一种基于EGFP的GADD45β RNA干扰报告载体构建及应用
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及一种基于EGFP的GADD45 β RNA干扰报告载体的构建、构建方法及应 用，特别是在膀胱癌细胞及哺乳动物细胞中快速筛选GADD45 β特异性siRNA，用于基因功 能研宄。
【背景技术】：
[0002] GADD45 β在细胞周期、DNA损伤修复及信号转导过程中发挥着重要作用。近年来 发现，GADD45 0与肿瘤的发生、发展和转化存在密切的关系，并在肿瘤细胞凋亡中起积极的 作用。研宄GADD45 0在肿瘤发生发展中的作用时，需要将GADD45 0基因进行沉默，以研宄 该基因不表达或者低表达量时，肿瘤细胞的变化情况，从而明确基因功能。
[0003] 常规的基因沉默方法为针对靶标基因设计多个SiRNA，但是不同位点的SiRNA效 率存在差异，因此需要通过筛选获得沉默效率高的siRNA用于基因功能研宄实验。在实验 室条件下，常采用将SiRNA转染受试细胞后，提取总RNA反转录成cDNA，通过qPCR检测靶标 基因的表达量来确定siRNA的沉默效率。这种方法要求的受试细胞数量多、siRNA用量大、 RNA提取、反转录及qPCR操作费时费力，使得整个实验进程繁琐冗余。
[0004] 增强型绿色荧光蛋白EGFP是常用的报告基因，可通过荧光显微镜观察绿色荧光 的亮度间接表示靶标基因的表达量或者沉默效率。本发明提供一种基于GFP的GADD45 β RNA干扰报告载体的构建技术及应用。首先将pcDNA3. l-GADD45f3中的GADD45 0开放阅读 框插入至pEGFP-ΝΙ载体骨架中，构建报告载体P-GADD45 β -EGFP-N1，该载体中GADD45 β阅 读框与EGFP融合表达。将GADD45 β siRNA与该载体共转染膀胱癌细胞系Τ24时，siRNA起 作用时将载体上的GADD45 β基因沉默，进而影响EGFP的转录和翻译，导致EGFP表达降低， 则可通过检测荧光亮度来判别siRNA对靶标基因的沉默效率，在荧光显微镜下观察绿色荧 光蛋白，其含有绿色荧光的细胞数量少且亮度低的组合，表示为对应的siRNA效率高。通过 将该载体与GADD45 β siRNA共转染Τ24细胞发现，GADD45 β siRNA360和siRNA638的沉 默效率较好。与qPCR检测效果比对时，发现与以绿色荧光蛋白显示的结果一致。因此，该 P-GADD45 β -EGFP-Nl可作为在膀胱癌细胞T24中筛选和检测GADD45 β siRNA的报告载体， 通过此方法筛选得到的siRNA与qPCR方法筛选得到的siRNA效果一致。该方法同样适用在 哺乳动物细胞水平筛选和验证GADD45 β siRNA的效率。本发明建立的基于EGFP的RNA干 扰报告载体构建及快速筛选siRNA的方法，不仅为后续靶标基因功能研宄提供干扰效率高 的siRNA，也为同类靶标基因的siRNA片段的筛选提供新的技术手段。
【发明内容】
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[0005] 本发明的目的在于提供一种基于EGFP的GADD45 β RNA干扰报告载体。
[0006] 本发明提供的一种GADD45 β -EGFP融合基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO : 1。
[0007] 本发明提供的一种干扰报告载体P-GADD45 β -EGFP-N1，其含有GADD45 β -EGFP融 合基因。
[0008] 本发明提供的一种干扰报告载体P-GADD45 β -EGFP-Nl的构建方法，包括如下步 骤：将pcDNA3. 1-GADD45 β中的GADD45 β开放阅读框插入至pEGFP-Nl载体骨架中，构建干 扰报告载体P-GADD45 β -EGFP-N1，该载体中GADD45 β阅读框与EGFP融合表达。
[0009] 本发明干扰报告载体P-GADD45 β -EGFP-Nl可以在膀胱癌细胞中筛选高效 GADD45 β特异性siRNA中应用。将GADD45 β siRNA与该载体共转染膀胱癌细胞系Τ24时， siRNA起作用时将载体上的GADD45 β基因沉默，进而影响EGFP的转录和翻译，导致EGFP 表达降低，则可通过检测荧光亮度来判别siRNA对靶标基因的沉默效率。通过将该载体与 GADD45 β siRNA共转染Τ24细胞发现，GADD45 β siRNA360和siRNA638的沉默效率较好。 与qPCR检测效果比对时，发现与以绿色荧光蛋白显示的结果一致。
[0010] 干扰报告载体P-GADD45 β -EGFP-Nl也可在哺乳动物细胞中筛选高效GADD45 β特 异性siRNA中应用。
[0011] 本发明建立的基于EGFP的RNA干扰报告载体构建及快速筛选siRNA的方法，不仅 为后续靶标基因功能研宄提供干扰效率高的siRNA，也为在其他哺乳动物细胞中研宄该基 因功能提供新的技术和手段。
【附图说明】：
[0012] 图 I :pEGFP-Nl 和 pcDNA3. 1-GADD450 载体酶切电泳图：M 为 Marker ;1 为 pcDNA3. 1-GADD45 β 双酶切；2 为 pEGFP-Nl 双酶切
[0013] 图 2 :p-GADD45 β -EGFP-Nl 载体图谱
[0014] 图 3 :Hind III和 BamHI 酶切鉴定 p-GADD45 β -EGFP-Nl 电泳图：Μ 为 Marker ; 1-5 为 不同的单克隆
[0015] 图4 :荧光显微镜下观察P-GADD45 β -EGFP-Nl对GADD45 β -siRNA干扰效率的指 示作用
[0016] 图5:qPCR检测GADD45 β表达量以验证报告载体的指示作用
【具体实施方式】：
[0017] 实施例1 :p-GADD45 β -EGFP-Nl构建及其在膀胱癌细胞筛选siRNA的应用
[0018] 一、重组报告载体P-GADD45 β -EGFP-Nl的构建
[0019] 1、目的片段及载体骨架制备
[0020] 取本实验室已有载体pcDNA3. 1-GADD45 0，采用Hind III和BamHI进行双酶切， 同时用Hind III和BamHI酶切骨架载体pEGFP-Nl，反应体系参照Hind III、BamHI说明书 (NEB)进行，见表1。
[0021] 表1片段及骨架载体的双酶切体系
[0022]
[0023] 2、胶回收酶切产物
[0024] 将上述双酶切产物进行胶回收，回收过程严格按照OMEGA公司的Gel Extraction Kit的说明书进行。其中pcDNA3. 1-GADD45 0回收片段为500bp左右，pEGFP-Nl骨架约为 5000bp (见图 1)。
[0025] 3、目的片段GADD45 β与pEGFP-Nl的连接
[0026] 将含目的片段GADD45 β的胶回收产物连接到pEGFP-Nl上，在离心管中建立如下 反应体系表2。
[0027] 表2片段及骨架载体的连接体系
[0028]
[0029] 轻轻混匀，瞬时离心收集液体于管底，置于16°C过夜连接。
[0030] 二、重组报告载体的转化
[0031] 1、将 Trans-Tl Phage Resistant 感受态细胞置于冰上；
[0032] 2、在离心管中依次加入50 yL感受态细胞核5 yL的连接产物，轻轻混匀，置于冰 上 30min ;
[0033] 3、42°C水浴热激30s，然后快速将管置于冰上，冰浴2min ;
[0034] 4、加入500 μ L不含抗生素的LB液体培养基，混匀后置于37°C 200rpm振荡培养 Ih ；
[0035] 5、取200 μ L重悬菌液，均匀涂布于提前放置在37°C培养箱中kan抗性的平板上， 过夜培养；
[0036] 三、报告载体P-GADD45 β -EGFP-Nl的验证
[0037] 1、用灭菌的枪头小心挑取白色单菌落，将枪头置于ImL LB液体培养基（含有 0· 1% Kan)中，在37°C、200rpm的振荡培养箱中培养12-16h。
[0038] 2、采用离心法收集菌液，采用Omega公司质粒提取试剂盒提取对应的质粒，质粒 图谱见图2。操作严格按照说明书进行。
[0039] 3.用Hind III和BamHI对所提取质粒进行酶切，酶切体系和程序按照NEB说明书 进行，见表3。反应条件为37°C，2h。之后，用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测目的片段（见图 3)，将检测到目的片段的对应质粒送往北京奥科生物公司进行测序。
[0040] 表3报告载体检测的双酶切体系
[0041]
[0042] 四、GADD45 siRNA 的合成
[0043] 以human GADD45 β cDNA为参照，由GenePharma公司设计siRNA片段，并进行合 成，具体序列如表4。
[0044] 表 4 GADD45 siRNA 序列
[0045]
[0046] 五、报告载体P-GADD45 β -EGFP-Nl与siRNA共转染T24细胞
[0047] 取对数生长期的Τ24细胞，重悬于不含抗生素的RPMI1640培养基中，接种于6孔 板中。实验分为 5 组：p-GADD45 β -EGFP-Nl、p-GADD45 β -EGFP-Nl+NCsiRNA、p-GADD45 β -E GFP-N1+GADD45 β -siRNA-638、p-GADD45 β -EGFP-N1+GADD45 β -siRNA-360 和 p-GADD45 β -E GFP-N1+GADD45 β -siRNA-477。每组 3 个重复。采用 GenePharma 公司的 siRNA-Mate 试剂将 上述载体组合共转染到T24细胞，具体操作参照说明书。
[0048] 六、绿色荧光蛋白强度观察
[0049] 转染T24细胞48h后，利用显微镜（OLYMPUS 1X71)观察绿色荧光蛋白的发光强 度，从而预测和筛选siRNA对靶标基因的干扰效率（见图4)。
[0050] 七、qPCR检测和验证siRNA对GADD45 β的干扰效率
[0051] 将报告载体P-GADD45 β -EGFP-Nl与siRNA共转染Τ24细胞48h后，Trizol法提取 总RNA，步骤按照RNAiso Plus (TaKaRa)说明书进行。反转录后qPCR检测GADD45 β mRNA 表达水平，从而检测siRNA的干扰效率，并对报告载体p-GADD45 β -EGFP-Nl的准确性进行 验证（见图5)。
【主权项】
1. 一种GADD45 0-EGFP融合基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO :1。2. -种干扰报告载体P-GADD45 0 -EGFP-N1，含有如权利要求1所述的GADD45 0 -EGFP 融合基因。3. 如权利要求2所述的一种干扰报告载体p-GADD45f3 -EGFP-Nl的构建方法，包括如下 步骤：将pcDNA3. 1-GADD45 0中的GADD45 0开放阅读框插入至pEGFP-Nl载体骨架中，构建 干扰报告载体P-GADD45 0 -EGFP-N1，该载体中GADD45 0阅读框与EGFP融合表达。4. 如权利要求2所述的干扰报告载体p-GADD45 0 -EGFP-Nl在膀胱癌细胞中筛选高效 GADD45 0特异性siRNA中的应用。5. 如权利要求2所述的干扰报告载体p-GADD45 0 -EGFP-Nl在哺乳动物细胞中筛选高 效GADD45 0特异性siRNA中的应用。
【专利摘要】本发明构建了一种基于EGFP的GADD45βRNA干扰报告载体及快速筛选siRNA的方法，可用于在细胞水平和活体水平的基因功能研究。本发明通过将GADD45β开放阅读框插入至pEGFP-N1载体中，构建基于EGFP的GADD45βRNA干扰报告载体p-GADD45β-EGFP-N1，GADD45β与EGFP在该载体中融合表达；将该载体分别与合成的GADD45βsiRNA共转染膀胱癌细胞系T24，发现GADD45βsiRNA360和siRNA638的干扰效果最好，比常规的qPCR方法省时省力。该方法可用于在膀胱癌细胞及哺乳动物细胞中快速筛选siRNA，用于基因功能研究。
【IPC分类】C12N15/62, C12N15/113, C12N5/10, C12N15/85
【公开号】CN104894164
【申请号】CN201510259479
【发明人】张婷婷, 张建珍, 任璐, 何佼, 马恩波, 郑耀武, 任连生
【申请人】山西大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月20日