补料培养基Feed B(Gibco公司，货号 A10240-01)。同时，每天取样NOVA检测葡萄糖浓度，若低于2g/L时，补加葡萄糖至5g/L (表 3)。流加培养至第7天时，将反应器温度从37°C调到30°C，继续培养至第14天，收获细胞 培养液，离心取上清液。
[0079] 5、检测分析
[0080] ⑴细胞密度及活率测定
[0081] 用磷酸缓冲液（PBS)将样品细胞浓度稀释至合适的范围，使用0. 4%台盼蓝进行 活细胞染色，吹打均匀后，用血球计数板计算细胞数，并测定细胞活率，计数三次，取平均 值。优化培养基与对照培养基中CH0-BF02细胞密度和活率如图1所示。优化培养基所培 养的CH0-BF02细胞密度高于对照培养基所培养的细胞密度，其中2mM Glu组细胞密度较对 照组的提高了 10. 10%，5mM Glu组较对照组提高了 14. 25%。
[0082] (2)代谢副产物铵离子浓度测定
[0083] 氨浓度采用Berthelot尿素氮试剂盒（上海科欣生物技术研宄所）测定，不使用 脲酶，改用5mmol/L的NH 4Cl作为铵离子标准液，具体操作按说明书进行。优化培养基与 对照培养基中代谢副产物铵离子浓度如图2所示。优化培养基培养的CH0-BF02细胞过程 中所产生的NH 4+浓度显著低于对照培养基的，其中2mM Glu组NH4+浓度较对照组的降低了 20. 82%，5mM Glu组NH4+浓度较对照组的降低了 35. 91 %。
[0084] 表3重组CHO工程细胞流加培养工艺
[0085]
[0086] 实施例3.重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体（rhTNFRII-Fc)融合蛋白的制备
[0087] UrhTNFRII-Fc融合蛋白的分离纯化：
[0088] 通过Millipore公司的DOHC和BlHC深层滤器按顺序过滤实施例2中所得到的细 胞培养液，收集滤过液后用Protein A亲和层析法进行纯化。
[0089] 将MabselectSuRe (GE公司）层析柱以PBS缓冲液冲洗平衡后，以50~300cm/h 的速度将细胞培养液上清上样，用PBS缓冲液冲洗直至未结合的蛋白全被洗脱（以A280进 行监测），然后用20mmol/L柠檬酸（pH3.5)洗脱融合蛋白，融合蛋白原液收集后用Tris调 节pH值至7. 2。
[0090] 2、检测分析
[0091] (l)rhTNFRII-Fc融合蛋白中唾液酸含量的测定
[0092] 按照2010版《中华人民共和国药典》，采用间苯二酚显色法测定rhTNFRII-Fc融合 蛋白中唾液酸的含量，并以每mg rhTNFRII-Fc融合蛋白含有多少μ g唾液酸来表征。优化 培养基和对照培养基生产的rhTNFRII-Fc融合蛋白中唾液酸的含量如图3所示。优化培养 基所生产的rhTNFRII-Fc融合蛋白中唾液酸的含量显著高于对照培养基的，其中2mM Glu 组唾液酸的含量较对照组的提高了 38. 18%，5mM Glu组唾液酸的含量较对照组的提高了 47. 27%。
[0093] (2)rhTNFRII-Fc融合蛋白受体结合力检测0· 05mol/L碳酸钠缓冲液（ρΗ9· 6)作 为包被液将羊抗人IgG(Fc)抗体（KPL公司，货号为01-10-20)稀释到浓度为5 μ g/ml，以 100 μ 1/孔加入到酶标板中，2 ~8°C过夜。含 0.05% Tween 20 的(λ 01mol/L PBS(PBST) 溶液作为洗涤液洗板。含3%牛血清白蛋白（BSA)的PBST溶液作为封闭液，以300 μ 1/孔 加入酶标板中，37°C 2h，洗涤液洗板。将rhTNFRII-Fc融合蛋白用封闭液稀释到2 μ g/ml， 连续3倍稀释，共稀释11个浓度。将各稀释度rhTNFRII-Fc融合蛋白以100 μ 1/孔加入酶 标板，37°C 2h，洗涤液洗板。用封闭液将生物素标记的人TNF-α (GIBC0公司）稀释后，以 100 μ 1/孔加入酶标板，37°C 2h，洗涤液洗板。以100 μ 1/孔加入封闭液稀释的辣根过氧 化物酶标记的链霉亲和素（Str印tavidin-HRP，R&D公司，货号为DY998)，37°C lh，洗涤液 洗板。每孔加入100 μ 1 3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺（TMB)底物，显色10~15min。每孔加 入50yl2mol/L硫酸终止显色。以450nm为检测波长于酶标仪检测OD值。优化培养基和 对照培养基生产的rhTNFRII-Fc融合蛋白的受体结合力如图4所示。优化培养基所生产的 rhTNFRII-Fc融合蛋白EC50值低于对照培养基的，受体结合力优于对照培养基的，其中2mM Glu 组 EC50 值为 9. 08ng/mL，5mM Glu 组 EC50 值为 L 4ng/mL，对照组 EC50 值为 9. 74ng/mL。
[0094] 实施例4.表达抗⑶20单克隆抗体的重组CHO工程细胞培养
[0095] 1、抗⑶20单克隆抗体表达载体的构建：
[0096] 采用PCR技术和DNA重组技术将pSV2-dhfr载体（ATCC产品）中的dhfr (二氢 叶酸还原酶）表达单元克隆到P⑶NA3. 1(+)载体（Invitrogen公司产品）中，构建可表达 DHFR的哺乳动物细胞表达载体pBR)l。
[0097] 根据文献报道（US Patent, US6399061)，采用化学合成技术合成重组抗CD20单克 隆抗体的轻链和重链基因片段；采用DNA重组技术将合成的基因片段分别克隆到pBFOl载 体中，分别构建可表达抗⑶20单克隆抗体的轻链和重链多肽的重组表达载体pBR)l-⑶20L 和 PBF01-CD20H。
[0098] 2、表达抗⑶20单克隆抗体的重组CHO工程细胞的构建：
[0099] 采用脂质体转染法，将构建的重组表达载体pBR)l-CD20L和pBR)l-CD20H共转染 Invitrogen公司的CH0-DG44细胞，然后经G418抗性筛选阳性克隆，然后再通过ELISA法筛 选高表达抗体的克隆，然后再用MTX逐步加压、筛选、克隆，最终获得一株高表达抗CD20单 克隆抗体的CHO细胞株CH0-CD20。
[0100] 3、CHO-⑶20种子细胞培养
[0101] 同实施例2
[0102] 4、细胞流加培养
[0103] 将步骤3中的CHO-⑶20细胞驯化完全适用于无血清悬浮培养，当细胞密度达到 约2X 106cells/ml，种子液体积扩增至500ml时，以接种初始密度为3X 105cells/ml，将细 胞转移到7. 5L生物反应器中放大培养，并添加实施例1中配制的CDM4CH0无血清培养基 (Hyclone，SH30556)(如表1和表2中所示，C :优化培养基，D :对照培养基）或SFM4CH0无 血清培养基（Hyclone，SH30518)(如表1和表2中所示，E :优化培养基，D :对照培养基），培 养体积为3L，培养条件是37 °C，溶氧50%，pH7. 0,此后的培养过程中不再补充额外的谷氨 酰胺。流加培养的第4天、第7天和第10天按照5% (V:V)添加补料培养基Feed A(Gibco 公司，货号A10234-01);第5天和第8天添加6g/L补料培养基Feed B(Gibco公司，货号 A10240-01)。同时，每天取样NOVA检测葡萄糖浓度，若低于2g/L时，补加葡萄糖至5g/L (表 3)。培养至第14天，收获细胞培养液，离心取上清液。
[0104] 5、检测分析
[0105] (1)细胞密度及活率测定
[0106] 同实施例2。CDM4CH0优化培养基与对照培养基中CHO-⑶20细胞密度和活性如图 5所示，CDM4CH0优化培养基所培养的CH0-CD20细胞密度高于对照培养基所培养的细胞密 度，其中2mM Glu组细胞密度较对照组的提高了 9.39%，5mM Glu组细胞密度较对照组的提 高了 15. 47%。；SFM4CH0优化培养基与对照培养基中CHO-⑶20细胞密度和活性如图6所 示，SFM4CH0优化培养基所培养的CH0-CD20细胞密度高于对照培养基所培养的细胞密度， 其中2mM Glu组细胞密度较对照组的提高了 10%，5mM Glu组细胞密度较对照组的提高了 20.56 %〇
[0107] (2)代谢副产物铵离子浓度测定
[0108] 同实施例2。CDM4CH0优化培养基与对照培养基中代谢副产物铵离子浓度如图7 所示，CDM4CH0优化培养基培养的CH0-CD20细胞过程中所产生的NH 4+浓度显著低于对照培 养基的，其中2mM Glu组NH4+浓度较对照组的降低了 2