Biolabs, Frankfurt) 的克列诺片段填充纯化的载体DNA的5'-突出端。在这方面，遵循生产商的信息。将具有 5'-磷酸残基的DNA片段枯草芽孢杆菌"燕接进具有平头末端的载体中。完成的大肠杆 菌表达载体被称作pJ281_alaDH_B·s·_TA_C·v·(Ct)(SEQIDNo·15)。
[0064] 实施例3 生产过表达得自耻垢分枝杆菌的基因 MSMEG_2956和得自诺卡氏菌属的基因/7/7?、得自 枯草芽孢杆菌的aA#卩得自紫色色杆菌的02025的大肠杆菌菌株 为了制备共表达得自耻垢分枝杆菌的编码脂肪酸还原酶（YP_887275. 1)的基因 MSMEG_2956和得自诺卡氏菌属的编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶（ΑΒΙ83656. 1)(其将 脂肪酸还原酶磷酸泛酰巯基乙胺化）的、以及得自枯草芽孢杆菌的编码丙氨酸脱氢酶 (ΝΡ_391071· 1)的基因 aA#卩得自紫色色杆菌的编码转氨酶（ΝΡ_901695· 1)的02025的 大肠杆菌菌株，借助于电穿孔用质粒pACYC{Placuv5}[carA_Ms-npt_Noc](SEQIDNo. 10)和 pJ281_alaDH_B. s._TA_C. V. (ct) (SEQ ID No. 15)转化大肠杆菌菌株 W3110,并 铺板在含有氯霉素（5〇μ8/πι1)和卡那霉素（5〇μ8/πι1)的LB琼脂平板上。通过质粒制备 和分析性的限制分析正确质粒的存在来检查转化体。产生的菌株被称作大肠杆菌W3110 pACYC{Placuv5} [carA_Ms_npt_Noc]/pJ281_alaDH_B. s. _TA_C. V. (ct)。使用该菌株研宄 它从十二烷二酸出发生产十二烷二胺和从十二烷酸出发生产十二烷基胺的能力。基因产 物CarA (被过表达的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶活化的脂肪酸还原酶）将底物十二烷 酸或十二烷二酸分别转化成醛或二醛。基因产物Cv_2505的功能是，将（二）醛最终转化 成十二烷基胺或十二烷二胺。基因产物W从丙酮酸盐提供胺化反应所需的氨基供体丙氨 酸。
[0065] 实施例4 通过大肠杆菌菌株生产十二烷二胺和十二烷基胺，所述大肠杆菌菌株含有得自耻垢分 枝杆菌的基因 MSMEG_2956和得自诺卡氏菌属的基因耶?的表达载体以及得自枯草芽孢杆 菌的基因得自紫色色杆菌的基因心_之似5的表达载体 使用在实施例3中制备的菌株，以研宄它生产十二烷基胺和十二烷二胺的能力。在 DASGIP的8重平行发酵体系中，进行十二烷酸和十二烷二酸分别向十二烷基胺和十二烷二 胺的生物转化。该过程的操作如下： 使用I L反应器进行发酵。使用pH 4.0和pH 7.0的测量溶液，通过2点校准法来校 准pH探头。给反应器装入300 mL饮用水，并在121°C高压灭菌20分钟，以确保无菌度。接 着，将p02探头在DASGIP体系上极化过夜（至少6小时）。次日早晨，在洁净台下取出水， 并用300 mL含有50 mg/L氯霉素和50 mg/L卡那霉素的高细胞密度培养基替换。随后，用 1点校准法校准P〇2探头（搅拌器：400 rpm/充气：10 sL空气/小时），并通过原位清 洁（Clean-in-Place)来清洁补料、校正试剂和诱导试剂管线。为此，将管道用70%乙醇冲 洗，然后用I M NaOH冲洗，然后用无菌的脱矿质水冲洗，最后装入各自的培养基。
[0066] 首先，在含有前述抗生素的LB培养基（25 mL，在100 mL挡板烧瓶中）中在37°C 和200 rpm下将生产十二烷二胺和十二烷基胺的大肠杆菌菌株从冷冻培养物培养过夜约 18小时。接着，将2 mL培养物接种进含有前述抗生素的高密度细胞培养基（15 g/L的葡萄 糖（30 mL/L的单独高压灭菌的500 g/L原溶液，其含有l%MgS04*7H20和2. 2%NH4C1)、1. 76 g/L (NH4)2S04、19.08 g/L Κ2ΗΡ04、12·5 g/L ΚΗ2Ρ04、6·66 g/L 酵母浸出物、2.24 g/L 柠檬 酸三钠二水合物、17 mL/L的柠檬酸铁铵溶液的单独高压灭菌的1%原溶液，5 mL/L的痕量 元素溶液的单独高压灭菌的原溶液（36. 50 g/L HCl (37%)、L 91 g/L MnCl2*4H20、1.87 g/ L ZnS04*7H20、0.84 g/L 乙二胺四乙酸二水合物、0.30 g/L Η3Β03、0·25 g/L Na2Mo04*2H20、 4. 70 g/L CaCl2*2H20、17. 80 g/L FeS04*7H20、0. 15 g/L CuC12*2H20))(在 100 mL 挡板烧 瓶中25 mL)，并在37°C /200 rpm下培养另外5. 5小时。
[0067] 如下以0. 1的光密度接种反应器：将适当体积的预培养物吸入5 mL注射器中（在 无菌条件下），并借助插管通过涂有70%乙醇的隔膜接种反应器。
[0068] 使用下述标准程序：
[0069] 进行的实验可以分成2个阶段：培植，其中细胞将达到确定的光密度，和随后的生 物转化，其中在加入底物十二烷酸、油酸和十二烷二酸以后，将发生由在表达过程中形成的 酶实现的向十二烷基胺、油胺和十二烷二胺的转化。用氨（12. 5%)将pH值单向地调节至 pH 6. 8。在培植和生物转化过程中，通过搅拌器转速和充气速率将培养物中的溶解氧（DO) 调节在30%。以补料分批方式进行发酵，其中通过DO峰触发补料开始，5 g/Lh葡萄糖补料 (500 g/L葡萄糖，含有l%MgS04*7H20和2. 2%NH4C1)。随补料开始，温度也从以前的37°C降 低至30°C。在补料开始以后2小时，通过自动加入I mM IPTG来诱导转氨酶、丙氨酸脱氢 酶、羧酸还原酶和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的表达。在开始生物转化之前，确定培养液的 光密度。
[0070] 在补料开始以后I h或12 h，开始生物转化阶段。为此，将150 mL或75 mL十二 烷酸或十二烷二酸和油酸（工业级90%)的混合物作为批料加入发酵液中。为了使转氨酶 可得到氨基供体，在生物转化开始之前30分钟，将5 mL 3M硫酸铵溶液加入到发酵液中。为 取样，从罐中取出2 mL发酵液，并将其一部分在80%乙腈、20%水和0. 1%甲酸的混合物中以 1/20稀释，并萃取。在生物转化开始以后1.25 h、2. 75 h、4. 25 h、18. 25 h和21.75 h，从 所有反应器中取出样品。在发酵过程中，通过在DASGIP体系上的废气分析，确定氧（OTR = 氧传递速率）和碳（CTR =碳传递速率）的转化速率。在生物转化开始以后21.75 h，结束 发酵。关闭搅拌器、充气、温度控制和PH调节，并将罐静置5-10分钟。
[0071] HPLC-ESI/MS 拍描方法 借助于与高分辨率MS检测偶联的HPLC/MS以扫描模式定性地评估样品。
[0072] 在这里使用下述仪器： ?具有自动采样器、四元泵、PDA检测器和柱恒温箱的Accela HPLC装置（Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) ?具有 ESI 源的 LTQ-FT 质谱仪（Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) ? HPLC 柱：Kinetex C18, 100 x 2. I mm, 颗粒尺寸：2.6Mm, 孔径 IOOA(Phenomenex; Aschaffenburg) 通过将195〇μ1溶剂（80%(v/v)乙腈、20%双蒸H2O (v/v)、+ 0· 1%甲酸）和5〇μ1样品 移入2 ml反应容器中，制备样品。将混合物涡旋约10秒，然后在约13 000 rpm下离心5 分钟。用移液器取出澄清的上清液。
[0073] 用前述HPLC柱进行HPLC分离。注射体积为0. 5μL，柱温度为40 °C，流速为0. 3 mL/ min。流动相由洗脱液A (0. 02%(v/v)浓度的三氟乙酸水溶液）和洗脱液B (含有0. 015%(v/ v)三氟乙酸的乙腈）组成。使用下述梯度方案：
[0074] 使用ESI源的下述参数，以正模式进行ESI-MS分析： ? ESI 电压： 4kV ?毛细管温度 300 °C 鲁鞘气体流速 40 ? Aux气体流速 5 鲁清扫气体流速 3 在m/z = 100-1000的质量范围内进行检测。质谱法分辨率为R = 100 000。
[0075] 结果显示在下表中。
[0076] 21. 75 h处理时间以后大肠杆菌菌株W3110 pACYC{Placuv5} [carA_Ms_npt_Noc]/ pJ281_alaDH_B. s. _TA_C. v. (ct)的发酵液中的单胺和二胺的定性检测（n. d.=不可检测， LA =月桂酸，DDA =十二烷二酸）。
[0077] 在图1中解释了其它数据。
[0078] 在借助于邻苯二甲醛衍生化以后，通过HPLC/UV测量，定量地确定1，12-十二烷二 胺和十二烷基胺。测量甲醇上清液。最重要的色谱参数总结在下表中。
[0079] 结果显示在下表中。
[0080] 21. 75 h处理时间以后大肠杆菌菌株W3110 pACYC{Placuv5} [carA_Ms_npt_Noc]/ pJ281_alaDH_B. s. _TA_C. v. (ct)的发酵液中的单胺和二胺的定量（η. η.=不可检测，*> 低于检测限，DDA =十二烷二酸，LA =月桂酸）。
[0081] 证实了所述菌株能够从十二烷酸、十二烷二酸和油酸分别生产胺十二烷基胺、 十二烷二胺和油胺。
[0082] 实施例5 生产用于表达得自亚洲栽培稻（saiira)的编码α-双加氧酶的基因 a DOX的 表达载体 为了生产用于表达得自亚洲栽培稻的编码α-双加氧酶（ΝΡ_001066718. 1)的aDOX (0sl2g0448900，SEQ ID No. 16)的载体，对该基因为在大肠杆菌中表达进行密码子优化， 合成，并同时引入上游限制位点和下游JktII限制位点。将合成的DNA片段用限制性 内切核酸酶和JktII消化，并连接进相应地切割的除去了基因 carA_Ms和npt_Noc的 载体pACYC{Placuv5}[carA_Ms-npt_Noc](SEQIDNo.lO)中。保留含于载体中的lacuv5 启动子（SEQIDNo·3)。完成的载体被称作pACYC{Placuv5}[D0X_0s(co_Ec)](SEQID No. 17)。载体pACYC是大肠杆菌载体，其介导氯霉素抗性且也带有pl5A复制起点且因而 具有低拷贝数（10-15个拷贝/细胞）。
[0083] 实施例6 生产大肠杆菌菌株，其具有在基因的缺失，其过表达得自亚洲栽培稻的基因 a D0X、得自枯草芽孢杆菌的基因 aA#卩得自紫色色杆菌的基因02025 为了制备这样的大肠杆菌菌株：其共表达得自亚洲栽培稻的编码α-双加 氧酶（ΝΡ_001066718. 1)的基因 a DOX以及得自枯草芽孢杆菌的编码丙氨酸脱氢 酶（ΝΡ_391071. 1)的基因 W (SEQ ID No. 11)和得自紫色色杆菌的编码转氨酶 (ΝΡ_901695·1)的 02025 (SEQ ID No. 12)，将大肠杆菌菌株 W3110A/7i〇"(生产：参见 EP12007663，实施例l)借助于电穿孔用质粒pACYC{Placuv5}[D0X_0s(co_Ec)](SEQID No. 17)和 pJ281_alaDH_B.s._TA_C.v. (ct) (SEQ ID No. 15)转化，并铺板在含有氯霉素 (5〇μ8/πι1)和卡那霉素（5〇μ8/πι1)的LB琼脂平板上。通过质粒制备和分析性限制分析正 确质粒的存在来检查转化体。制备的菌株被称作大肠杆菌AbioH pACYC{Placuv5}[D0X_ Os (co_Ec) ]/pJ281_alaDH_B. s. _TA_C. V. (ct)。
[0084] 使用该菌株来研宄它从十二烷二酸甲酯起始生产氨基十一烷酸甲酯的能力。
[0085] 实施例7 通过大肠杆菌菌株从十二烷二酸甲酯起始生产氨基十一烷酸甲酯，所述大肠杆菌菌株 含有得自亚洲栽培稻的基因 a DOX的表达载体以及得自枯草芽孢杆菌的基因 a卩得自紫 色色杆菌的基因的表达载体 使用在实施例8中描述的菌株来研宄它生产氨基十一烷酸甲酯的能力。该过程的操作 如下： 首先将研宄的菌株涂抹在含有5(^g/ml氯霉素和5(^g/ml卡那霉素的LB琼脂平板上， 并在37°C温育过夜。作为对照，另外将大肠杆菌菌株W3110 Δ bioH涂抹在不含有抗生素的 LB琼脂平板上。然后在含有5〇μ8/πι1氯霉素和5〇μ8/πι1卡那霉素（对于带有质粒的菌株） 的Luria-Bertani液体培养基Miller (Merck, Darmstadt)中培养所述菌株，作为得自每 一单一菌落的20 ml预培养物。作为主要培养物，预先将100 ml含有5〇μ8/πι1氯霉素和 5(^g/ml卡那霉素的LB液体培养基装入具有挡板的500 ml锥形瓶中，并接种2 ml预培养 物。首先在培养箱振荡器中在37°C和200转/分钟进行培养。达到0.5 - 0.7的光密度 (600 nm)时，通过加入I mM IPTG来诱导基因表达。在22°C和200转/分钟进一步培养过 夜。次日，通过在4°C和5525 X g离心10分钟，收获培养物。将上清液抛弃，并将细胞沉淀 物在200 mM磷酸钾缓冲液（pH 7. 5)中洗涤。最后将细胞沉淀物溶解于含有50 mM氯化铵 和0. 5%(w/v)葡萄糖的200 mM磷酸钾缓冲液中，由此达到20的OD (600 nm)。将12. 5 mM 十二烧二酸甲醋（abcr, Karlsruhe)在乙醇中的溶液加入细胞混悬液中，并在30°C和300 rpm轻轻摇动4小时。在温育过程中，在时间0 min、60 min、120 min、180 min和240 min 取样，并在80%乙腈、20%水和0. 1%甲酸的混合物中萃取。借助于HPLC/MS分析，分析上清 液。结果显不在下表中。
[0086] 用过表达得自亚洲栽培稻的a D0X、得自枯草芽孢杆菌的aA#卩得自紫色色杆菌 的Cv_2025的大肠杆菌W3110Abi〇H生产氨基^^一烷酸甲酯。数据是峰面积（η. η.=不 可检测）。
[0087]已能证实，大肠杆菌菌株 W31 IOAbioH pACYC{Placuv5} [D0X]/pJ281_alaDH_ B. s._TA_C.v. (ct)能够由十二烷二酸甲酯起始形成氨基十一烷酸甲酯。
【主权项】
1. 全细胞催化剂，其表达重组a-双加氧酶或由重组脂肪酸还原酶和由将所述脂肪酸 还原酶磷酸泛酰巯基乙胺基化的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶构成的组合，且其另外表达转 氨酶，其中所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶和/或转氨酶优选地是重组体。2. 根据权利要求2所述的全细胞催化剂，其中所述全细胞催化剂另外表达氨基酸脱氢 酶，所述氨基酸脱氢酶优选地是重组体。3. 根据权利要求1和2中的任一项所述的全细胞催化剂，其中所述全细胞催化剂另外 表达烷烃羟化酶，所述烷烃羟化酶优选地是重组体。4. 根据权利要求1-3中的任一项所述的全细胞催化剂，其中所述全细胞催化剂另外表 达AlkL家族的多肽，所述多肽优选地是重组体。5. 根据权利要求1-4中的任一项所述的全细胞催化剂，所述全细胞催化剂另外表达醇 脱氢酶，所述醇脱氢酶优选地是重组体。6. 根据权利要求1-5中的任一项所述的全细胞催化剂，其中至少一种参与0 -氧化的 酶的活性相对于所述全细胞催化剂的野生型降低。7. 根据权利要求1-6中的任一项所述的全细胞催化剂，其中BioH或其变体的活性相对 于所述全细胞催化剂的野生型降低或升高。8. 根据权利要求1-7中的任一项所述的全细胞催化剂，其中FadL或其变体的活性相对 于所述全细胞催化剂的野生型升高。9. 将羧酸或二羧酸或其单酯转化成胺或二胺的方法，所述方法包括下述步骤： a) 提供羧酸或二羧酸或在二羧酸的情况下其单酯，优选地通过使羧酸与烷烃羟化酶和 /或醇脱氢酶接触， b) 使所述羧酸或二羧酸或其单酯与磷酸泛酰巯基乙胺基化的脂肪酸还原酶或a-双 加氧酶接触，形成醛产物，和 c) 使得自步骤a)的醛产物与转氨酶接触。10. 根据权利要求9所述的方法，其中步骤c)中存在氨基酸脱氢酶。11. 根据权利要求9-10中的任一项所述的方法，其中选自由磷酸泛酰巯基乙胺基化的 脂肪酸还原酶、a-双加氧酶、转氨酶、氨基酸脱氢酶和烷烃羟化酶组成的组的至少一种酶， 优选所使用的选自该组的所有酶，以根据权利要求1-8中的任一项所述的全细胞催化剂的 形式提供。12. 根据权利要求9-11中的任一项所述的方法，其中所述羧酸或二羧酸或其单酯是式 (I)的化合物 R1 -A-COOR2 (I)， 其中R1选自-H和COOR3， 其中R2和R3各自并彼此独立地选自H、甲基、乙基和丙基， 前提条件是，残基R2和R3中的至少一个是H， 其中A是无分支的、支链、直链、环状、被取代的或未被取代的、具有至少4个碳的烃基。13. 根据权利要求9-12中的任一项所述的方法，其中A具有式-(CH2)11 -，其中n是至 少4,优选至少10。14. 根据权利要求1-8中的任一项所述的全细胞催化剂或根据权利要求8-12中的任一 项所述的方法用于胺化羧酸或二羧酸或其单酯的用途。15.反应混合物，其包含在水溶液中的根据权利要求1-8中的任一项所述的全细胞催 化剂以及式（I)的羧酸或二羧酸或其单酯 R1 -A-COOR2 (I)， 其中R1选自-H和COOR3， 其中R2和R3各自并彼此独立地选自H、甲基、乙基和丙基， 前提条件是，残基R2和R3中的至少一个是H， 其中A是无分支的、支链、直链、环状、被取代的或未被取代的、具有至少4个碳的烃基， 优选式-(CH2)n -，其中n是至少4,特别优选至少10。
【专利摘要】本发明涉及全细胞催化剂，其表达重组α-双加氧酶或由重组脂肪酸还原酶和将所述脂肪酸还原酶磷酸泛酰巯基乙胺基化的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶构成的组合，且其除了表达α-双加氧酶和/或由脂肪酸还原酶和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶构成的组合以外还表达转氨酶，其中所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶和/或转氨酶优选地是重组体；还涉及用于将羧酸或二羧酸或其单酯转化成胺或二胺的方法，所述方法包括下述步骤：使所述羧酸或二羧酸或其单酯与磷酸泛酰巯基乙胺基化的脂肪酸还原酶或α-双加氧酶接触，和使产物与转氨酶接触。
【IPC分类】C12N9/12, C12P13/00, C12N9/10, C12N15/52, C12N9/00
【公开号】CN104937104
【申请号】CN201380066088
【发明人】S.沙费尔, J.科塔尔斯, M.韦泽尔, H-G.亨内曼, H.赫格, M.福兰德, M.罗斯
【申请人】赢创德固赛有限公司
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2013年12月18日
【公告号】CA2895867A1, EP2746400A1, EP2935602A1, US20150307906, WO2014095986A1