分离纯化葛根素的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药技术领域，涉及一种分离纯化葛根素的方法，特别是涉及一种以 高回收率、高生产效率制备高纯度葛根素的方法。
【背景技术】
[0002] 葛为多年生豆科缠绕藤本植物，侧蔓和须根多，但块根深生，呈纺锤形或长棒形， 表皮为淡黄色，有皱裙，是主要食用和药用部分。葛根为野葛Pueraria Lobata(Willd) Ohwi或粉葛P.thomsomi Benth的干燥根。葛根作为常用中药，始载于《神农本草经》，列为 中品，历代以来本草均有记载，味甘、辛、性平，具有解肌退热、生津、透疹、温阳止泻、提高机 体免疫力等功能。目前，葛根广泛用于改善心脑血管、治疗感冒、糖尿病、腹泻等中药复方 制剂中，用量极大，是制剂的重要成分。葛根含有异黄酮类、三萜类、芳香类等活性成分。其 中异黄酮类化合物是葛根的主要化学成分，而葛根素（Puerarin)是葛属植物的特有成分， 亦为主要有效成分。葛根素的药理作用十分广泛，具有降血脂，抗炎，抗心律失常、对心肌缺 血的保护作用、扩张冠状动脉血管、肾保护、抗氧化、抗缺血再灌注损伤、抗肝缺血再灌注损 伤、抗酒精中枢抑制、调控骨代谢、降血糖、利尿、降低血压、防治高血压头晕、头痛、颈项疼 痛等作用。葛根素的化学结构式如下式所示：
[0003]
[0004] 随着葛根素的药理作用的研究深入，葛根素的分离纯化也越来越受到人们的重 视。目前葛根素纯化方法主要有：大孔吸附树脂法、柱层析、酸水解有机溶剂萃取法及金属 离子络合法等。
[0005]目前大部分企业提取葛根中葛根素时都采用传统生产方法，具体操作如下。
[0006] 1.葛根预处理：葛根清洗-烘干-粉碎。
[0007] 2.提取方法，通常有三种，具体如下。
[0008] 2. 1超声辅助提取法：易根粉一超声提取一过滤一减压浓缩一过柱一水洗一醇洗 -减压浓缩一真空干燥一葛根素粗提物。
[0009] 2. 2水提取法：葛根干粉一水提取一过滤，得滤液和渣一用浓度5%的NaOH水溶 液再提取渣一过滤，得滤液一合并两次的滤液一减压浓缩一调PH值一离心分离一滤液上 硅胶柱一水洗一95%乙醇洗脱一洗脱液减压浓缩至干一葛根素。
[0010] 2. 3醇提法：葛根干粉一乙醇回流提取一过滤，得滤液和渣一渣再乙醇回流提取 -过滤一合并两次的滤液一减压浓缩一离心分离一调滤液的PH值一再过滤一滤液浓缩至 干一葛根素。
[0011] 以上提取葛根素的方法，虽能得到葛根素粗提物，但操作周期长，工艺复杂，收率 也不高，经检测所得的葛根素的含量也不高；最主要的是葛根中含有大量的淀粉不能得到 充分利用，造成了资源的浪费。
[0012] 此外，有诸多专利文献在分离纯化葛根素方面付出了巨大努力。例如，中国专利申 请公开号CN1154849A采用正丁醇萃取后经三氧化二铝柱脱色得到纯度97%以上的葛根素 产品；中国专利申请公开号CN1927876A经过离子交换大孔树脂层析再经过大孔树脂层析 可以获得葛根素含量很高的葛根素提取物；中国专利申请公开号CN1398872A通过大孔吸 附树脂及硅胶柱层析可得到高纯度葛根素。
[0013] 中国专利申请公开号CN 103709152 A(201310729209. 7)公开了一种葛根素的分 离纯化方法，包括以下步骤：以乙酸乙酯、正丁醇和水组成的三元溶剂体系为分离溶剂体 系，采用高速离心分配色谱法对葛根素提取物进行分离纯化得到葛根素即可；所述的高速 离心分配色谱法在高速离心分配色谱仪中进行；据信该发明的葛根素的分离纯化方法步骤 简单、分离时间短、分离能力强、分离到的葛根素纯度高（HPLC纯度大于99% )、回收率高 (大于65% )。
[0014] 尽管据信现有技术能够得到较高纯度的葛根素，然而这些现有技术的生产效率是 相当低的，通常难以满足工业生产的要求。为此，本领域仍然期待有新的分离纯化葛根素的 方法，以其高效地获得高纯度的葛根素。
【发明内容】
[0015] 本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中葛根素的分离方法步骤繁琐、 分离时间长、分离能力差、分离到的葛根素纯度差、回收率低等缺陷，和/或为了提高生产 效率，而提供了一种葛根素的分离纯化方法。本发明的葛根素的分离纯化方法步骤简单、 分离时间短、分离能力强、分离到的葛根素纯度高（HPLC纯度大于99%)、回收率高（大于 65% )，特别是，本发明方法具有显著更高的生产效率。本发明方法具有良好的市场开发前 景。
[0016] 在本发明的第一方面，本发明提供了一种分离纯化葛根素的方法，其包括以下步 骤：以乙酸乙酯、正丁醇和水组成的三元溶剂体系为分离溶剂体系，采用高速离心分配色谱 法对葛根素提取物进行分离纯化，得到葛根素；所述的高速离心分配色谱法在高速离心分 配色谱仪中进行。
[0017] 根据本发明第一方面的方法，所述的高速离心分配色谱仪优选厂家为法国 Rousselet Robatel型号为FCPC A或FCPC C的高速离心分配色谱仪。下文各种实施例中 如未另外说明，使用的是法国Rousselet Robatel型号为FCPC A的高速离心分配色谱仪。
[0018] 根据本发明第一方面的方法，所述的高速离心分配色谱仪的转速优选ISOOr/ min ~2300r/min〇
[0019] 根据本发明第一方面的方法，所述的三元溶剂体系中乙酸乙酯、正丁醇和水的体 积比优选（3~8) :2 : (6~10)，进一步优选2 :1 :3。在一个实施方案中，所述三元溶剂体 系中添加了有机酸，该有机酸在该三元溶剂体系中的浓度为0. 1~0.5% (体积/体积百 分比，在本文中涉及该有机酸的浓度时均是指体积/体积百分比）。优先地，该有机酸在该 三元溶剂体系中的浓度为0. 2~0. 4%，例如0. 3%。在一个实施方案中，所述选自甲酸、乙 酸、丙酸、丁酸。已经出人意料地发现，在所述三元溶剂体系中添加微量的特定有机酸后，可 以以高载药量进行分离纯化并获得高收率、高纯度的葛根素，从而大大提高了生产效率。
[0020] 根据本发明第一方面的方法，本发明中，所述的高速离心分配色谱法优选将高速 离心分配色谱法所采用的三元溶剂体系充分混合后分层，取下层溶液为固定相，上层溶液 为流动相。进一步优选将固定相和流动相用过滤后超声备用，所述的过滤优选采用微孔 滤膜过滤，所述的滤膜的孔径可以为〇. 3 μπι~0. 5 μπι，所述的超声的时间优选15min~ 30min。所述的超声的频率优选16KHz~28KHz。
[0021] 根据本发明第一方面的方法，所述的高速离心分配色谱法，优选将葛根素提取物 溶解于上述固定相和流动相形成的混合溶液中，过滤后上样；所述的固定相和流动相形成 的混合溶液中所述的流动相与所述的固定相的体积比优选1 :1~1 :5,例如1 :4。所述的 过滤优选采用微孔滤膜过滤，所述的滤膜的孔径可以为〇. 3 μ m~0. 5 μ m (下文具体的实例 中，如未另外说明，使用的是〇. 45um膜）。
[0022] 根据本发明第一方面的方法，所述的葛根素提取物可以为采用普通超声提取法、 循环超声提取法或者回流提取法得到的葛根素提取物。
[0023] 根据本发明第一方面的方法，所述的葛根素提取物的纯度可以为10%~20%，优 选15%~18%，所述的纯度是指葛根素的质量占葛根素提取物总质量的百分比。
[0024] 根据本发明第一方面的方法，所述的高速离心分配色谱仪的流速为2. OmL/min~ 7. OmL/min，优选2. OmL/min~3. OmL/min ;所述的流速是指每分钟内通过的流动相的体积。
[0025] 根据本发明第一方面的方法，所述的高速离心分配色谱仪的上样浓度优选IOmg/ mL~60mg/mL ;所述的上样浓度是指葛根素提取物的质量与流动相的体积的比例。
[0026] 根据本发明第一方面的方法，所述的葛根素分离纯化方法，优选包括以下步骤：
[0027] 步骤1 :将三元溶剂体系充分混合后分层，取下层溶液为固定相、上层溶液为流动 相；将葛根素粗品溶解于固定相与流动相的混合溶液中，形成葛根素提取物的溶液；
[0028] 步骤2 :高速离心分配色谱仪在递减（descending)模式下充满固定相；转换成递 增（ascending)模式后，再将流动相栗入离心分配色谱仪内；待体系平衡完毕后，由进样阀 注入步骤1中制得的葛根素提取物的溶液，然后根据检测器图谱接收目标组分即可。
[0029] 根据本发明第一方面的方法，所述步骤1中，优选将所述的固定相和流动相过 滤后经超声处理后再用；所述的过滤优选通过微滤膜过滤，所述的滤膜的孔径可以为 0. 45 μπι。所述的超声的频率优选16KHz~28KHz，所述的超声的时间优选15min~30min。