一株简单芽孢杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物防治植物病害领域。具体而言，本发明设及一株能够高效防治植 物病害的芽抱杆菌及其用途，W及采用该芽抱杆菌制备的生物防治制剂。
【背景技术】
[0002] 植物病害是植物在生物或非生物因子的影响下，发生一系列形态、生理和生化上 的病理变化，阻碍了正常生长、发育的进程，从而影响人类经济效益的现象。目前对于植物 病害的防治，常规采用的方法包括传统的化学防治、培育抗病品种W及生物防治。抗病品种 培育周期长，抗性单一，而化学防治，极易造成农药残留，环境污染；同时，化学农药的长期 使用，使得病原菌对其产生抗药性，导致防效下降甚至失败。因此，利用有益微生物防治植 物病害具有广阔的前景。
[0003] 芽抱杆菌度acillus)，在分类上是细菌的一个科，能形成芽抱（内生抱子）的杆 菌或球菌。包括芽抱杆菌属、芽抱乳杆菌属、梭菌属、脱硫肠状菌属和芽抱八叠球菌属等。 形成芽抱后，它们对外界有害因子抵抗力强，分布广，存在于±壤、水、空气W及动物肠道等 处。由于它们代谢快、繁殖快，四小时增殖10万倍；生命力强，耐受性好；体积大，占据空间 优势，抑制有害菌的生长繁殖等优势而备受瞩目。芽抱杆菌是植物病害生防微生物的重要 组成部分，可用于防治多种植物病害。芽抱杆菌作为生防菌防治植物病害的机制主要有：抗 生作用、营养竞争、空间竞争、重寄生作用W及诱导植物产生抗性等机制，芽抱杆菌的生防 机制主要是W产生括抗物质抑制有害病菌的生长或杀死病原菌。运些物质绝大多数为肤类 抗生素，具有高效、低残留、与环境友好等优点。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种用于高效防治多种植物病害的新的微生物一-简单芽 抱杆菌菌株STY005。本发明的芽抱杆菌菌株具有直径长、耐低氧、作用谱广、适应性强，在低 营养下即可快速生长繁殖等特点，因此具有良好的应用前景。 阳0化]本发明所提供的菌株为简单芽抱杆菌度acillussimplex)STY005,是从山东省林 业科学院苗圃中分离获得的，已于2015年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中屯、（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生 物研究所），保藏编号为CGMCCNo. 11052。其具有W下生物学特性：在牛肉膏蛋白腺琼脂培 养基或LB培养基上菌落形态为圆形或不规则形，乳白偏黄色，表面粗糖起權皱，在牛肉膏 蛋白腺琼脂培养基上，28°C下培养两天后，镜检，菌体细胞呈杆状，能运动。经革兰氏染色呈 阳性（W大肠杆菌为对照）。经芽抱染色后观察芽抱呈楠圆形或柱状。
[0006] 本发明简单芽抱杆菌菌株STY005的培养方法或繁殖方法包括：
[0007] (1)普通培养保存采用LB培养基，配方为：膜蛋白腺lOg，酵母提取物5g，氯化钢 1〇邑，琼脂15-20g，蒸馈水1000血，抑调至7. 1-7. 4 ;
[0008] (2)实验室液体培养采用LB液体培养基，配方为：膜蛋白腺lOg，酵母提取物5g， 氯化钢lOg，蒸馈水1000血，pH调至7. 1-7. 4 ;
[0009] 做固体培养基配方：固料和无机盐溶液，按质量比1 :1.8的比例配制。其中所述 固料的组分及重量比为：玉米面75%，豆巧10%，教皮15% ;按质量百分比计，所述无机盐 溶液的组分及含量为：憐酸二氨钟3. 5%，硫酸儀0. 04%，硫酸锭4%，剩余为水。
[0010] (4)大量发酵培养基配方：同（3)中固体培养基配方。
[0011] 本发明还提供了一种生物防治制剂，包括所述的简单芽抱杆菌菌株STY005。
[0012] 上述生物防治制剂的制备方法，包括W下步骤：
[0013] (1)制备简单芽抱杆菌菌株STY005的种子液；
[0014] 似将步骤（1)制备的种子液接种到固体培养基中，28~30°C下恒溫培养3~ 5d;
[0015] (3)将步骤（2)培养的培养物加入无菌水混合，过滤，将滤液接种至大量发酵培养 基，在室溫28~32°C、相对湿度85%W上的发酵室中进行发酵培养。
[0016] 优选的，所述制备方法包括W下步骤：
[0017] (1)将简单芽抱杆菌的抱子移植到LB液体培养基中，28~30°C摇床振荡培养3~ 5d得到种子液；
[001引 似将步骤（1)制备的种子液按质量比10%的比例接种到固体培养基中，28~ 30°C下恒溫振荡培养3~5d;
[0019] 做将步骤似培养的培养物加入无菌水按质量比1 :15的比例混合，过滤，将滤 液按体积比1 :6的比例接种至大量发酵培养基，室溫28~32°C、相对湿度85%W上的发酵 室中发酵培养8~9d。
[0020] 本发明也提供了上述简单芽抱杆菌菌株STY005或者上述生物防治制剂在防治植 物叶部病害中的用途，所述植物叶部病害可W选自马铃馨疮挪病、葡萄霜霉病、月季白粉 病、黄瓜祀斑病等的一种或几种。
[0021] 并且，本发明还提供了一种用于防治植物病害的生物防治方法，包括向具有上述 病害的植物施用上述简单芽抱杆菌菌株STY005或者上述生物防治制剂。
[0022] 实验表明，本发明的简单芽抱杆菌菌株STY005具有直径长、耐低氧、作用谱广、适 应性强，在低营养下即可快速生长繁殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该简单芽抱杆 菌菌株STY005制备的生物防治制剂，不仅能够高效的防治植物病害，还能有效提高作物产 量，是一种极具应用前景的生物防治制剂。该微生物制剂可W作为生物农药或生物肥料防 治作物叶部病害，包括马铃馨疮挪病、葡萄霜霉病、月季白粉病、黄瓜祀斑病等一种或几种； 还可W防治辣椒根腐病、棉花立枯病、西瓜枯萎病等多种±传植物病害。
【具体实施方式】 阳〇2引 实施例1
[0024] 1、简单芽抱杆菌度acillussimplex)菌株STY005的分离与纯化 阳0巧]本发明的简单芽抱杆菌度acillussimplex)菌株STY005是从±壤中采用稀释平 板法和平板划线法分离获得的，分离方法为：
[00%] (1)芽抱杆菌的分离：±样的采集，在山东省林业科学院苗圃，采用5点取样法，分 别采集地块四周和中央深度在10-20cm范围内的±壤适量，等量混匀。标明采集地点、时间 和采集人。称取Ig上样于lOOmL无菌水中，置于30°C摇床中15化pm震荡lOmin，然后置于 60°C水浴锅中解育30min，取100yL10 2、10 3、104稀释液涂布于LB培养基平板上，每个梯 度涂布=个平行，在30°C培养2d后挑取LB培养基上的不同形态的微生物菌落于LB培养基 平板上进行划线，定时观察菌落生长情况。然后采用平板划线法，纯化芽抱杆菌菌株，分别 编号保存。
[0027] 似马铃馨疮挪病高效括抗芽抱杆菌的筛选
[0028]A.马铃馨疮挪病分离
[0029]培养基（高氏一号）：可溶性淀粉20g，化C1 0. 5g，KNOslg，K2HPO4?3&0 0. 5邑， M拆〇4? 7&0 0.5g，FeS〇4? 7&0 0.Olg，琼脂15~25g，水 1000ml;pH7.1~7. 4。
[0030] B.病原菌分离
[0031] 采用高氏一号培养基，来源为内蒙古原产马铃馨荷兰15感病馨块，由山东省蔬菜 研究所提供。菌株经感病回接和鉴定，确定为疮挪链霉菌StreptomycesSC油iesCrhaxter) Waks.et化nvici，菌株代号SN15-1，该菌株在PDA上也可W生长，但生长缓慢，必须采用封 口胶锁住水分，保持湿度。
[0032] ①初筛：采用对時培养法，制备PDA平板，用打孔器在芽抱杆菌、马铃馨疮挪病边 缘打取直径为5mm的菌饼，分别移植在平板相对的两侧中央，25°C恒溫培养，逐日观察芽抱 杆菌对病原菌的抑制作用。
[0033] ②复筛：将筛选到的具有高效括抗活性的芽抱杆菌菌株进行复筛，主要是经过耐 溫性、耐酸碱性、耐药性试验，筛选到耐性较好的芽抱杆菌菌株，进行盆栽防治试验和田间 试验。
[0034] 本发明人通过大量筛选工作得到一株能够高效防治多种植物病害的简单芽抱杆 菌菌株STY005。实验证明，该简单芽抱杆菌原粉在防治马铃馨疮挪病显示出非常高效的防 治效果，使得农作物显著增产。因而，本发明的简单芽抱杆菌是具有广泛应用前景的简单芽 抱杆菌新菌株，可W用于制备防治多种植物病害的生物防治制剂。
[0035] 2、菌株鉴定
[0036] (