一种用于以荧光pcr检测样品中肉毒杆菌的引物对、探针和包含其的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于检测肉毒杆菌、特别是A型核苷酸片段的引物和探针序列， 以及包含所述引物和探针序列的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 肉毒杆菌在自然界分布广泛，土壤中常可检出，偶亦存在于动物粪便中。根据所产 生毒素的抗原性不同，肉毒杆菌分为A、B、Ca、Cb、D、E、F、G这8个型，能引起人类疾病的有 A、B、E、F型，其中以A、B型最为常见。
[0003] 肉毒杆菌是一种生长在缺氧环境下的细菌，在罐头食品及密封腌渍食物中具有极 强的生存能力。摄食含肉毒杆菌的食品，例如pHM. 6的低酸性罐头食品（含铁罐、玻璃罐） 以及香肠、火腿，会引发食物中毒。其原因在于，肉毒杆菌是一种致命病菌，在繁殖过程中分 泌毒素（肉毒毒素），该毒素是毒性最强的毒素之一。人们食入和吸收这种毒素后，神经系 统将遭到破坏，出现头晕、呼吸困难和肌肉乏力等症状。
[0004] 肉毒毒素是已知最剧烈的毒物，毒性比KCN强一万倍，是细菌类毒素中毒性最强 的"毒王"。纯化结晶的肉毒毒素 Img即能杀死2亿只小鼠，对人的致死剂量约为0. 1 μ g。 上个世纪，战争狂人使用肉毒毒素作生物武器，它能阻断神经信号的传导，中毒症状以对称 性颅神经损害症状为特征，如视力模糊、眼睑下垂、瞳孔散大、语言障碍、吞咽困难、呼吸困 难，继续发展可由于呼吸肌麻痹引起呼吸功能衰竭而死亡。
[0005] 肉毒毒素与典型的外毒素不同，其并非由生活的细菌释放，而是在细菌细胞内产 生无毒的前体毒素，待细菌死亡自溶后游离出来，经肠道中的胰蛋白酶或细菌产生的蛋白 酶激活后方始具有毒性，且能抵抗胃酸和消化酶的破坏。肉毒毒素对酸的抵抗力特别强，胃 酸溶液24小时内不能将其破坏，故可被胃肠道吸收。并且，肉毒毒素作为一种神经毒素，能 透过机体各部的粘膜。肉毒毒素由胃肠道吸收后，经淋巴和血行扩散，作用于颅脑神经核和 外周神经肌肉接头以及植物神经末梢，阻碍乙酰胆碱释放，影响神经冲动的传递，导致肌肉 的松弛性麻痹。若抢救不及时，病死率很高。
[0006] 上世纪80年代在一项研究中，美国科学家们发现，1岁以下的孩子，喝了蜂蜜、或 者有蜂蜜配方的奶粉，产生了肉毒毒素中毒的症状。科学界推测，孩子中毒，可能因为蜜蜂 采集蜂蜜的过程，携带了带有芽孢的肉毒杆菌；也有可能是孩子到处跑，无意中直接吃到了 带有芽孢肉毒杆菌的土壤。
[0007] 随着分子生物学技术的发展，普通PCR方法已经广泛应用于临床诊断，但该技术 需要对PCR产物进行后处理，极易导致PCR产物污染，同时有一定的非特异性扩增。而荧 光PCR技术则是在普通PCR技术的基础上，在扩增反应体系中加入一对特异性引物的同时 再加入一个特异性的荧光探针，使用实时监测的荧光PCR检测仪来检测靶核苷酸序列的技 术。除了具有普通PCR的优点外，它还具有以下优点：（1)特异性更强，灵敏度更高。由于多 使用了一条可与模板互补配对的荧光探针，提高了特异性，并且由自动化仪器收集荧光信 号，避免了人工判断的主观性，又可进一步提高灵敏度；（2)全封闭反应，在线式实时监测 荧光，无须PCR产物的后处理，避免污染，保证了结果的可靠性；(3)数据分析选在核酸扩增 的对数期，摈弃普通PCR方法的受多因素干扰的终点分析法，使得定量更准确可靠；(4)可 实现单管双检或多检，还可设计针对性内标，监控抽提效率及排除抑制剂干扰；（5)不接触 有毒试剂，操作安全；（6)有利于规模化、自动化及联网管理；（7)适用范围更广，理论上可 检测任何病毒的核酸。
[0008] 现在的食品安全问题让人十分的担忧，其中令人最担忧的是奶制品中可能会含肉 毒杆菌，尤其是芽孢。因此，目前针对肉毒杆菌，还需要开发新的灵敏度高的荧光PCR检测 引物、探针以及相应的检测产品，特别是A型检测产品。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是提供一种用于检测肉毒杆菌核苷酸片段的引物和探针序列。
[0010] 本发明的另一个目的是提供一种用于以荧光PCR检测样品中肉毒杆菌的试剂盒。
[0011] 基于上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0012] -方面，本发明提供一对核苷酸序列，其可用作检测肉毒杆菌的引物对，所述引物 对由上游引物和下游引物组成，上游引物（本文中又称为"BontA-PF"）包含SEQ ID NO. 1 所示的核苷酸序列，下游引物（本文中又称为"BontA-PR"）包含SEQ ID NO. 2所示的核苷 酸序列：
[0013] SEQ ID NO. 1TACTCAATACATTAGATTTAGCCCACT ；
[0014] SEQ ID NO. 2GCATGTATAAGTTCATGTGCTAATGGT〇
[0015] 优选地，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述下游引物的核苷酸 序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0016] 另一方面，本发明提供一个核苷酸序列，其可用作检测肉毒杆菌的探针，所述探针 (本文中又称为"BontA-PB"）包含SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列：
[0017] SEQ ID NO. 3TATCAACTTCAAGTGACTCATC。
[0018] 优选地，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0019] 并且，所述探针的3'端标记有荧光淬灭基团，所述荧光淬灭基团为BHQl或TAMRA， 优选BHQl ;所述探针的5'端标记有荧光报告基团，所述荧光报告基团为FAM或R0X，优选 FAM0
[0020] 此外，上述引物对和探针用于检测肉毒杆菌，所述肉毒杆菌优选为A型（BontA)
[0021] 采用上述引物对和探针检测肉毒杆菌的检测原理是利用上述一对特异性引物和 一个特异性荧光探针，采用耐热DNA聚合酶（Taq酶）、ung酶、四种核苷酸单体（dNTP)等成 分，并应用PCR技术实现待测定肉毒杆菌靶核苷酸序列的核酸片段扩增。其中，所使用的探 针为两端分别标记荧光报告基团（R)和荧光淬灭基团（Q)的寡核苷酸。在探针完整时，报 告基团发射的荧光信号被淬灭基团所吸收，而在PCR扩增过程中，Taq酶的5'端外切酶活 性将特异性结合在靶核苷酸片段上的荧光探针酶切降解，使荧光报告基团游离于反应体系 中。由于脱离了荧光淬灭基团的屏蔽作用，该荧光报告基团的荧光信号就可以由仪器检测 到，并且荧光信号量的变化与扩增产物量成正比，从而判定待测样本中靶核苷酸序列的存 在。
[0022] 另一方面，本发明还提供用于以荧光PCR检测样品中肉毒杆菌的试剂盒。该试剂 盒可以用于以荧光PCR反应快速、灵敏地检测样品中是否存在肉毒杆菌，即检测样品是否 感染了肉毒杆菌。
[0023] 具体而言，本发明的试剂盒包括：
[0024] (1)本发明提供的上文所述的引物对；
[0025] (2)本发明提供的上文所述的探针；
[0026] 优选地，所述试剂盒还包括：
[0027] (3) dNTPs (含 dUTP);
[0028] (4) PCR反应缓冲液；
[0029] (5) Mg2+;
[0030] (6) Taq 酶；
[0031] (7) UNG 酶。
[0032] 进一步优选地，所述试剂盒还包括：
[0033] (8)肉毒杆菌DNA提取液。本领域已知肉毒杆菌DNA的提取方法与所采用的试 剂。根据本发明的【具体实施方式】，可以采用自配的DNA提取试剂，其包含异硫氰酸胍4. 5M/ L、EDTA2NA 20mM/L、TRISBASE 50mM/L、TRI0N-X100 1% ;
[0034] (9)阴性质控品，为水，优选为DEPC水；
[0035] (10)阳性质控品，为灭活毒株，优选为BontA灭活毒株。
[0036] 在采用本发明提供的试剂盒进行肉毒杆菌检测时，PCR扩增的反应体系以25 μ 1 计包含：
[0037] (1)所述引物对的上游引物和下游引物各0· 3 μ mol/L ;
[0038] (2)所述探针 0· 15 μ mol/L ;
[0039] (3) dNTPs (含 dUTP) 0· 2mmol/L ;
[0040] (4) PCR反应缓冲液，终浓度I X ;
[0041] (5)Mg2+3mmol/L ；
[0042] (6) Taq 酶 2U ;
[0043] (7) UNG 酶 0· 04U ;
[0044] (8)水，优选为DEPC 7K，在加入DNA模板后补至25 μ 1。
[0045] 本文提供的上述试剂盒用于检测肉毒杆菌，所述肉毒杆菌优选为A型。
[0046] 在检测时，所述PCR的反应条件为：
[0047] 37°C 5分钟；然后是：95°C 3分钟，1个循环；95°C 5秒，60°C 40秒，40个循环。
[0048] 本文提供的试剂盒可以检测的样品选自奶粉、蛋白粉、奶粉生产原料、罐头食品 (含铁罐、玻璃罐）、香肠、火腿等食品。例如适用于奶粉、蛋白粉、奶粉生产原料等样本。
[0049] 本文提供的试剂盒的检测原理是，利用上述一对特异性引物和一个特异性荧光探 针，在包含UNG酶、耐热DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸以及镁离子等PCR反应缓冲液中， 扩增待检测样品中的肉毒杆菌，通过多种市售荧光PCR扩增仪实现靶核苷酸的循环扩增， 从而快速、灵敏地检测样品中的肉毒杆菌。
[0050] 与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：
[0051] (1)本发明分别对所有已知的肉毒杆菌A型基因组序列进行比较分析，选择无二 级结构且高度保守的区段进行引物和探针的设计，避免了假阴性结果的产生。
[0052] (2)本发明提供的引物和探针的检测灵敏度可达1000个拷贝/ml，说明其具有良 好的灵敏度。
[0053] (3)本发明提供的引物和探针对于不含有肉毒杆菌A型的检测样本均无扩增信 号，说明其具有良好的特异性。
[0054] (4)由于本发明采用荧光PCR技术作为检测方法，整个反应均在封闭的反应管内 进行，避免了其他核酸检测方法如PCR -电泳等易于形成气溶胶污染而造成假阳性结果。 并且，由于对PCR产物进行实时监测，大大节省了监测时间，节约了人力物力。
[0055] (5)本发明提供的包含上述引物和探针的试剂盒，可以用于快速、高通量检测肉毒 杆菌，大大缩短检测周期，为疾病的治疗和疫情的控制提供保证。特别是，该实时荧光试剂 盒可以进行原料检查，由此对实物原料做出相应的灭菌方案，防患于未然。
【附图说明】
[0056] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
[0057] 图1显示了实施例2中检测肉毒杆菌A型阳性样品的灵敏度的荧光PCR扩增图。
[0058] 图2显示了实施例3中利用本发明试剂盒检测的阳性样本的荧光PCR扩增图。
【具体实施方式】
[0059] 以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅 用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
[0060] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药 材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
[0061] 实施例1引物和探针设计以及反应体系的建立和优化
[0062] 1.引物和探针设计：
[0063] 通过分别对所有已知的肉毒杆菌A型基因组序列进行比较分析，选择无二 级结构且高度保守的区段，设计多对引物和探针，引物长度一般为20个碱基左右， 引物间和引物内无互补序列。最优引物、探针序列组合如下：上游引物BontA-PF : TACTCAATACATTAGATTTAGCCCACT ；
[0064] 下游引物 BontA-PR :GCATGTATAAGTTCATGTGC