毒性效 应，并且运些效应的研究显示肝毒性连同细胞因子水平的急剧增加（数据未显示）。因 为SEC-HPLC和天然-PAGE分析已经显示超过90%的纯化蛋白制剂是同源六聚体结构 (250kD)，而剩余的5-10%是与同源十二聚体结构巧OOkD) -致的较高分子量（HMW)形式， 进行实验W确定与该制剂相关的效力和/或毒性是否为同源六聚体或十二聚体导致的结 果。
[0200] 图20显示与六聚体相反，十二聚体对小鼠体内肿瘤的作用。简言之，用2. 5ug纯 化的CTLA4-FasL制剂（>90%同源六聚体）、0. 25ug纯化的曲柳馈分（表示10%的混合制 品）和作为对照的PBS，每天两次治疗3组具有皮下JY异种移植肿瘤的无胸腺裸小鼠4 天。HM#11馈分是十二聚体，而标记"CTF-RT"的线是纯化的（包含至少90%)同源六聚 体制品。结果指示CTLA4-FasL制品显示的肿瘤尺寸的下降是同源六聚体结构的结果而不 是5-10%十二聚体污染物的结果。
[020。 为了研究毒性，进行实验，W测定由于肝功能障碍释放至血清的ALT/AST酶的水 平（图21，每个数表示单个注射的小鼠），和小鼠血清中细胞因子水平表征的免疫相关性 (图22,每个数表示单个注射的小鼠）。
[020引用lOug或50ug的CTLA4-FasL制品、lOug纯化的曲柳（十二聚体）馈分和作为对照 的PBS注射小鼠。注射后5小时收集血液。使用Reflotron测试条带（Roche)进行来自血清 的ALT/AST的定量测定。通过流式细胞术（FAC巧使用Flow切tomix试剂盒（eBioscience) 测量血清中细胞因子的检测。细胞因子检测如下：比-5(图22A);比-6(图22B) ;IFN-丫（图 22C) ;IL-10 (图 22D);和TNF-a(图 22巧。
[0203] 图21中可见，HMW十二聚体馈分相比CTLA4-FasL制品（>90%六聚体）造成显著 更高的肝毒性。令人吃惊地，其不是细胞因子血清水平的情况（图22中显示），其显示注射 六聚体和十二聚体制品二者之后类似的升高。
[0204] 总体讨论
[0205] 在该研究中，研究了信号转化蛋白CTLA4-FasL作为恶性细胞的潜在细胞调亡诱 导剂的独特特性。不希望被封闭的列表所限制，至少一些发现包括下述：1.CTLA4-FasL天 然地形成稳定的同源六聚体；2.CTLA4-FasL诱导恶性细胞系的强健的细胞调亡，而对于 非恶性的细胞系相对微弱；3.当两种相关的受体（例如B7和化sR)在祀细胞上表达时， CTLA4-FasL杀伤作用是更有效的；4.甚至在非表达B7的细胞中，CTLA4-FasL显示出比其 部分、单独或组合显著更高的细胞调亡活性点CTLA4-FasL有效抑制异种移植模型中人B 细胞谱系肿瘤的生长。
[0206] 相信双特异性和多特异性生物药物开发为"下一代"基于蛋白的药物。两个已知 的生物祀的大部分结合功能单元，该药物开发领域当前通过双特异性抗体引导，而其他双 特异性技术，比如信号转化蛋白，也被评估。不被封闭的列表所限制，在双特异性生物药物 高于仅包括一个祀的现有生物药物的许多优势中是显著的协同作用，其不能通过简单地施 用单独或组合的功能活性单元获得。运些增效作用主要表明源于双功能分子的能力来同时 地影响两个或更多个生物途径。注意，通过CTLA4-FasL诱导的有效的细胞调亡活性可见于 表达功能Fas受体和B7受体二者的人B细胞淋己瘤细胞中，运支持多于一种生物信号传导 途径参与的观念。的确，在表达B7的细胞中，CTLA4-FasLW非常低的浓度激起半脫天冬白 酶的级联的激活和消除抗细胞调亡信号，其为通过CTLA4-FC、S化sL或其组合不能模仿的 现象。重要地，运也提示测量患者肿瘤样品中化sR、CD80和CD86的表达可用作患者治疗选 择的生物标记。
[0207] 有趣地，当与非表达B7的细胞一样解育时，CTLA4-FasL的效能高于化sL、 CTLA4-FC或后两者的组合，使得对于其强健效能的其他解释貌似合理。W上呈现的数据表 明高阶结构在运些新的双特异性药物的活性和效能中可起到显著的作用，诸如例如本文所 述的同源六聚体结构。
[0208] 如对于其他TNF-超家族成员所报导的，Fas细胞调亡途径的激活需要当结合化sL S聚体时Fas受体的S聚化。而且，先前显示有效的Fas激活需要两个相邻的运种S聚化 事件。所W，可溶性CTLA4-FasL的天然化学计量关系是同源六聚体的发现对于理解其独特 的、强健的细胞调亡性能具有重要意义。作为六聚体，CTLA4-FasL能够呈递化sL的两个功 能=聚体至其相关受体，产生细胞调亡信号传导途径至恶性细胞的最佳启动。
[0209] 先前提示了膜结合CTLA4-FasL同源六聚体的形成。因为在早期研究中仅鉴定 了同源S聚体，作者提出当错定至B7分子时，两个CTLA4-FasLS聚体可在祀细胞的表面 形成同源六聚体，从而诱导极其有效的细胞调亡作用，运将解释该报告中观察的高效的 CTLA4-FasL。此处呈现的数据表明CTLA4-FasL早在其产生时天然地形成可溶性和稳定的 同源六聚体，并且该结构通过包括恶劣条件和多个冷冻/融化循环的纯化方法保持其稳定 性（图10,先前描述）。六聚体结构可通过CTLA4天然地形成二硫键连接的二聚体、而化sL 天然地形成稳定的S聚物的事实来解释，因此，如在图24中提示，CTLA4-FasLS聚物将具 有可连接一个运样的S聚物至第二个S聚物的"开放的半脫氨酸"，形成稳定的CTLA4-FasL 同源六聚体。
[0210] 如上所述，十二聚体生成的一种可能可任选地通过较不稳定的"二聚体的=聚物" 六聚体发生。运样的十二聚体已经显示引起小鼠中的肝毒性。所W根据至少一些实施方式， 优选地CTLA4-FasL融合蛋白具有小于10 %的十二聚体、小于7. 5 %的十二聚体、小于5 %的 十二聚体、小于2. 5 %的十二聚体或小于1 %的十二聚体。
[0211] 使用异种移植人-小鼠疾病模型，其显示CTLA4-FasL具有抑制起源于B淋己细胞 系的肿瘤的生长、和W剂量依赖性方式和W非常低的剂量对小鼠存活提供显著有益的效果 的能力。其显示该体内效果通过半脫天冬白酶级联的激活介导，如通过肿瘤的免疫组织化 学中增加的裂解半脫天冬酶3可见。
[0212] 总之，数据表明融合蛋白CTLA4-FasLW高度有效的方式体外和体内诱导B幼成淋 己细胞的有效的细胞调亡。而且，在表达B7的细胞的情况中，其效能源于将消除抗细胞调 亡信号传导时激活半脫天冬白酶的级联的其增效作用与其独特的天然六聚体结构组合。不 希望被单个假设限制，看起来运种特性的组合使得CTLA4-FasL为至少表达B7的肿瘤、比如 B细胞淋己瘤的极其潜在细胞调亡诱导剂。
[0213]虽然参考有限数目的实施方式描述了本发明，但是认识到可做出许多变型、修饰 和本发明的其他应用，并且实施方式的各种组合和子组合也是可能的并且包括在该申请的 范围内。
【主权项】
1. 一种稳定的CTLA4-FasL融合蛋白，其包含大部分作为同源六聚体的CTLA4-FasL融 合蛋白。2. -种稳定的CTLA4-FasL融合蛋白，其包含大部分作为分子量约250kD的多聚体的 CTLA4-FasL融合蛋白。3. -种稳定的CTLA4-FasL融合蛋白，其包含不多于5 %的作为十二聚体的CTLA4-FasL 融合蛋白。4. 一种稳定的CTLA4-FasL融合蛋白，其包含不多于5%的作为分子量约500kD的多聚 体的CTLA4-FasL融合蛋白。5. -种稳定的CTLA4-FasL融合蛋白，其中在溶液中，大部分融合蛋白为同源六聚体形 式。6. -种稳定的CTLA4-FasL融合蛋白，其中在溶液中，大部分融合蛋白为分子量约 250kD的多聚体。7. -种在细胞培养基中的细胞中表达之后纯化CTLA4-FasL融合蛋白的方法，包括分 离细胞培养基与细胞，所述细胞培养基包含大部分作为同源六聚体的CTLA4-FasL融合蛋 白。8. -种在细胞培养基中的细胞中表达之后纯化CTLA4-FasL融合蛋白的方法，包括 分离细胞培养基与细胞，所述细胞培养基包括大部分作为分子量约250kD的多聚体的 CTLA4-FasL融合蛋白。9. 根据权利要求7或8所述的方法，进一步包括将所述细胞培养基施加至尺寸排阻色 谱（SEC)柱。10. 根据权利要求9所述的方法，进一步包括在施加至所述SEC柱之前，将所述细胞培 养基施加至伴刀豆球蛋白-A(ConA)柱。11. 根据前述权利要求中任一项所述的方法或蛋白，其中所述同源六聚体形式占总融 合蛋白的至少51%。12. 根据权利要求11所述的方法或蛋白，其中所述同源六聚体形式占总融合蛋白的至 少 60% 〇13. 根据权利要求12所述的方法或蛋白，其中所述同源六聚体形式占总融合蛋白的至 少 70% 〇14. 根据权利要求13所述的方法或蛋白，其中所述同源六聚体形式占总融合蛋白的至 少 80%。15. 根据权利要求14所述的方法或蛋白，其中所述同源六聚体形式占总融合蛋白的至 少 90%。16. 根据前述权利要求中任一项所述的方法或蛋白，其中所述同源六聚体形式是纯化 之前的主要形式。17. 根据前述权利要求中任一项所述的方法或蛋白，其中所述同源六聚体形式是纯化 之后的主要形式。18. 根据前述权利要求中任一项所述的方法或蛋白，其中所述十二聚体形式不多于总 融合蛋白的5%。19. 根据权利要求18所述的方法或蛋白，其中所述十二聚体形式不多于总融合蛋白的 4%〇20. 根据权利要求19所述的方法或蛋白，其中所述十二聚体形式不多于总融合蛋白的 3%〇21. 根据权利要求20所述的方法或蛋白，其中所述十二聚体形式不多于总融合蛋白的 2%〇22. 根据权利要求21所述的方法或蛋白，其中所述十二聚体形式不多于总融合蛋白的 1%〇23. 根据前述权利要求中任一项所述的方法或蛋白，其中所述十二聚体形式是纯化期 间的主要形式。24. -种药学组合物，其包含大部分作为同源六聚体的CTLA4-FasL融合蛋白，和药学 上可接受的载体。25. -种药学组合物，其包含根据前述权利要求中任一项所述的CTLA4-FasL融合蛋 白，和药学上可接受的载体。26. -种组合物，其包含大部分根据前述权利要求中任一项所述的CTLA4-FasL融合蛋 白。27. -种治疗受试者中癌症的方法，包括：确定癌症是否表达B7受体；以及如果癌症表 达B7受体，施用CTLA4-FasL融合蛋白至所述受试者。28. 根据权利要求27所述的方法，其中确定癌症是否表达FasR和B7受体，使得如果癌 症表达B7受体和FasR，施用CTLA4-FasL融合蛋白至所述受试者。29. 根据权利要求28所述的方法，其中施用CTLA4-FasL融合蛋白包括施用大部分作为 同源六聚体的CTLA4-FasL融合蛋白至所述受试者。30. 根据权利要求27-29中任一项所述的方法，其中所述CTLA4-FasL融合蛋白是根据 前述权利要求中任一项提供。31. -种治疗受试者中淋巴腺癌的方法，包括施用根据前述权利要求中任一项所述的 CTLA4-FasL融合蛋白至所述受试者。32. -种治疗受试者中淋巴腺癌的方法，包括根据前述权利要求中任一项施用 CTLA4-FasL融合蛋白至受试者。33. -种稳定的同源六聚体SCP融合蛋白，其包含组分1蛋白和组分2蛋白，其中所述 组分 1 蛋白选自由BTN3AI、CD27、CD80、CD86、ENG、NLGN4X、CD84、TIGIT、CD40、IL-8、IL-10、 CDl64、LY6G6F、CD28、CTLA4、TYROBP、ICOS、VEGFA、CSFl、VEGFB、BMP2、BMP3、⑶NF、PDGFC、 TOGFD、TGFB1、LY96、⑶96和GFER组成的组；并且其中所述组分2蛋白包括任何TNF-超家 族配体。34. 根据权利要求33所述的蛋白，其中所述组分2蛋白优选地选自由FasL、TRAIL、 TNF-a、TNF-P、0X40L、CD40L、CD27L、CD30L、4-1BBL、RANKL、TWEAK、APRIL、BAFF、LIGHT、 VEGI、GITRL、EDAl/2、淋巴毒素a和淋巴毒素0组合的组。35. 根据权利要求33或34所述的蛋白，其中CTLA4、LY6G6F、CD28、LY96、CD96和CD247 形成二硫键，以形成同源六聚体。36. 根据权利要求33-35中任一项所述的蛋白，包括所述组分1蛋白的细胞外结构域和 所述组分2蛋白的细胞外结构域。37. 根据权利要求36所述的蛋白，其具有N-末端侧和C-末端侧，所述N-末端侧为所 述组分1蛋白的细胞外结构域，所述C-末端侧为所述组分2蛋白的细胞外结构域。38. 根据权利要求33-37中任一项所述的蛋白，其中所述同源六聚体通过在融合蛋白 的部分之间形成共价键、非共价键或其组合而形成。
【专利摘要】一种稳定的融合蛋白，其中在溶液中，大部分融合蛋白为同源六聚体形式，其可制备为例如CTLA4-FasL融合蛋白。
【IPC分类】C07K14/705
【公开号】CN105026424
【申请号】CN201380074192
【发明人】迈克尔·德兰尼茨基埃尔哈勒, 诺姆·沙尼
【申请人】卡尔医疗有限公司
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2013年12月31日
【公告号】CA2896989A1, EP2941438A1, WO2014106839A1