x Large Scale RNA Product1n System试剂盒进行体外转录，转录产物经无RNase的Dnase消化后除去其中的DNA，然后用RNeasy Kit进行纯化，制备出所需的cRNA。用核酸蛋白分析仪测定cRNA浓度，计算拷贝数。
[0023]将扩增得到的EEEV基因特异性保守片段克隆至pMD20T载体中，利用体外转录试剂盒制备出所需的cRNA作为阳性模板，对其进行RT-PCR鉴定，得到128 bp的片段(图1)。经序列测定，扩增得到的特异性保守序列与GenBank中登陆序列同源性达到100%。
[0024]cRNA的RT-PCR鉴定结果如图1所示。
[0025](二)TaqMan MGB荧光定量RT-PCR反应体系和反应条件
取荧光 RT-PCR 反应液 15 μ L，M-MLV (200U/ μ L) 0.5 μ L，RNA 酶抑制剂(40U/ μ L)
0.5 μ L, TaqDNA 聚合酶(5U/μ L) 0.5 μ L，样本 RNA 5 μ L，DEPC 水 3.5 μ L，加入 PCR 管中，共计25 μ L。
[0026]盖紧管盖，充分混匀后于8000rpm瞬时离心。将PCR管放入荧光定量PCR仪内，记录样品顺序。试验反应条件为:42°C 30min，94°C 2min ；94°C 15s，60°C 30s，45个循环；每个循环在60°C 30s时收集焚光信号。
[0027](三)标准曲线的建立
用10倍系列稀释法处理PMD20T-EEE cRNA标准品。取7个浓度梯度(106、105、104、103、12UO1UOci拷贝)cRNA标准品作为模板，以优化好的反应体系和反应参数进行荧光RT-PCR反应。根据荧光实时RT-PCR的动力学曲线，检测仪系统自动生成标准曲线以及回归方程。
[0028]具体的标准曲线如图2所示。
[0029]利用试剂盒纯化pMD20T-EEE cRNA标准品，测定其OD值，通过公式计算得到其浓度为 3.3 X 101° copies/ μ L。稀释 cRNA 至 1.0 X 101° copies/ μ L 作为母液备用。
[0030]标准曲线:把含有L OX 101° copies/ μ L的cRNA母液10倍比稀释，分别以I?
1.0X 16 copies/ μ L稀释度的cRNA为标准品进行荧光定量RT-PCR，以起始模板的拷贝数为横坐标，以Ct值为纵坐标绘制标准曲线，结果见图2。由图2可知，Ct值与拷贝数浓度在10?1.0XlO6 copies/ μ L之间呈线性关系，标准曲线方程式为y=40_3.351ogx，1-0.998。
[0031]实施例2特异性和敏感性试验
分别提取EHV-1、EAV、H3N8、WNV、JEV、WEEV和EEEV的核酸，用所建立的荧光定量RT-PCR进行检测，用ddH20作为阴性对照。收集荧光信号，检测其特异性。
[0032]用ddH20对标准模板进行10 X系列稀释，取I?1.0X106拷贝/yL用所建立的荧光定量RT-PCR方法对各个稀释度的样品进行检测，同时应用常规RT-PCR进行检测。
[0033]使用建立的Taqman MGB 荧光定量 RT-PCR 方法对 EHV-1、EAV、H3N8、WNV、JEV、WEEV和EEEV阳性样本进行检测，每个样品作平行孔，只有EEEV样本呈现扩增曲线(图3)。将cRNA标准品10倍稀释，进行扩增，扩增曲线见图4，由图4可知，所建立的检测方法在Icopies/μ L时，仍有荧光曲线。核酸浓度为1.0Χ103 copies/μ L时，普通RT-PCR后电泳可见到微弱条带(图5)，因此所建立方法的灵敏度为常规RT-PCR方法的1000倍。
[0034]实施例3临床样品检测
应用本发明建立的荧光RT-PCR方法和常规RT-PCR对荷兰进口的马血样11份，美国进口马血样5份，俄罗斯进口马血样6份进行检测。
[0035]应用建立的方法对22份进口马血样进行检测，结果显示，阳性对照出现扩增曲线，阴性对照无扩增曲线，试验成立，22份马血样均未出现扩增曲线，EEEV检测为阴性。同时应用普通RT-PCR方法对其检测，二者符合率为100%。
[0036]实施例4对比试验
应用本发明建立的荧光RT-PCR方法和中国专利CN 102808043 A公开的方法比较，两者的原理相同，方法过程接近，区别在于引物和探针的序列不同。
[0037]所用的样品是:实施例2中的标准阳性模板
由试验结果可知中国专利CN 102808043 A公开的方法，其检测灵敏度为10个拷贝的RNA (图6)，而本发明的方法灵敏度可达到I个拷贝RNA (图7)，结果说明本发明的引物和探针序列的灵敏度更高。
【主权项】
1.一组检测东方马脑脊髓炎病毒的核苷酸序列，其特征在于: 正向引物的序列如SEQ ID NO:1所示； 反向引物的序列如SEQ ID NO:2所示； 荧光探针的序列如SEQ ID NO:3所示； 荧光探针序列的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团MGB。2.一种检测东方马脑脊髓炎病毒的试剂盒，其特征在于，由以下组分组成: 1)裂解液； 2)荧光RT-PCR反应液，其中包括:RT缓冲液、MgCL2、dNTP、正义引物、反义引物和荧光探针； 3)反转录酶M-MLV； 4)RNA酶抑制剂； 5)TaqDNA聚合酶；6)DEPC 水； 7)阴性对照:东方马脑脊髓炎病毒阴性组织样品； 8)阳性对照:为体外转录的cRNA； 其中，正向引物为序列表SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，反向引物为序列表SEQ IDN0.2所示的核苷酸序列，荧光探针为序列表SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列，其5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团MGB ； 荧光RT-PCR反应液包括:1XRT缓冲液、1.5mM MgCL2、0.05mM dNTP、0.4μΜ正向引物、0.4μΜ反向引物和0.2μΜ荧光探针。
【专利摘要】本发明公开了一组检测东方马脑脊髓炎病毒的核苷酸序列和试剂盒，正向引物的序列如SEQ ID NO：1所示；反向引物的序列如SEQ ID NO：2所示；荧光探针的序列如SEQ ID NO：3所示；荧光探针序列的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团MGB。与常规RT-PCR相比，利用本发明的核苷酸序列和试剂盒建立的TaqMan MGB荧光定量RT-PCR检测东方马脑脊髓炎更加快速，特异性和敏感性更高，灵敏度为常规RT-PCR方法的1000倍。
【IPC分类】C12N15/11, C12R1/93, C12Q1/68, C12Q1/70
【公开号】CN104928401
【申请号】CN201510310646
【发明人】郑小龙, 王群, 邓明俊, 孙明君, 朱来华, 徐彪, 梁成珠, 岳志芹
【申请人】山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2015年6月9日