鉴别4种犬科动物源性成分的引物探针组合物、试剂盒及多重实时荧光pcr检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种鉴别饲料和食品中4种犬科动物源性成分的引物探针组合物及 其试剂盒，还涉及采用多重实时荧光PCR检测方法检测这4种犬科动物源性成分的方法，属 于分子生物学技术领域。
【背景技术】
[0002] 饲料和食品安全隐患问题与动物生产、环境污染、和人类健康密切相关，已成为全 球性关注的热点问题。2014年，据农业部统计数据，在我国北方河北、山东等地，狐狸、水貂 和貉子的年饲养量大约为10000万只。这些动物毛皮由于其保暖性好被用作名贵衣服的布 料，但是这些动物的肉类去向不明。据报道这些肉被不法商贩大量低价收购，掺假到价格 较高的肉里，最有可能掺入到羊肉、狗肉和驴肉中，经加工制成肉卷、肉串、香肠等流通到市 场，另外内脏骨头等下脚料可能掺入到动物饲料原料肉骨粉中。狐狸、貉子、水貂作为皮毛 经济动物，养殖过程中有时需要添加激素类饲料，并且要定期注射一些抗生素药品，因此体 内常残留超标的激素和抗生素，故这些皮毛动物不能作为人类常用肉类供人食用。这种假 冒制品因为激素抗生素超标不仅危害人类健康，也严重损害了消费者的利益。此外，为防止 疯牛病、痒病的传播，包括我国在内的欧盟、美国等很多国家先后颁布多个法规，规定禁止 在反刍动物饲料中添加以哺乳类动物为原料的动物性饲料产品，以有效防止哺乳动物的病 原体从动物传染到别的动物和人类。
[0003] 在食品和饲料的生产中，各种原料被加工成食品和饲料成品后，食品和饲料的真 实属性与标签是否相符一致，已无法从外观对其组成源性进行鉴别，鉴于此尽快建立可靠 有效的狐狸、水貂、貉子和狗4种犬科动物源性成分检测方法，对于确保食品和饲料标签真 实准确，加强食品和饲料标识管理，改善食品和饲料原料安全，保护人类健康具有重要意 义。
[0004] 目前，饲料和食品中动物源性成分鉴别的主要方法有物理、化学、免疫学和分子生 物学方法，其中尤以分子生物学方法最为快速、准确、稳定、高效、灵敏，常采用DNA分子水 平的检测方法。DNA水平检测方法与蛋白质水平的检测方法相比，目标DNA比较稳定，不易 受到外界环境及加工工艺的影响，而蛋白质在高温加工后构象会改变，不稳定，每个物种不 一致，鉴别起来困难，而且DNA提取简单，易操作。当前，基于DNA的检测方法中，实时荧光 PCR法以其操作简便、灵敏、特异、快速、重复性好、定量准确、闭管反应等优点，得到研宄者 的普遍认可，成为检测的重要工具。
[0005] 鉴于线粒体基因组（mtDNA)结构比较简单、稳定、分子量小，每个细胞中有 1000-10000个拷贝，容易从组织中分离提取。现在很多学者研宄了 mtDNA在动物种属鉴定 中的应用，与核DNA分子标记相比，mtDNA具有灵敏度高、精确度好、快速、降解小（加工过 程中mtDNA保持较完整）、稳定容易操作等优势。16SrRNA基因是线粒体基因组中研宄较多 的基因，为生物所共有，功能相同，既含有保守序列，又含有可变序列其序列变化与进化距 离相适应，常用来做物种源性鉴定。基于动物mtDNA的分子标记技术的上述特点，加之多重 实时荧光PCR的快速、灵敏、高通量等特点，在动物源性成分鉴别检测中具有广泛的应用前 景。
[0006] 此外，目前对饲料和食品中动物源性的荧光定量PCR检测研宄均缺乏阳性扩增内 标（IAC)对反应体系进行监控，无法避免由反应抑制因素而造成假阴性结果的产生，导致 检测结果不准确。当前，在国际上，添加有外源扩增内标的饲料和食品中动物源性多重荧光 定量PCR检测方法还是空白。因此，建立有外源扩增内标的，针对饲料和食品中狐狸、水貂、 貉子和狗源性的多重荧光定量PCR检测方法将对饲料安全和食品安全的快速监管具有重 要的创新实践意义。
【发明内容】
[0007] 针对现有技术中存在的不足，本发明提供了一种鉴别狐狸、水貂、貉子和狗4种动 物源性成分的组合物，该组合物含有灵敏度高、特异性好的引物和探针，能快速鉴别狐狸、 水貂、貉子和狗4种动物源性成分。 本发明还提供了含有上述组合物的PCR检测试剂盒，该试剂盒操作方便，不易污染，准 确稳定。 本发明还提供了一种多重实时荧光PCR检测方法，该方法快速方便，能快速鉴别狐狸、 水貂、貉子和狗4种动物源性成分，且能有效指示假阴性出现，灵敏准确。 为实现上述目的，本发明可以通过以下技术方案来实现：
[0008] 本发明应用实时焚光定量PCR技术及焚光探针核酸DNA分子标记技术，米用多重 多色荧光PCR检测体系，实现了狐狸、水貂、貉子和狗4种动物源性成份的定性检测。引物 和探针是实现本发明的关键。本发明根据狐狸、水貂、貉子和狗的线粒体16S rRNA基因序 列，应用同源分析工具Mega5. 0软件进行同源性比对，利用引物设计软件Primer 5. 0根据 筛选出的核心片段两端相似序列设计一对同时适合狐狸、水貂、貉子和狗的通用引物，使用 Primer3. 0根据可变区序列设计狐狸、水紹、絡子和狗的4种TaqMan特异探针。使用本发明 通用引物和TaqMan特异探针，仅一管PCR反应即可同时检测狐狸、水貂、貉子和狗4种动物 源性成份。
[0009] 本发明设计的同时适合狐狸、水貂、貉子和狗的通用引物如下： 上游引物：5'CTTCCCGTGAAGAGGCGGGAATAC 3' 下游引物：5'TCCGAGGTCACCCCAACCTAAA 3'。 本发明设计的狐狸TaqMan特异探针（简称狐狸特异探针，下同）为： 5, TTAGCCCAAACCCATGAAATCCAAACCCCT 3,。 本发明设计的水貂TaqMan特异探针（简称水貂特异探针，下同）为： 5' CCCATAATAATTTATAAACTCACCTACCAGGTCTAA 3'。 本发明设计的貉子TaqMan特异探针（简称貉子特异探针，下同）为： 5' CTTTAATTACTTAACCCAAATTTATGGCCAA 3'。 本发明设计的狗TaqMan特异探针（简称狗特异探针，下同）为： 5' CTAACCCAAACTTATGGATACTAGATACCTACA 3'。
[0010] 在PCR检测时，因为多种因素容易出现PCR反应假阴性的现象，为了有效指示假阴 性，本发明还设计构建阳性扩增内标（简称内标，下同）及其相应的内标TaqMan探针（简 称内标探针，下同），提尚检测的准确性。内标的DNA序列如SEQ ID NO :7所不，为：CTTCC CGTGAAGAGGCGGGAATACAGCACGCCGTAAGCTTAACCTGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTCCATTGGTGACCTCA TTTTTTAGGTTGGGGTGACCTCGGA，共107bp。其构建方法为：使用DNA随机生成软件产生一段 DNA序列，在NCBI中BLAST无与之同源的DNA片段，在这段随机DNA序列上下游分别连接上 狐狸、水貂、貉子和狗4种犬科动物源性的通用引物序列，从而形成107bp的阳性扩增内标 DNA序列。在PCR体系使用时，内标以重组质粒的形式加入PCR体系中，重组质粒为内标的 DNA序列插入质粒PMD18-T中形成，也可称之为含有内标DNA的重组质粒，该重组质粒构建 方法为：将阳性扩增内标序列委托人工基因合成，合成片段连接到PMD18-T载体上，转化感 受态DH5a，质粒提取，经DNA测序验证与目的片段一致，即为内标DNA重组质粒。 上述内标 TaqMan 探针为：5'AAGTACGCTCCATTGGTGACCTCATTTC 3'。
[0011] 本发明还提供了一种鉴别狐狸、水貂、貉子和狗4种动物源性成分的组合物，该组 合物包括上述一对通用引物和上述狐狸、水貂、貉子和狗4种TaqMan特异探针。
[0012] 进一步的，该组合物还包括上述内标和内标TaqMan探针。其中，所述内标以重组 质粒的形式存在，所述重组质粒为上述将内标的DNA序列插入质粒PMD18-T中形成的含有 内标DNA的重组质粒。
[0013] 本发明中，所述狐狸、水紹、絡子和狗4种TaqMan特异探针和内标TaqMan探针的 5 '端均修饰有报告基团，3 '端均修饰有淬灭基团。所述报告基团可以为FAM、JOE、CY3、CY5、 ROX等，所述淬灭基团可以为TAMRA、BHQ等。
[0014] 本发明还提供了一种鉴别狐狸、水紹、貉子和狗4种动物源性成分的PCR检测试剂 盒，该试剂盒中包括：a. -对上述通用引物；b.狐狸、水紹、絡子和狗4种TaqMan特异探针； c.含有内标的重组质粒；d.内标TaqMan探针。所述含有内标的重组质粒为内标DNA序列 与质粒PMD18-T重组得到的重组质粒。 进一步的，本发明试剂盒中还可以包括2XPremix、Taq酶和双蒸水。
[0015] 上述试剂盒中，各成分的用量可以参照现有技术中通用的用量规则来加入，例如 各引物加入量相同，各探针加入量也相同。
[0016] 本发明还提供了一种鉴别狐狸、水貂、貉子和狗4种动物源性的多重实时荧光PCR 检测方法，该方法包括使用本发明鉴别驴、马、狐狸动物源性的PCR检测试剂盒，鉴别待检 样本中是否含有狐狸、水貂、貉子和狗4种动物源性成分的步骤。
[0017] 上述多重实时荧光定量PCR检测方法中，使用本发明试剂盒能够同