3使用由此配制的三元溶剂系统和固定相、流动相进行试验。
[0053] (3)回收率计算公式
[0054] 回收率=分离的得到的葛根素单体的质量/进样样品中含有的葛根素的总质 量 X 100%
[0055] 实施例2
[0056] 将实施例1制得的纯度为17. 5 %的葛根素提取物溶解于混合的溶液（流动相/固 定相=1/4)中，制成浓度为10mg/mL的样品溶液，0.45 μ m微滤膜过滤后备用；高速离心分 配色谱仪中在递减模式下以流速8. OmL/min，转速600r/min充满固定相；转换成递增模式， 提高转速至2200r/min后再将流动相以2mL/min的流速栗入色谱仪；待体系平衡完毕后，由 进样阀注入样品溶液，然后根据检测器图谱接收目标物葛根素组分，在压强-0.0 IMPa，温度 70°C下进行浓缩；设定压强0. 08MPa，温度65°C进行干燥，制得葛根素单体。
[0057] 使用以下高效液相色谱法，对本实施例2分离纯化前所用的作为原料的葛根素提 取物、以及最终制得的葛根素单体进行葛根素纯度检测：所述的高效液相色谱的色谱条件 为：Capcell Pak C18 色谱柱（250_Χ4·6_，5μηι);以甲醇：水=25 :75(v/v)的混合溶剂 为流动相；流速lmL/min ;柱温：30°C;检测波长：250nm。结果显示：原料的葛根素提取物中 葛根素 HPLC纯度为17. 5%，制得葛根素单体HPLC纯度为99. 3%，回收率67%。
[0058] 这表明本发明方法具有良好的回收率且产物纯度高。
[0059] 实施例3
[0060] 将实施例1制得的纯度为16. 4%的葛根素提取物溶解于混合的溶液（流动相/ 固定相=1/4)中，制成浓度为20mg/mL的样品溶液，孔径为0. 45 μπι的微滤膜过滤后备 用；高速离心分配色谱仪中在递减模式下以流速8. OmL/min，转速800rpm充满固定相；转 换成递增模式，提高转速至1800rpm后再将流动相以2mL/min的流速栗入色谱仪；待体系 平衡完毕后，由进样阀注入样品溶液，然后根据检测器图谱接收目标物葛根素组分，在压 强-0.0 IMPa，温度70°C下进行浓缩，设定压强0. 08MPa，温度65°C进行干燥后，制得葛根素 单体。
[0061] 使用实施例2所述HPLC法，对分离纯化前所用的作为原料的葛根素提取物、以及 最终制得的葛根素单体进行葛根素纯度检测。结果显示：原料的葛根素提取物中葛根素 HPLC纯度为16. 4%，制得葛根素单体HPLC纯度为996%，回收率64%。与实施例2类似， 可在约20分钟的时间内完成一批样品的色谱分离纯化。
[0062] 对比实施例1
[0063] 采用实施例2中的相同的葛根素提取物和溶剂体系，将纯度为17. 5%葛根素提 取物溶解于混合的溶液（流动相/固定相=1/4)中，制成浓度为lOmg/mL的样品溶液， 0.45 μ m微滤膜过滤后备用；采用乙酸乙酯/正丁醇/乙醇/水（4:0.6:0.6:5)为溶剂体 系，转速2200r/min，流速2. OmL/min，按照实施例2中的步骤进行高速离心分配色谱分离纯 化并进一步浓缩干燥，制备得到葛根素精制品。
[0064] 使用实施例2所述HPLC法，对制得的葛根素精制品进行葛根素纯度检测。结果 显示：原料的葛根素提取物中葛根素 HPLC纯度为17. 5%，制得葛根素精制品HPLC纯度为 94. 7%，回收率51%。这表明，与实施例2使用的三溶剂体系相比，四溶剂体系所得产物纯 度明显偏低，且收率也明显地偏低。
[0065] 对比实施例2
[0066] 采用实施例2中的相同的葛根素提取物和溶剂体系，将纯度为17. 5%的葛根素提 取物溶解于混合的溶液（流动相/固定相=1/4)中，分别制成浓度为35mg/mL和50mg/mL 的样品溶液，0.45 μπι微滤膜过滤后备用；采用乙酸乙酯/正丁醇/水（2:1:3)溶剂体系， 转速2200r/min，流速2. OmL/min，按照实施例2中的步骤进行高速离心分配色谱分离纯化 并进一步浓缩干燥，制备得到葛根素精制品。
[0067] 使用实施例2所述HPLC法，对制得的葛根素精制品进行葛根素纯度检测。结果显 示：
[0068] 原料的葛根素提取物中葛根素 HPLC纯度为17. 5% ;
[0069] 提取物以35mg/mL浓度上样所得葛根素精制品HPLC纯度为93. 8 %，回收率40 %;
[0070] 提取物以50mg/mL浓度上样所得葛根素精制品HPLC纯度为92. 2 %，回收率33 %。
[0071] 当提尚上样浓度时有利于提尚生广效率。然而上述结果表明，当提尚上样浓度时， 产品的纯度和回收率均会明显地降低。并且呈现上样浓度越高所得产品纯度越低、回收率 亦更低的趋势。
[0072] 对比实施例3
[0073] 本例采用高速逆流色谱分离仪纯化葛根素与本发明的高速离心分配色谱分离仪 纯化葛根素作对比。
[0074] 采用实施例2中的相同的葛根素提取物和溶剂体系，将纯度为17. 5%的葛根素提 取物溶解于混合的溶液（流动相/固定相=1/4)中，制成浓度为lOmg/mL的样品溶液，孔 径为0. 45 μ m的微滤膜过滤后备用；以8mL/min的流速将固定相充满高速逆流色谱仪中，将 转速调节为800r/min，在tail-to-head模式下，以2mL/min的流速栗入流动相，待平衡后， 由进样阀注入浓度为10mg/mL的样品溶液，然后根据检测器图谱接收目标物葛根素成分， 接着进一步浓缩干燥，制备得到葛根素精制品。
[0075] 使用实施例2所述HPLC法，对制得的葛根素精制品进行葛根素纯度检测。结果显 示：
[0076] 采用上述高速逆流色谱法所得葛根素精制品纯度仅83. 2%、回收率仅为49%，并 且色谱分离纯化一批试样所用时间达40分钟以上；然而如上文实施例2所述的，在约20分 钟的分离纯化时间内，可实现产品纯度达99%以上，回收率达60%以上的优异效果。
[0077] 溶剂系统的准备：将乙酸乙酯、正丁醇和水按体积比2 :1 :3混合，再向该混合液中 加入0.3% (体积/体积百分比）甲酸，混合，成为三元溶剂系统；将该三元溶剂系统置于分 液漏斗中，充分振摇后静置分层，取下层溶液作为固定相、上层溶液作为流动相，将固定相 和流动相用微孔滤膜（0. 45um)过滤后，超声（20KHZ) 15min备用。以下实施例4、5、6、7使 用由此配制的三元溶剂系统和固定相、流动相进行试验。
[0078] 实施例4
[0079] 将实施例1制得的纯度为17. 5 %的葛根素提取物溶解于混合的溶液（流动相/固 定相=1/4)中，制成浓度为10mg/mL的样品溶液，0.45 μ m微滤膜过滤后备用；高速离心分 配色谱仪中在递减模式下以流速8. OmL/min，转速600r/min充满固定相；转换成递增模式， 提高转速至2200r/min后再将流动相以2mL/min的流速栗入色谱仪；待体系平衡完毕后，由 进样阀注入样品溶液，然后根据检测器图谱接收目标物葛根素组分，在压强-0.0 IMPa，温度 70°C下进行浓缩；设定压强0. 08MPa，温度65°C进行干燥，制得葛根素单体。
[0080] 使用实施例2所述HPLC法，对分离纯化前所用的作为原料的葛根素提取物、以及 最终制得的葛根素单体进行葛根素纯度检测。结果显示：原料的葛根素提取物中葛根素 HPLC纯度为17. 5%，制得葛根素单体HPLC纯度为99. 5%，回收率73%。与实施例2类似， 可在约20分钟的时间内完成一批样品的色谱分离纯化。
[0081 ] 这表明本发明方法具有良好的回收率且产物纯度高。
[0082] 实施例5
[0083] 将实施例1制得的纯度为16. 4%的葛根素提取物溶解于混合的溶液（流动相/ 固定相=1/4)中，制成浓度为20mg/mL的样品溶液，孔径为0. 45 μπι的微滤膜过滤后备 用；高速离心分配色谱仪中在递减模式下以流速8. OmL/min，转速800rpm充满固定相；转 换成递增模式，提高转速至1800rpm后再将流动相以2mL/min的流速栗入色谱仪；待体系 平衡完毕后，由进样阀注入样品溶液，然后根据检测器图谱接收目标物葛根素组分，在压 强-0.0 IMPa，温度70°C下进行浓缩，设定压强0. 08MPa，温度65°C进行干燥后，制得葛根素 单体。
[0084] 使用实施例2所述HPLC法，对分离纯化前所用的作为原料的葛根素提取物、以及 最终制得的葛根素单体进行葛根素纯度检测。结果显示：原料的葛根素提取物中葛根素 HPLC纯度为16. 4%，制得葛根素单体HPLC纯度为99. 4%，回收率71 %。与实施例2类似， 可在约20分钟的时间内完成