c〇7iS17 (pJNRM)并进行菌种保藏。
[0017] 大肠杆菌-刺糖多孢菌属间接合转移方法如下： (1) 受体菌活化：将_80°C保藏的刺糖多孢菌400yL接种至20mLCSM培养基中，30°C 220r/min振荡培养48h; (2) 受体菌第一次转接：按1 :10的比例进行转接（即2mL培养了 48h菌液转接于18 mL胰蛋白胨大豆肉汤培养基中），相同条件下培养过夜； (3) 供体菌接种：挑取S17 (pJNRM)的分别接种于10mL添加了链霉素、甲氧苄氨嘧啶 和阿伯拉霉素的TY液体培养基中，37 °C培养过夜； (4) 受体菌第二次转接：按1:4的比例转接，即5mL过夜培养的受体菌转接至15mL 胰蛋白胨大豆肉汤培养基液体培养基中，同样条件下培养4-6h; (5) 受体菌收集：将菌液分装至2mLEP管中，5000r/min离心10min收集菌丝体，悬 浮于450yL(微升）胰蛋白胨大豆肉汤培养基中； (6) 供体菌收集：2mLEP管收集菌体，每个EP管加入1mLTSB培养基，吹打混匀，5000r/min离心5min，重复洗一次，5000r/min离心5min后悬浮于1. 8mLTSB中； (7) 接合转移：供体菌与受体菌以3 :1的比例混合，即取300yL大肠杆菌悬液与100UL受体菌悬液充分混匀后，涂布于无抗生素的R6固体培养基上，30°C倒置培养16-20h; (8) 抗生素覆盖：将抑制细菌生长的萘啶酮酸和筛选转化子的阿伯拉霉素加至1mL TSB液体培养基中，混匀后覆盖于R6平板，超净工作台中吹干，30°C恒温培养箱中倒置培养 7-14d〇
[0018](三）工程菌株刺糖多孢菌S.sp-RM的构建及其PCR鉴定 以Apr-F/Apr-R为引物，将筛选得到的具有阿伯拉抗性的接合子基因组作为模板进 行PCR扩增，同时以原始菌株基因组为模板作为阴性对照，琼脂糖凝胶电泳结果显示(如图 1)，所鉴定三个接合子均为阳性，说明重组质粒pJNRM已成功导入5： 菌株中。
[0019] 为了进一步确定重组载体pJNRM是否以单交换同源重组的方式整合至染色体上， 设计了 3对引物，对获得的阳性接合子进行PCR扩增，以鉴定同源重组整合为点。PCR鉴定 结果表明（如图2)，所选取的六个接合子均是以长度为1928bp的识/Hre基因片段作为同 源臂进行整合的，而不是以长度较短的^或印i片段作为同源臂，这也能说明了同源臂 越长，越有利与基因的整合。
[0020](四）工程菌株多杀菌素的HPLC分析 将野生型刺糖多孢菌和工程菌株S.sp-RM保藏液500yl分别接种至20mL种子培 养基，30°C，280r/min培养48h，按10 %接种量转接至50mL发酵培养基中，30°C280r/ min培养培养过程中每3天补一次水，10天后取600y1发酵液加入600y1丙酮，4°C冰 箱放置24h后13000r/min离心lOmin，取上清，经0.22ym滤膜过滤，滤液用Agilent 1290反相高效液相色谱（HPLC)检测分析多杀菌素含量。Z0RB0XSB-C18柱，4. 6X150mm， 5-Mffl;流动相：甲醇/乙腈/2%醋酸铵溶液(体积比9/9/1);上样体积：5yL;柱温：室温； 流速：1. 0mL/min;检测波长：250nm;经系统自带的分析软件分析得到多杀菌素A、D响应 峰面积，通过公式计算得到发酵液中多杀菌素的含量。
[0021] 分析发现，工程菌株S.sp-RM保留时间在6. 6min和8. 7min左右的多杀菌素色 谱峰相对产量提高最明显，经过多次发酵及色谱分析（图3)，其稳定性良好，原始菌株多杀 菌素A+D平均峰面积为213. 9mAU*s，工程菌株S.sp_RM平均峰面积为369. 4mAU*s，工程 菌株相比原始菌株提高了 72.69%。
[0022] (五）实时荧光定量PCR检测 为了在转录水平验证工程菌株中NDP-鼠李糖生物合成基因（rAa)表达量的提高，采用 相对荧光定量RT_PCR方法对其进行了检测分析。首先，将等量活化好的原始菌株与工程 菌株转接至合成发酵培养基中，30°C，280r/min培养5d，分别提取原始菌株5： spiflosa和 工程菌株S.sp-RM的总RNA，RNA的提取采用TRIzol试剂盒（Invitrogen)。为排除基因组 DNA对实验结果造成的影响，对提取到的RNA进行DNA的消化，按照Thermo公司DNaseI， RNase-free试剂盒步骤进行。反转录参照Fermentas反转录试剂盒操作步骤。
[0023] 以16SrRNA为内参，对51菌株与S.sp-RM菌株中rAa基因的mRNA表 达水平进行比较分析，设定5： 菌株各基因mRNA与其内参mRNA的比值为1，每个样 品设4个重复。由图6可知：与原始菌株5： 相比，rha基因的转录水平在工程菌 株S.sp-RM中均显著上调，工程菌中和基因的转录水平分别比原始菌 株提高了 80. 3倍、30. 8倍、23. 8倍和18. 3倍（图4)。
[0024](六）SDS-PAGE分析菌体全蛋白及1D-LC-MS/MS鉴定差异蛋白 为了分析NDP-鼠李糖生物合成基因（rAa)加倍对刺糖多孢菌全蛋白质组的影响，采 用SDS-PAGE方法对工程菌S.sp-RM和原始菌5：分72h菌体全蛋白进行检测，通 过1D-LC-MS/MS鉴定检测到的差异蛋白。首先，将等量活化好的原始菌株与工程菌株转接 至合成发酵培养基中，30°C，280r/min培养72h;利用超声破碎法分别提取原始菌株5： 和工程菌株S.sp-RM的菌体总蛋白，Bradford法对所提蛋白定量后进行SDS-PAGE (12%)电泳分析。结果发现工程菌株全蛋白条带减少（如图5)，尤其是66. 4- 97.2kDa区 域，且分子量超过100kDa的蛋白表达均被抑制；另外，工程菌株中出现了表达明显增强的 蛋白条带C-G(图5)。
[0025]将工程菌株S.sp4M检测到的差异蛋白条带A-G(图5)胶内酶解后通过 1D-LC-MS/MS鉴定，发现它们分别为分子伴侣蛋白GroEL、延伸因子Tu、ABC转座子结合蛋 白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、吡哆醛裂合酶、磷酸甘油变位酶和4-酮-6-脱氧-D-葡萄糖差 向异构酶(表2)。利用在线蛋白分析软件Uniprot(www.uniprot.org)和STRING(string. embl.de)对其功能进行分析发现鼠李糖生物合成基因的加倍不仅能影响鼠李糖和福乐糖 胺的生物合成(参见表2)，而且能通过影响核糖体蛋白装载过程、PKS合成来调控刺糖多孢 菌次级代谢过程（图6)。
【主权项】
1. 一株刺糖多孢菌鼠李糖生物合成基因加倍工程菌株，其特征在于，所述刺糖多孢菌 鼠李糖生物合成基因加倍工程菌株，即刺糖多孢菌s. sp-RM，Saccharopolyspora spinosa S. sp-RM，于2015年6月8日在中国典型培养物保藏中心保藏，菌种保藏号为CCTCC NO: M 2015363。2. 根据权利要求1所述的刺糖多孢菌鼠李糖生物合成基因加倍工程菌株，其特征在 于，刺糖多孢菌染色体上整合有含3' -0-甲基鼠李糖生物合成基因的质粒pJNRM。3. 如权利要求1、2所述刺糖多孢菌鼠李糖生物合成基因加倍工程菌株在生物合成多 杀菌素中的应用。
【专利摘要】一株刺糖多孢菌鼠李糖生物合成基因加倍工程菌株，所述刺糖多孢菌鼠李糖生物合成基因加倍工程菌株，即刺糖多孢菌S. sp-RM，Saccharopolyspora spinosa S. sp-RM，于2015年6月8日在中国典型培养物保藏中心保藏，菌种保藏号为 CCTCC NO：M 2015363。PCR鉴定结果表明，该质粒已成功地整合至须糖多孢菌基因组上；实时荧光定量PCR结果显示，工程菌中 gdh、kre、epi和gtt基因的转录水平分别比原始菌株提高了80.3倍、30.8倍、23.8倍和18.3倍；HPLC检测结果表明，工程菌S. sp-RM中多杀菌素产量比原始菌株提高73 %。CCTCC NO：M 201536320150608
【IPC分类】C12R1/645, C12N1/15, C12P19/62
【公开号】CN104962484
【申请号】CN201510444998
【发明人】夏立秋, 杨燕, 丁学知, 孙运军
【申请人】湖南师范大学
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2015年7月27日