件下用相关二抗样品解育30'（见下表）。二氨基联苯胺值AB;UltraVision探测系 统，TA-125-HDX，Thermoscientific)根据制造商说明用作色原，并且在苏木精（MHS16， 516魁-41化1油）中的解育20"用作细胞核相反染色。脱水步骤（2'80%乙醇，2'96%乙醇， 2' 100%乙醇，2'二甲苯）和固定化istomount固定液，#0080-30Jnvitrogen)之后，使用 Ariol化50自动机器人成像分析系统，根据制造商说明量化染色强度。
[0134]表 9A- -抗
[0135]
[0136]表9B-二抗
[0137]
[0138] FACS分析
[0139] 在FACS管中用PBS冲洗约IxlO6细胞并且再悬浮于95ul的染色缓冲液（PBS中 的1 %BSA、0. 1 %叠氮化合物）和加1的人Fc封闭剂巧422302 ;e-Bioscience)，并且在冰 上解育5'。添加适当的抗体/亚型（见下表10A和10B)并且在黑暗下冰上解育30'。用 PBS冲洗细胞，再悬浮在350ul染色缓冲液中，并经40uM过滤器过滤至洁净FACS管并且在 冰上保持在黑暗中直到通过抓?LSRII流式细胞计数器分析，根据制造商说明进行分析； 每个样品计数20, 000次事件。使用Cell如est软件度ectonDickinson)分析数据。
[0140] 表10A-抗体列表
[0141]
[0144]通过Gyrol油的CTLA4-FasL量化
[0145] 为了有效量化CTLA4-FasL开发了Gyrol油平台免疫试验（Gyrol油工作站， Gyros)。该免疫分析使用捕获并且通过对CTLA4-FasL不同区域具有特异性的两个不同抗 体探测。利用离屯、力通过包被抗CTLA4抗体的链霉抗生物素珠转移测试的样品，其包装在 微柱（15nL)中并且通过结合柱中产物的抗化sL抗体的检测通过激光器诱导巧光进行量 化。
[0146] 选择抗人CTLA-4多克隆山羊抗体（AF-386PB，Ran曲Systems)作为捕获抗体。使 用秋粘虫（frugiperda)昆虫卵巢细胞系Sf 21中表达的重组人CTLA4 Ala37-Phel62(登 记号#Q6GR94)产生多克隆抗体。使用EZ-linkSul化-N服-LC-生物素使多克隆抗体生物 素化，如在试剂盒提供的说明中描述。通过尺寸排阻吸附柱纯化生物素化的材料并且将材 料保存在PBS中。
[0147] 选择抗人Fas配体单克隆小鼠IgG2B抗体（MAB-126,Ran曲系统）作为探测抗体。 使用在中国仓鼠卵巢细胞系CH0中表达的重组人Fas配体/TNFSF6、Prol34-Leu281 (登记 号#?48023)产生单克隆抗体。使用AlexaFluor? 647单克隆抗体标记试剂盒，使单克隆 抗体为Alexa标记的，如在试剂盒提供的说明中描述。通过使用试剂盒中包括的尺寸排阻 吸附柱纯化标记的材料。Alexa标记测量为6. 9Alexa/Ab并且用PBS中的1 %BSA将材料 稀释至1yM并且保存在冰箱中。
[014引通过离屯、力利用包被抗CTLA4抗体的链霉抗生物素珠转化CTLA4-FasL样品，其包 装在微柱（15nL)中并且通过探测在柱中结合CTLA4-FasL的抗化sL抗体通过激光器诱导 巧光进行量化。
[0149] 体外活性生物测定
[0150] 为了体外检查对不同人细胞系的CTLA4-FasL细胞毒素作用，将50ul的没有酪红 的完全RPMI(悬浮的培养物）或DMEM(附着的细胞）培养基中32, 000个细胞每孔（悬浮 的培养物）或8000个细胞每孔（附着的细胞）一式=份接种在平的96孔板中（培养品 或类似物），并添加50ul的CTLA-4 ?FasL(或hiseCTLA-4 ?FasL)稀释物（在生长培养基 中；30(K)ng/na-0.Ing/ml，一式S份）或稀释的培养基作为阴性对照。校准曲线孔对于悬 浮的培养物包含64, 000至2000细胞每孔的连续稀释物，或对于附着的细胞包含16, 000至 2000细胞，一式S份。在37c5%C02潮湿培养箱中将平板解育24小时。通过MTS试剂盒 (Promega，CellTiter96饭水性非放射性细胞增殖分析）根据制造商说明量化细胞活力。
[0151] 小鼠疾病模型
[0152] 异种移植淋己瘤模型：4-6周龄无胸腺-雌性裸小鼠（Harlan,W色列）在限定的 植物条件下在化brew大学无病原体动物设施中饲养。所有的实验由化brew大学的动物 护理委员会批准。从皮下JY异种移植肿瘤收获在该研究中使用的JY细胞，并且在培养中 扩展。照射小鼠（300时，并且两天后，收获指数生长的JY细胞，用PBS冲洗，并且皮下注射 (7-lOx106/小鼠）至小鼠的右侧隐窝。当在第5天肿瘤明显时，开始治疗。通过每天两次 100微升皮下注射CTLA4-FasL或媒介缓冲液（PBS)，治疗小鼠4天。通过微测量器测量肿 瘤尺寸并且通过方程式：(w2*长度/2)计算体积。处死带有〉1000mm3肿瘤或坏死肿瘤的 小鼠。在一些实验中，并且为了进一步评估CTLA4-FasL对JY-衍生肿瘤的作用，在注射第4 天（20微克CTLA4-FasL每天）第一次注射后一个小时处死小鼠。去除SC肿瘤并且在4% 甲醒中固定，常规处理，并且嵌入石蜡中。用苏木精和伊红（Han祀）染色横切面巧ym)。
[0153] 用于淋己腺癌的小鼠/小鼠模型：Ba化/c小鼠静脉内注射200ulPBS中的 1又1068(31-1细胞（鼠8细胞白血病脾细胞；1?6'记1曰￥1115，化化'6，￥ 272，口 624，1978)。从 第二天，通过每天两次lOOul皮下注射CTLA4-FasL或媒介缓冲液（PB巧治疗小鼠3. 5天。 通过测量小鼠体重、脾重量和血液计数监测疾病参数。
[0154] 药物动力学：为了分析药物动力学，皮下注射不同剂量的CTLA4-FasL至小鼠，总 体积为150微升/小鼠。在注射后的不同时间点处死小鼠。在肝素中收集血液，保存在 冰上，WlOOOg(~3000巧m)离屯、10'，血浆保存在-70c。通过LEGENDMAXTM人可溶性 CTLA-姐LISA试剂盒度iolegend#437407)，根据制造商说明量化CTLA4-FasL。
[0155] 结果和讨论-纯化
[0156] 如之前的结果显示，发现CTLA4-FasLW本文所述的同源六聚体或约250kD的多聚 体的形式最稳定。不希望受单个假设的限制，基于数据相信，该高度稳定形式的CTLA4-FasL 事实上是溶液中的同源六聚体；但是，应当注意，数据明确支持蛋白是约250kD分子量的多 聚体的概念。
[0157] 运样的结果是令人吃惊的，因为之前的作者未认识到CTLA4-FasL当分泌至细胞 培养基时，实际上优选形成运样的稳定同源六聚体，并且该优选形式在溶液中的纯化期间 维持其构造。此外，之前的作者未认识到该形式是CTLA4-FasL在溶液中的高度稳定形式， 并且优选包含同源六聚体形式的纯化峰包含CTL4-FasL融合蛋白的大部分体外功能活性。
[0158] 如之前叙述，为了产生融合蛋白CTLA4-FasL将编码与人尿激酶信号肤连接的 CTLA4-FasL人序列的基因克隆至表达载体（图1)并且转染至CH0-S细胞。分离的生产克 隆表达和分泌CTLA4-FasL至生长培养基。
[0159]使用人CTLA-4和化sL二者的单克隆抗体（未显示），进行生产培养基的蛋白印迹 分析，显示与两个抗CTLA4和抗化sL都特异性反应的条带。尽管CTLA4-FasL的预测分子 量是约31kD，CTL4-FasL融合蛋白作为约43kD的蛋白在还原型SDS-PAGE中迁移。过去没 有研究CTLA4-FasL的计算和观察的分子量之间的差异，并且通过用"肤N-糖巧酶F"酶处 理生产培养基样品，从蛋白去除N-聚糖链，随后进行蛋白印迹分析，发现用酶的处理使得 分子量从~45kDa转变至~33kDa，其提示MW的显著差异是由于蛋白糖基化（图2)。
[0160] 纯化该蛋白的初始尝试不成功。如表11(包括在图中）中显示，使用本领域已知 的色谱方法，比如过去已经证实可靠的和成功用于其他蛋白的例如阳离子交换、阴离子交 换和疏水相互作用色谱，尝试从宿主-细胞蛋白纯化出蛋白，但不能W其预期的分子量和 PI成功纯化CTLA4-FasL。
[0161] 利用CTLA4-FasL的糖基化，开发了初步的纯化方法，其中伴刀豆球蛋 白-A(Con-A)色谱用作主要捕获步骤，随后进行尺寸排阻色谱（SEC)，产生(：化44斗曰社，通 过SDS-PAGE测量纯度超过90% (图3)。
[0162]CTLA4-FasL的理论等电点（pi)是6. 59。为了测量实际蛋白pl，通过等电聚焦分 析纯化的CTLA4-FasL。令人吃惊地，蛋白的实际pi是约4. 5,与理论的显著不同。图4A显 示抑为3-10的等电聚焦，而图4B显示抑为3-7的等电聚焦。
[0163] 对恶性的和非恶性的人细胞系，测量纯化的CTLA4-FasL的体外杀伤活性，并且 在图5中可见，蛋白对非恶性的细胞系几乎没有作用，而对特定癌细胞显示了明显的杀伤 作用，对淋己腺癌系具有预料不到的增强作用（参见例如2013年3月18日提交的美国专 利专利申请号13824423,其至少一个共有发明人和所有人与本申请相同）。用早期标记 形式的CTLA4-FasL进行图5中总结的一些实验（DranitzkiE化alel等，international Immunology, 19 卷，2007, 355-363 页；和Orbach等，AmericanJofpathology, 177 卷， 2010,3159-3168页）。下面提供了CTLA4-FasL的抗癌活性的特异性的进一步的讨论。
[0164] 为了进一步研究CTLA4-FasL的实际结构，通过凝胶-过滤色谱初始分析纯化的 CTLA4-FasL(尤其通过在Seperose-。柱（GEHealthcare,lOOx1.6cm~200ml)上运行纯 化的CTLA4-FasL(在ConA/SEC色谱之后））。图6中可见，约87ml的CTLA4-FasL馈分的蛋 白峰，与过氧化氨酶的类似，MW为232kD;因此，运些结果表明大部分CTLA4-FasL蛋白迁移 为约250kD的峰。
[0165] 因为该观察到的约250kD的产物大小显著大于其他人提出的预测的同源S聚体 (例如，~130kD)，通过分析尺寸排阻高效液相色谱（SE-HHX)和天然-PAGE来W更高的 分辨率研究实际产物大小，如图7A中所显示。令人吃惊地，发现约90%的CTL4-FasL融合 蛋白在SE-HPLC中迁移为约250kD的峰，其与同源六聚体的尺寸一致，而发现剩余的蛋白 (~10% )大部分为更高分子量（HMW)的峰。当通过第二高分辨率技术，即天然-PAGE分析 样品时，发现了相同的图案；大部分蛋白迁移为250kD条带W及约两倍尺寸的次条带，即， 500kD(图7B)，其与如本文所描述的十二聚体形式一致。
[0166] 为了测试CTLA4-FasL同源六聚体结构是否仅仅在高浓度的纯蛋白制品下形 成，在进行任何纯化之前，在收获的生产培养基上进行类似的SE-HPLC分析，并且通过 CTLA4-FasLGyrol油分析量化在SE-HPLC馈分中的CTLA4-FasL的量。图8中可见，收获培 养基中的大部分CTLA4-FasL对应大的SE-HPLC峰，保留时间与CTLA4-FasL同源六聚体的 相同，表明在进行任何纯化之前，大部分CTLA4-FasL融合蛋白在收获培养基中已经为同源 六聚体结构；但是可见，即使在纯化之前，约5%的CTL4-FasL融合蛋白为十二聚体形式，如 通过保留时间测定。
[0167]CTLA4-FasL的天然化学计量关系对其活性具有巨大的功能意义，因为化sL相关 的细胞调亡的最佳功能预测为与两个FasLS聚体、即同源六聚体的形成相关，其激活在祀 细胞膜的两个化sRS聚体（Holler等，MOLECULARANDCELLULARBIOLOGY, 2003 年 2 月， 1428 - 1440 页。Eisele等，Neuro-oncology13似：155 - 164,2011)。因此，CTLA4-FasL 的同源六聚体预测为比其他低聚形式更有能力。为了测试该理论，进行CTLA4-FasL的制备 型沈C并且比较代表同源六聚体的馈分与代表更低和更大CTLA4-FasL低聚体形式的馈分 的生物活性。通过Con-A色谱且随后在Superdex200柱上的沈C分馈，部分纯化浓缩的净 化收获物。然后，通过SEC-HPLC分析沈C馈分并且不同产物类型的相对百分数巧50kD产 物（主峰）、低分子量（LMW)和高分子量（HM，推测十二聚体形式）]示于表12中。
[0168] 表12 -不同沈C馈分的沈C-HPLC分析结果
[0169]
[0170] 然后汇总具体的馈分，W表示四种不同的产物类型（250kD，HM(十二聚体）， LMW1，LMW2)并且库的轮廓可在图9A中看到。研究四个库的生物活性，并且在图9B中可见， 比较的蛋白量的馈分确实显示生物活性的差异，同源六聚体的馈分显示最高杀伤活性。有 趣地，包含十二聚体的馈分也显示高的体外活性。
[0171] 为了评估CTLA4-Fas