ose0. 2%+Amp120yg/ m) 37°C180转快摇至0D600为0. 6左右，加IPTG至100yg/ml，同时再补充一次新的Amp至 120yg/ml(两次共为 240yg/ml)，30°C诱导 20h。
[007引 （3)、将培养液在4°C、700化pm离屯、5min，收集菌体，即为含有胞内表达重组蛋白 EST4的大肠杆菌湿菌体（也可W将大肠杆菌湿菌体冷冻干燥化后即得到冻干菌体）。
[0074](4)、将大肠杆菌湿菌体用BufferNPI-10重悬，于低温水浴下使用超声波破碎 该大肠杆菌湿菌体，将破碎后的粗酶液经8000巧m离屯、15min后，吸取上清并用Ni-NTA SuperflowCartridge纯化，脱盐，获得目的蛋白（即醋酶EST4)。
[0075] 对获得的目的蛋白进行SDS-PAGE，结果如图1所示。在图1中，纵列M表示蛋白 Marker,纵列1表示纯化后的醋酶EST4。图1的结果表明，重组醋酶EST4在大肠杆菌中确 实得到了表达，在NPI-200洗脱条件下纯化后为单一条带。
[0076] 应用实施例1
[0077] 对所得到的重组醋酶EST4进行底物特异性分析，分析体系为1. 5ml反应体系，该 反应体系含有lOOmMTris-HCl缓冲液（pH8. 0)和ImM短链酷基底物。短链酷基底物可W 为对硝基苯酪己酸醋似），对硝基苯酪了酸醋（C4)，对硝基苯酪辛酸醋膊），对硝基苯酪 癸酸醋（CIO)，对硝基苯酪月桂酸酸醋（C12)，对硝基苯酪肉豆違酸醋（C14)，对硝基苯酪栋 桐酸酸醋（C16)。
[007引分析方法为；向分析体系中加入0.5yg纯蛋白（即重组醋酶EST4)，在30°C反应 5min，加1. 0ml0. 1 %SDS终止反应，然后测定405皿波长处的吸光值，分析结果如图6所 示。在图6中，C2表示对硝基苯酪己酸醋，C4表示对硝基苯酪了酸醋，C8表示对硝基苯酪 辛酸醋，CIO表示对硝基苯酪癸酸醋，C12表示对硝基苯酪月桂酸酸醋，C14表示对硝基苯酪 肉豆違酸醋，C16表示对硝基苯酪栋桐酸酸醋。图6的结果表明，重组醋酶EST4能特异性地 水解醋键，对酷基碳链较短的对硝基苯酪醋（C2,C4,C8和CIO)具有较高的催化活性，其中 底物为对硝基苯酪了酸醋（C4)时水解活性最高，较难水解酷基碳链较长的对硝基苯酪醋 (C12,C14和C16)。由此可知，醋酶EST4对酷基链较短的醋类物质具有较高的水解活性，同 时也印证了醋酶EST4偏好于短链酷基底物（C<10)。
[0079] 应用实施例2
[0080] 将上述的大肠杆菌湿菌体冷冻干燥化后即得到冻干菌体，W该冻干菌体作为催 化剂。在50ml具塞S角瓶中分别将2.0M的肉桂醇、香茅醇和香叶醇与6.0M的己酸己締 醋、正己烧组成5. 0ml的非水相转醋化反应体系。按lOmg/ml冻干菌体的量，加入到非水 相转醋化反应体系中，于40°C条件下，在恒温摇床上W25化pm的速度旋转震荡2化，间隔 时间取样，用高效气相色谱检测，检测结果结果如图7所示，2. 0M肉桂醇、香茅醇和香叶醇 通过生物酶转化得到己酸桂醋、己酸香茅醋和己酸香叶醋的转化率分别为1〇〇%、99. 14%、 92.25%。短链祗締类醋的駿基端的碳原子小于10个，包含己酸醋。
[0081] 应用实施例3
[0082] 将上述的大肠杆菌湿菌体冷冻干燥化后即得到冻干菌体，W该冻干菌体作为催 化剂。仲醇分别为；a-苯己醇、a-苯丙醇、4-苯基-2-了醇、1-苯基-2-丙醇、1-(3-氣 苯基）己醇、1-(3-氯苯基）己醇、1-(3-漠苯基）己醇、1-(3-甲基苯基）己醇、1-(3-甲氧 基苯基）己醇、1-(4-氣苯基）己醇、1-(4-氯苯基）己醇、1-(4-漠苯基）己醇、1-(4-甲基 苯基）己醇、1-(4-甲氧基苯基）己醇、化）-a-(S氣甲基）节醇、（±)-1-(2-快喃基） 己醇。在50ml具塞S角瓶中，反应体系按1:3摩尔比加入仲醇与了酸己締醋并用正己烧补 至5. 0ml，然后加入50mg冻干菌体，于30°C恒温摇床20化pm的速度旋转震荡，用高效液相 色谱检测产物，检测结果如表1所示。
[0083] 表1醋酶EST4动力学拆分仲醇结果
[0084]
[0085] 对映体过量值（ee);ee= (R-巧/(R+巧，其中R、S分别为两种对映体的含量（％ )。
[0086] 转化率（C);C=ee,/ (ee,+ee。)，其中ee,为底物对映体过量值，eeP为产物对映体 过量值。
[0087] 对映体选择率E值用于表示酶对所拆分底物的效果，E值越大，则在转化率50% 时产物的光学纯度越大。一般当E<15时，选择性较差，没有实用价值。E=ln[(l-C) (l-ee,) ]/In[ (1-C) (l+ee,)]。
[008引由表1可知，醋酶EST4在仲醇动力学拆分方面，表现出了良好的对映体选择性。醋 酶EST4对a-苯己醇W及a-苯己醇间位、对位取代基的衍生物均能实现在转化率为50% 左右时得到单一的对映纯底物；另外，其对不同大小侧链和不同哲基位置的仲醇同样具有 良好的拆分效果，并且在较高底物浓度下实现拆分。
[0089] 另外，本发明的醋酶EST4还能在酶法合成天然香精香料和手性医药中间体的制 备过程中得W应用。
[0090] 上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发 明。熟悉本领域技术的人员显然可w容易地对该些实施例做出各种修改，并把在此说明的 一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例， 本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发 明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种来源于深海污泥的酯酶基因est4,其特征在于：其碱基序列如SEQ ID NO :1所 不O2. 根据权利要求1所述的来源于深海污泥的酯酶基因est4,其特征在于：其所编码的 酯酶EST4的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。3. -种来源于深海污泥的酯酶EST4,其特征在于：其由如权利要求1所述的来源于深 海污泥的酯酶基因est4编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。4. 如权利要求3所述的来源于深海污泥的酯酶EST4在催化短链酰基底物的水解反应 中的应用，其中，所述短链酰基底物的碳原子的数目小于10。5. -种重组质粒，其特征在于：包含表达载体和如权利要求1所述的来源于深海污泥 的醋酶基因est4。6. 根据权利要求5所述的重组质粒，其特征在于：所述的表达载体为pLLp-OmpA。7. -种基因工程菌株，其特征在于：该基因工程菌株通过使用如权利要求3所述的重 组质粒转化大肠杆菌ToplOF'获得，其用于表达氨基酸序列为SEQ ID NO :2的酯酶，该基因 工程菌株的保藏编号为CGMCC No. 10812。8. 如权利要求7所述的基因工程菌株在催化短链酰基底物的水解反应中的应用，所述 短链酰基底物的碳原子的数目小于10。9. 如权利要求7所述的基因工程菌株在催化多种芳香仲醇的动力学拆分反应中的应 用。10. 如权利要求7所述的基因工程菌株在短链萜烯酯的催化生成反应中的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种酯酶est4、酯酶EST4、重组质粒和基因工程菌株及其应用，该酯酶EST4由来源于深海污泥的酯酶基因est4编码，其催化水解温度范围为20-55℃，水解pH值为5.0-10.0，在45℃条件下保温12h仍能保持80％以上的残余酶活，在纯极性有机溶剂中保存12h仍然保持90％以上的残余酶活；该酯酶EST4能够应用于催化多种芳香仲醇的动力学拆分反应和短链萜烯酯的催化生成反应；本发明还构建了能够表达上述酯酶EST4的基因工程菌株，实现了该酶在大肠杆菌中的异源表达，为其工业化生产打下了良好的基础。CGMCC NO.1081220150518
【IPC分类】C12N1/21, C12P7/62, C12N15/70, C12N15/55, C12P41/00, C12N9/16, C12R1/19, C12P7/22
【公开号】CN104988165
【申请号】CN201510342723
【发明人】王华磊, 高文渊, 魏东芝
【申请人】华东理工大学
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年6月19日