浓度的方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于汞离子检测领域，涉及一种采用DNA检测汞离子浓度的方法，尤其是 一基于DNA三叉结构的荧光探针检测Hg 2+浓度的方法及应用。 技术背景
[0002] 汞被认为是分布最广泛的重金属污染物之一，以不同的形式存在（有机、无机形 式存在或者作为复合物）于环境当中，可以通过食物链在人体内富集，汞摄入过量会引起 许多健康问题，例如：DNA损伤、脑损伤、器官功能损坏、免疫系统内稳态的破坏。在水生生 态系统中，二价汞离子（Hg 2+)的生物甲基化会产生神经和基因毒性的甲基汞，所以开发对 环境和食品中Hg2+的检测十分必要。
[0003] Katz在1963年提出，当在天然DNA中加入汞离子后，汞离子会导致DNA中胸腺嘧 啶的滑动并形成由汞离子连接的金属离子碱基对，并提出了汞离子与胸腺嘧啶以1 :2的比 例形成了 T-Hg2+-T结构的假设，这个假设也在后面的研究中被证实了。近年来，日本科学 家Akira Ono和Humika Togashi小组用恪解曲线、电喷雾电离-质谱和核磁共振等手段 证实了汞离子在DNA中形成T-Hg2+-T结构，将两个胸腺嘧啶桥连在一起的（如图7)，并且， T-Hg 2+-T的形成不会对DNA的双螺旋结构及电子传递特性产生明显影响。
[0004]目前检测汞离子的方法有电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS)、原子吸收光谱测定 法（AAS)、氢化物发生-原子荧光光谱法、冷蒸汽原子荧光光谱等几种。尽管这些方法具有 高度灵敏性，能进行多组分分析，但是成本高，耗时长并且操作复杂，随后又发展了一些基 于有机发色团、有机荧光小分子以及共辄聚合物的传感技术。这些方法相对于传统方法具 有简单、经济、快速的优势，但是却有水溶性差、灵敏度低、选择性局限的缺点，因此，人们迫 切需要简便、快速、经济、准确的Hg 2+检测分析方法。
[0005] 荧光分析法是一种由试样溶液中荧光物质所发生的荧光强度的变化来测定试样 溶液中荧光物质含量的方法，它具有简单快速、灵敏度高、选择性好等多种突出优点。DNA 荧光探针对生物分子影响较小，荧光信号具有分析检测手段简单，灵敏度高等优势。在以往 的研究中，已经开发出来一种基于分子信标（molecular beacon, MB)的方法，基本的思路是 在萊离子的作用下'打开'（turn-on)或者'关闭'（turn-off)分子新标，以造成可检测的 荧光值的变化，根据此来检测溶液中二价汞离子的浓度（具体原理见图7)，这种方法相对 简单，易操作，灵敏度高，但是分子信标的两端被焚光发色团（fluorophore)和焚光猝灭团 (quencher)占据，这就可能影响了其他标记的用，更重要的是这种分子信标的方法容易出 现假阳性的问题，这些都影响了其在实践中的应用。
[0006] 现有专利文献中公开了与本申请相关的几篇专利文献，具体内容如下：
[0007] CN102912011A公开了一种基于寡核苷酸链的荧光增强型Hg 2+检测芯片及方法，利 用了 Hg2+能特异性地与两条相邻全胸腺嘧啶（T)寡核苷酸链上的T碱基共价结合，形成稳 定的分子间T - Hg2+-T结构，进而诱导与全T寡核苷酸链杂交的互补链的释放。制备包括 三个步骤：首先将检测探针固定在经化学修饰的玻片上，然后将荧光标记以及淬灭基团标 记的互补链分别与其杂交。使用芯片时只需将待测样品添加到芯片上并保持一段时间，冲 洗后利用荧光芯片信号分析系统扫描芯片，通过分析荧光信号的变化即可实现对Hg2+的检 测。样品中Hg 2+浓度越高，荧光信号增强得越多。检测的Hg2+的浓度范围是10nM-100yM， 具有很好的离子选择性。
[0008] CN104263837A公开基于三重信标修饰的金纳米粒子三聚体的表面增强拉曼散射 效应检测水溶液中Hg 2+和/或Ag +的方法，属于重金属离子的检测技术领域。包括通过制 备BPS包裹的金纳米粒子、设计核酸探针、信标分子的修饰和重金属离子Hg 2+和/或Ag +的 检测等步骤。本发明提供了一种基于三重信标修饰的金纳米粒子三聚体的拉曼信号来检测 水溶液中二价汞离子和/或银离子的方法，并且可以做到同时检测这两种离子，此种方法 工作量少，节约成本，灵敏度高，方便快捷。
[0009] 最近发展起来的简单快速地检测Hg2+的方法中，许多都采用了分子信标的技术方 法，本发明不同于传统的分子信标的方法，设计应用了 DNA三叉结构，用于检测Hg2+的浓度。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的在于提供一基于DNA三叉结构的荧光探针检测Hg2+浓度的方法及应 用，本发明设计了一个基于DNA三叉结构（3WJ)的生物检测器，可以用于直接特异性的定量 检测Hg 2+的浓度，同时本发明还基于该方法，得出一种利用该结构检测生物巯基（如谷胱甘 肽和半胱氨酸）的浓度的方法。
[0011] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0012] 一种基于DNA三叉结构（DNA three-way junction, 3WJ)的焚光探针检测Hg2+浓度 的方法，其特征在于：采用三条单链DNA，其中第一条链标记了荧光基团HEX，第二条标记了 猝灭基团BHQ1，第三条链不作任何标记，其中标记了荧光基团HEX和标记了猝灭基团BHQ1 单链DNA富含胸腺嘧啶T，三条链在水溶液中共同形成稳定的DNA三叉结构。在该含有3WJ 的溶液加入含有Hg 2+，Hg2+能够介导SS和AS单链DNA中的胸腺嘧啶形成T-Hg 2+-T结构，将 标记了猝灭基团BHQ1单链DNA从DNA三叉结构中'推离'出去，DNA三叉结构变为双链DNA， 使标记了荧光基团HEX和猝灭基团BHQ1的两条DNA分开，BHQ1对HEX荧光的猝灭被解除， ffiX荧光值增加，HEX荧光值的变化与Hg 2+浓度存在线性关系，通过荧光值的变化，检测出 Hg2+的浓度。
[0013] 而且，所述三条单链DNA的序列如下：
[0014]标记了荧光基团 HEX 单链 DNA :5' -HEXCTCTGTCTGTTGCCTCCAGCGCCG-3'
[0015]标记了猝灭基团 BHQ1 单链 DNA :5，-ACAGACAGCCCACAAGACAGAGBHQ1-3'
[0016]无标记单链 DNA:5' -CGGCGCTGAACCAGGCTTCTGTCTGT-3'。
[0017] -种利用DNA中形成T-Hg2+_T结构检测谷胱甘肽和半胱氨酸浓度的应用。
[0018] 本发明的优点和积极效果：
[0019] 1、本发明的发明人经过一系列实验建立起来的荧光探针定量检测Hg2+的方法，检 测的标准曲线的相关系数R 2值为0. 997,线性良好，由此标准曲线检测出的Hg 2+浓度较准 确。
[0020] 2、本发明建立的检测方法检测限度低，最低检测限度为3nM，并且能够检测 上至500nM浓度的Hg 2+，检测范围较宽。美国环境保护署（US EPA，Environmental ProtectionAgency)规定饮用水中Hg2+的超标浓度为lOnM;世界卫生组织（World Health Organization)规定引用水中萊离子浓度不得超过30nM，本发明的检测限低于规定标准， 具备对应用水、食品等进行检测的能力。
[0021] 3、本发明基于汞离子可以被生物巯基（biothiols)螯合的作用，进而解除其在 T-Hg 2+_T中的作用，所以本3WJ检测器还可以用来检测谷胱甘肽和半胱氨酸等含有巯基的 化合物。发明人经过实验证明，该荧光探针用于检测谷胱甘肽相关系数R 2值为〇. 999,检测 范围为40nM-400nM，而用于检测半胱氨酸相关系数R2值为0. 996,检测范围为20nM-400nM。
[0022] 4、本发明设计的荧光探针，不仅可以准确地检测Hg2+的浓度，还可以在用于谷胱 甘肽和半胱氨酸的定量，该检测方法准确，检测范围较宽，方法简单快捷，易操作。
[0023] 5、本发明建立起来的检测方法对Hg2+检测的特异性强，对于A1 3+、Ca2+、Fe3+、Cu2+、 K +、Li2+、Mn2+、Ni2+、Zn2+等其他金属离子均没有作用。
【附图说明】
[0024] 图1为本发明基于3WJ DNA探针检测Hg2+的原理图；
[0025] 图2为3WJ探针加入Hg2+、谷胱甘肽、半胱氨酸后荧光值的变化；A是未经过退火 的3WJ ;B是经过退火的3WJ ;C是3WJ+Hg2+;D是含HEX修饰的单链DNA(SS) ;E是经过退火 的3WJ+Hg2++谷胱甘肽；F是经过退火的3WJ+Hg2++半胱氨酸。加入3WJ终浓度为5nM ;Hg2+ 浓度为500 y M;谷胱甘肽和半胱氨酸浓度为500 y M。
[0026] 图3为本发明检测体系的选择性，加入3WJ终浓度为5nM，所有金属离子的浓度为 500 yM ；
[0027] 图4为本发明不同浓度汞离子下3WJ荧光探针的荧光发射光谱。内插图：萊离子 浓度与荧光强度之间的线性关系；
[0028] 图5为本发明不同浓度谷胱甘肽下3WJ荧光探针的荧光发射光谱。内插图：谷胱 甘肽浓度与荧光强度之间的线性关系；
[0029] 图6为不同浓度半胱氨酸下3WJ荧光探针的荧光发射光谱。内插图：半胱氨酸浓 度与荧光强度之间的线性关系；
[0030] 图7为前人应用分子信标检测Hg2+浓度的示意图。
[0031] 具体的实施方式
[0032] 为了理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步说明：下述实施例是说明性 的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
[0033] 本发明设计一种DNA三叉结构作为生物检测器，其由三条单链DNA退火后组成，其 中第一条链标记了荧光基团ffiX (命名为SS)，第二条标记了猝灭基团BHQ1 (命名为Q