巧和Szymkowski， DrugDiscoveryToday, 2009Dec； 14 (23-24))〇
[0064] 同源六聚体可任选地通过形成共价键、非共价键或其组合而形成。任选地，至少 下述组分1蛋白形成二硫键作为同源六聚体形成过程一部分：CD28、CTLA4、TYR0BP、IC0S、 VEGFA、CSF1、VEGFB、BMP2、BMP3、GDNF、PDGFC、PDGFD、TGFB1、LY96、CD96 和GFER。
[0065] 关于组分1蛋白的另外的信息提供在下面表1中。该信息包括与结合和相互作用 伴侣相关的细节、与结合运样的结合和相互作用伴侣和/或与运样的结合和相互作用伴侣 相互作用相关的生物机制，和组织特异性。为组分2蛋白提供了类似的表，即表2。
[0066] 应当注意在下面（和为上面的实施方式）W多种类型的功能列举了TYR0BP，因为 其是具有双功能的信号传导接头。尽管与数个受体相关，但是其可激活在介导针对细菌和 病毒感染和肿瘤的免疫应答中起关键作用的效应细胞功能。TYROBP也可负调节免疫应答， 包括NK细胞和巨隧细胞并且可在限制通过TLR和Fc邸Ig途径介导的细胞因子产生中起重 要的作用。
[0067] 表1 -紀分1帝白巧巧作用，功能巧紀织特择忡
[0068]
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[00 巧]
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[0082] 表2-紀分2帝白巧巧作用，功能巧紀织特择忡
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[0088]
[0089]
[0090]
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[0093] 表3提供了用于确定哪种组分1和组分2蛋白可作为伴侣的描述。具体而言，表 3列出了各种疾病病征，随后是组分1活性并且然后是组分1蛋白，随后组分2活性和作用 组分1蛋白的伴侣的组分2蛋白。
[0094] 根据本发明的至少一些实施方式，对于每种疾病病征，在行中任何列出的组分1 蛋白可伴随该行中任何列出的组分2蛋白。但是，该列表仅意在图解的目的，并不旨在W任 何方式进行限制。此外，W下描述的组合可任选地用于治疗其他（可选的或另外）疾病，而 W下疾病可任选地用其他（可选的或另外）组合治疗。
[0095] 表 3
[0096]
[0097]
[0098] CTLA4-FasL作为同源六聚体SCP融合蛋白的非限制性例子
[0099] 如本文所描述，许多不同组分1和组分2蛋白W及其功能部分可任选地形成具有 稳定同源六聚体形式的融合蛋白。CTLA4-FasL融合蛋白是运种融合蛋白的非限制性例子， W下描述了其详细实验方法和结果。但是，本发明人相信，其他组分1和组分2蛋白（和其 功能部分）将形成显示至少类似行为的SCP融合蛋白。
[0100] 材料和方法
[0101]CH0-S生产克隆的构建和分离
[0102] 通过使用Invitrogen'SVectorNTI软件将图1A的CTLA4-FasL氨基酸序列（包 括信号肤，SEQIDN0:2)'回译'为DNA。添加人尿激酶信号肤（NM_002658)的DNA序列W 及5'非翻译序列，并且使用信号肤-切割预测程序（信号P-HMM)确认正确的切割-位点。 DNA序列进行密码子优化W用于C册（灰仓鼠）中的表达，调节负元件和GC含量W潜在地增 加哺乳细胞中的表达。然后通过GE肥ART合成选择的DNA序列并且克隆至包含表达载体的 UC0E(Antoniou等，Genomics. 2003S巧；82 (3) : 269-79)。完整的测序和限制分析显示表达 载体中期望的DNA序列和正确的基因定向。
[0103] CTLA4-FasL氨基酸序列（SEQIDN0:1)
[0104] AMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTG TSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVID阳PCPDSGSLEKQIGHPSPPPEKKELRKV AHLTGKSNSRSMPLE肥DTYGIV化SGVKYKKGGLVI肥TGLYFVYSKVYFRGQSCNNLPL甜KVYMRNSKYP孤LV MMEGKMMSYCTTGQMWARSSYLGAVFNLTSADHLYVNV沈LSLVN阳ESQTFFGLYKL
[0105] 用UC0E/CTLA4-FasL表达载体转染CHO-S细胞，其显示在图IB中，用限制酶Pvul 线性化，并且再悬浮在无菌水中，然后使用Amersham GFX柱纯化。CH0-S细胞在CD-C册培 养基中生长，并且用使用DMRIE-C作为转染剂的30微克线性化DM转染。在转染二十四小 时之后，收获细胞库，并且再悬浮在20mL的Mix6培养基（CD-CHO/培养基5mix)中，嚷岭霉 素为12. 5微克/mL。然后细胞保持进行约lxl〇e/mL的嚷岭霉素选择，周期性改变培养基， 直到活力恢复至大于95%并且足够的细胞可用于产生许多冷冻的小瓶的每种培养物（冷 冻为IxloVmL)。在1周生长之后，去除上清液样品并且通过商购的化sL化IS试剂盒量化 CTLA4-FasL〇
[0106] 然后，具有最高表达的克隆扩展至50巧m条件的125ml摇床烧瓶中的10mlMix6， 并且维持嚷岭霉素选择。在4天W后，摇床速度增加至1(K)巧m，并且W有规律间隔计算细 胞活力，并且按需要扩展。在标准非补充培养基条件下W小规模在125ml摇床烧瓶中对克 隆进行表达分析。维持培养物，直到细胞活力接近80 %，并且然后通过化sLELISA评估表 达水平。通过SDS-PAGE和蛋白印迹分析蛋白产物，其显示所有克隆产生相似尺寸的蛋白产 物，并且显示最高水平的表达的一种克隆被选择用于限制性稀释。在间隔7天的两个不同 时机进行限制性稀释；在第一接种时机，细胞W每孔800、400、200、100、50、25和10个细胞 的细胞/孔比在50%条件培养基中被接种在96孔板中。基于第一接种比的化sLELISA分 析，细胞被稀释至每个孔50、25、12. 5、6. 25、3. 13、1. 56和0. 78个细胞的较低接种密度。在 化raCell培养箱中解育96-孔板2-3周，在此所有的板通过视觉评估其生长。从96孔板选 择具有最低接种细胞密度的克隆并且转移至24孔板，并且在细胞培养基W1:10稀释。在 培养7天之后，收获并通过化ISA分析细胞悬浮液，并且十个最高生产克隆从24孔板被转 移至6孔板，在细胞培养基中W1:4稀释。当在6孔板中接收到足够的细胞时，该十个克隆 从6孔板被转移至125mL摇床烧瓶，并且研究其生长曲线和CTLA4-FasL表达。基于该分析 选择一个克隆作为最终克隆。
[0107]SDS-PAGE和蛋白印迹
[0108]通过使用 4-12%Bis-Tris凝胶（1mm，12 孔，NP0322B0X，LifeTechnologies)和 "SeeBluePlus2"MW标记物化巧925，LifeTechnologies)进行十二烷基硫酸钢聚丙締 酷胺凝胶电泳（SDS-PAGE)。蛋白被转移至PVDF-膜，并且使用奶粉封闭膜。一抗为山羊 抗人CTLA4 抗体（AF-386-PB，RamlDsystems, 1:300 稀释）或山羊抗人Fas配体（AB126， Ran曲systems, 1:100稀释）。二抗为驴抗绵羊/山羊免疫球蛋白（HRP，AP360,结合位点， 1:10, 000稀释），通过HRP底物3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺灯MB，用于膜的液体底物系统， T0565,Sigma)检测。
[0109] 对于细胞内蛋白的蛋白印迹分析，整个细胞裂解物在10%SDS-PAGE上被分离并 且根据标准程序被印迹。
[0110] 用下述一抗解育膜：抗半脫天冬酶-3、抗半脫天冬酶-8、抗半脫天冬酶-9、 PARP、Bcl-2、IAP-1, 2、pNFkB、pJNK、pE服1/2 (1:1000) (Cell Si即aling Technology, Danvers, MA，美国）；XIAP (1:100) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA，美国）； FLIP (1:500)巧nzo,CA，美国）；BID (1:4000)，IkB (1:20, 000) (RaiKlD，Minneapolis, MN，美 国）巧cl-x(1:1000)度D Biosciences'NJ，美国）；GAPDH(1:500 ;Millipore，Billerica, MA，美国）。用HRP-结合抗体（l:10,000;Biorad，Hercules，CA，美国）进行二次检测。
[01 川根据制造商方案，用化tivePAGETMNovex⑧ 4-16%Bis-Tris凝胶（Invitrogen) 进行天然-PAGE分析。样品被制备为有和没有G-250样品添加剂。lOuL的CTLA4-FasL样 品和化tiveMark被装载至每条凝胶泳道。考马斯（Coomassie)G-250被添加至阴极缓冲液 和样品，使得在凝胶电泳期间进行蛋白的染色。
[0112] Con-A/SEC纯化方法
[0113]W5000xg离屯、融化的生产收获物，随后0.2ym过滤（lOkDa截取纤维素离屯、过 滤器；Sartorius-Stedim，Goettingen,德国）并且W7mg/mL树脂装载至伴刀豆球蛋白-A 上（ConA)(GEHealthcare,LittleQialfont，UK)。Con-A洗出液被装载至尺寸排阻色 谱（SEC)聚丙締酷胺葡聚糖S-200柱上（GEHealthcare)。沈C洗出液为0.2ym过滤 (Minisart注射器过滤器）（Sartorius-Stedim)并且在-70°C冷冻。
[0114] 表4列出了一些非限制性材料，表5列出了一些非限制性装置。表6-8提供了更 多的色谱细节。
[0115] 表4-材料
[0116]
[0117]表5-装置[011引
[0122] 表7 -示例性ConA色谱方法
[0123]
[0124] 表8 -示例性聚丙締酷胺葡聚糖S-200HR色谱方法
[0125]
[0126]分析沈-HPLC
[0127] 使用具有TosohBioscienceTSK-凝胶G3000SWXL7. 8x300mm柱的DionexHPLC 仪器（累P580,自动进样器ASI-IOO/ASI-IOOT注射器，UV/VIS检测器UVD340U，C虹omeleon 6. 80软件）进行分析尺寸排阻（S巧。憐酸盐缓冲溶液（PB巧用作流动相并且注入<50yg 或100yg的样品。在样品之前和之后运行参考标准和25%GFS(胃流体模拟物）。通过W 流速0.Iml/min运行流动相（PB巧使柱平衡。W20min的运行时间和Iml/min的流速，使 用等度分离方法进行分离。柱溫箱设置在25°C和样品固定器为8 °C。
[012引等电点聚焦（IE巧：在IEF凝胶（Novex，LifeTechnologies,NY，美国）上，W P册-7和抑3-10根据制造商的指导分离CTLA4-FasL。
[0129]His6-标签蛋白：用化s6标签形式的CTLA4-FasL24进行体外实验。比较标签 His6CTLA4-FasL的活性与纯化的非标签CTLA4-FasL的活性并且发现是相同的（未显示）。
[0130] 细胞系。肝腺癌SK-HEP-1细胞系、A498肾癌细胞系和RajiB细胞淋己瘤细胞系 购买自ATCC(Manassas,Virginia,美国）。其他淋己腺细胞系由W色列耶路撒冷化dass址 化brew大学医学中屯、的基因治疗学院和肝脏病学部友好馈赠。附着的细胞在补充有10% FBS、2mM谷氨酷胺、lOOIU/mL青霉素和lOOyg/mL链霉素的DMEM(Gibco)中生长，并且使用 膜蛋白酶-邸TA溶液脱附着。悬浮的细胞在具有相同添加剂的RPMI(Gibco)中生长。所有 的细胞系在37°C、6%C02中培养。
[0131] 免疫组织化学
[013引B细胞淋己瘤组织微阵列灯MA)WSBiomax;#LM801a，具有临近正常淋己结和脾 组织的淋己瘤组织阵列作为对照，80例）石蜡切片在二甲苯（3x3'）中去除石蜡并且在梯度 醇（3x1' 100%乙醇；3x1'96%乙醇）中再水化。在3% &化中解育5'W使内源过氧化物酶 失活之后，载玻片在巧樣酸盐缓冲液（P册；#005000 ;Invitrogen)中解育并且在电高压锅 值C2000;BioCareMedical)中煮沸用于抗原提取。在CAS-BL0CK巧00-8120 ;Invitrogen) 中封闭样品20'然后用一抗在4c潮湿箱中解育过夜（见下表）。
[0133]冲洗（3x2'，在SuperSensitive冲洗缓冲液中，細K583-5K;BioGenex)之后，在 RT条