
【具体实施方式】
[0035] 下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术 人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明 的保护范围。
[0036] 实施例1、质粒最小化改造
[0037] 在专利CN103333908A所述质粒pSW2的基础上敲除与噬菌体复制无关的非必须基 因，如单链结合蛋白基因，敲除方法采用单酶切的方法，选中噬菌体中没有的Apa I酶切位 点进行切除。例如选定FpsB基因进行删除，在靶基因位点两侧设计引物P1、P2，引物扩增 绕环状质粒一周（除去靶基因序列），且P1、P2粘合部位含有相同酶切位点Apa I，扩增产 物回收后，通过Apa I单酶切产生互补粘性末端，再经过T4连接酶连接后转化到WM3064菌 株，通过抗生素平板以及菌落PCR验证，筛选出pSW2 Λ FpsB-WM3064阳性克隆。
[0038] 通过 pSW2 Λ FpsB_WM3064 与 Shewanella piezotolerans WP3 结合转移阳性率验 证敲除基因是否为PSW2在WP3中生存所必须基因：将构建成功的pSW2 Λ FpsB-WM3064菌 株摇床培养OXD培养基，37°C摇床），同时接种WP3 (2216培养基，20°C摇床），过夜培养；接 种pSW2 Λ FpsB-WM3064菌液20ul于LD培养基，接种WP3200ul于2216培养基，摇床培养 5h(各自培养温度不变）；按照1:1、1:2、2:1的比例混合突变株与WP3,在2216+dap的平板 上每个比例点2个IOOul的点，28°C倒置平板培养24h ;24h后用5ml 2216液体培养基冲洗 平板，并将冲洗液涂布到2216+l/2Chl抗生素平板中，每个平板200ul冲洗液，20°C倒置培 养基培养48~72h，待平板长出克隆；将平板上的克隆划线转移到新的2216+l/2Chl抗生 素平板中，20°C倒置培养基培养24h观察划线是否长出克隆；通过PCR方法验证单克隆是否 含有目的片段，若验证结果为阳性，证明FpsB基因是可敲除基因。
[0039] 实施例2、构建高效异源表达裁体及衍牛裁体
[0040] (1)启动子的克隆：启动子基因 PR1869来源于WP3的Genome (如图3所示），基因 全长398bp，以期其作为一个完整的启动序列；（2)His标签克隆：His-Tag序列来源于DNA 合成（如图3所示），以期其作为一个异源蛋白的纯化标签。
[0041] 以绿色荧光蛋白（GFP)作为报告基因，构建不同突变的GFP融合片段，用于筛选高 效异源表达载体，本发明筛选的缺失突变如表1所示，通过对不同突变质粒的对比，筛选到 了一个在低温下有较高表达能力的载体，在低温下能让GFP的表达强度到90000左右，如图 5所示。（测定条件：酶标仪，25°C，激发波长为460nm，发射波长为490nm)。
[0042] 构建缺失突变株以质粒最小化改造的结果为参照，根据可敲除片段将不同的突变 株均插入启动子序列以及GFP基因，即通过设计带有同源臂序列的引物，利用同源重组酶 将线性化的载体与启动子及GFP序列无缝连接，将构建好的衍生载体导入WM3064中验证， 最后经过接合转移导入深海细菌希瓦氏菌WP3,筛选阳性克隆分别接种于20°C和4°C摇床 培养，待菌株生长至平台期检测其荧光吸收强度，经过GFP的表达对比后确定高效异源表 达载体的序列。PSW4质粒的序列如表2所示。
[0043] 表lpSW2突变质粒构建的引物序列
【主权项】
1. 一种以菌体为基础的穿梭质粒pSW4,其特征在于，所述穿梭质粒pSW4的碱基序列 如 SEQ ID NO. 1 所示。
2. -种根据权利要求1所述的以噬菌体为基础的穿梭质粒pSW4的构建方法，其特征在 于，所述构建方法包括以下步骤： 步骤一，敲除质粒pSW2上FpsB序列； 步骤二，启动子PR1869及RBS序列的克隆； 步骤三，His-Tag的克隆； 步骤四，连接报告基因GFP筛选高效表达株。
3. 根据权利要求2所述的穿梭质粒pSW4的构建方法，其特征在于，步骤一中，所述 FpsB序列预测为单链结合蛋白。
4. 根据权利要求2所述的穿梭质粒pSW4的构建方法，其特征在于，步骤二中，所述启动 子PR1869来源于WP3的冷激蛋白。
5. 根据权利要求2所述的穿梭质粒pSW4的构建方法，其特征在于，步骤三中，所述 His-Tag来源于序列合成。
6. 根据权利要求2所述的穿梭质粒pSW4的构建方法，其特征在于，步骤四中，所述GFP 为绿色荧光蛋白。
7. -种根据权利要求1所述的以噬菌体为基础的穿梭质粒pSW4的衍生质粒的构建方 法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤： 步骤一，在穿梭质粒PSW2的多克隆位点引入GFP作为报告基因； 步骤二，质粒扩增验证并转化于感受态WM3064菌株，菌落PCR扩增验证； 步骤三，以深海细菌希瓦氏菌WP3作为低温蛋白表达宿主，将突变型WM3064-pSW3-GFP 与希瓦氏菌WP3接合转移； 步骤四，用酶标仪分别测定20°C与4°C下GFP的表达强度，筛选高效表达株。
8. -种根据权利要求1所述的以噬菌体为基础的穿梭质粒pSW4在利用外源基因表达 低温蛋白中的应用。
9. 一种根据权利要求1所述的以噬菌体为基础的穿梭质粒pSW4在希瓦氏菌中基因回 补的应用。
【专利摘要】本公开了一种低温诱导高效异源表达载体pSW4及其制备方法和应用，所述pSW4来源于专利CN103333908A中对穿梭载体pSW2的改造，所述低温表达载体的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，所述制备方法包括以下步骤：敲除质粒pSW2上FpsB序列，启动子PR1869及RBS序列的克隆，His-Tag的克隆，连接报告基因GFP筛选高效表达株。本发明提供的低温高效表达载体既能够在不同的希瓦氏菌中复制及表达，同时在模式细菌大肠杆菌中也能有效利用。
【IPC分类】C12N15-67, C12N15-70, C12N15-65, C12N15-74
【公开号】CN104878038
【申请号】CN201510288205
【发明人】王风平, 程瑞雪, 许冠鹏, 蹇华哗
【申请人】上海交通大学
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2015年5月29日