长。
[0034] 图3 :YCER)05正交试验极差分析。
[0035] 图4 :YCER)53正交试验极差分析。
[0036]图5 :内生真菌在不同营养组分培养基上的生长。
[0037]图6 :YCER)05固态发酵人工神经网络样本。
[0038] 图7 :YCER)053固态发酵人工神经网络样本。
[0039] 图8 :三层BP人工神经网络拓扑网络计算。
[0040] 图9 :BP算法流程图（韩力群，2006)。
[0041] 图10:人工神经网络遗传寻优过程：YCER)05 (左）、YCER)53 (右）。
[0042] 图11 :人工神经网络模型测试的菌株生长曲线。
[0043] 图12 :YCEF005使用BP-GA优化模型对培养基配方中的外加营养组分进行全局寻 优图。
[0044] 图13 :YCEF053使用BP-GA优化模型对培养基配方中的外加营养组分进行全局寻 优图。
[0045] 图14:菌株在优化后的生长曲线。
【具体实施方式】
[0046] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0047] 实施例1 :纯菌丝干重和核酸含量的线性关系
[0048] 纯菌丝体获得：二级种子培养液用8层纱布在灭菌锅的玻璃漏斗中过滤，并用无 菌水充分洗涤滤出物，收集滤出物，置于65°C烘干至恒重，可用上海STLK恒温干燥箱实现 烘干，保存备用。
[0049] 纯菌体中核酸的提取测定方法：精密称取0. 01、0. 03、0. 05、0. 1、0. 15、0. 2克纯 菌体，加入25mL5%的三氯乙酸溶液，装在50ml带盖的离心管中于80°C水浴（水浴锅，可 精准控制水浴温度）中提取25min，其间不断进行搅拌混匀，如来回翻转，取出后放置在预 先准备好的碎冰中冰浴冷却10分钟，然后用SIGM低温离心机，采用8000r/min，4°C离心 15min，离心完毕后用EPPEND0RF移液器小心吸取上清液，将上清液放置在另外的预先灭菌 烘干过的50ml的离心管中并稀释稀释2倍，以5%三氯乙酸作空白对照，测A260值，绘制标 准回归曲线。
[0050] 本发明中固态发酵物中真菌核酸的提取测定方法：取0. 25g烘干至恒重的培养物 在液氮中充分研磨，按照纯菌体中核酸的提取方法进行提取，未经发酵的固态基质采用同 样的方法处理作为空白对照，在260nm处测定提取液的A260值，通过标准回归曲线预测菌 丝干重如图1所示结果。由图1可知，两个烟草内生真菌菌株菌丝中的核酸量与菌丝干重 之间具有良好的线性关系，菌株YCER)05线性方程为y=10. 131x+0. 0332,R2= 0. 9995 ; 菌株 YCER)53线性方程为 y=11. 757x+0. 0716,R2= 0? 9988。
[0051] 菌丝干重一样的情况下，A260比值高的，说明菌丝中核酸的含量高，也就是发酵产 物的质量佳，可以此判断发酵基质的对真菌的合适度，同样条件下得到的发酵产物，A260比 值高的基质发酵效果优于低比值的。
[0052] 实施例2 :固态发酵培养组分优化
[0053] (1)发酵主要基质优化
[0054] 本发明中发酵基质选用：麸皮、米糠、豆饼粉、玉米碎粒。选用的原则是易取得，价 低，工业上易实现，均可通过市购的方式获得。
[0055] 首先进行发酵基质单因素实验：麸皮、米糠、豆饼粉、玉米碎粒各称取10g，初始含 水量50% (质量百分比），接种量20% (质量百分比），25°C静置培养7d，重复3次。对内 生真菌菌株YCEF005、菌株YCEF053分别进行麸皮、米糠、豆饼、玉米碎粒四种基质单因素试 验。其中YCER)05在米糠中不生长，实验结果表明，麸皮的A260比值在发酵后比其他发酵 基质具有更高的A260比值，所以得出结论麸皮是二株内生真菌的最佳培养单基质（图2)。
[0056] (2)固态发酵基质（混合）优化
[0057] 寻找到最佳的单因素发酵基质后，固态发酵基质（混合）可能会带来更优的发酵 效果以及更低的工业成本，本发明进行发酵基质正交试验设计：基于单因素试验筛选的最 佳单基质，配合另外3种基质，设计四因素三水平的正交试验（表1)，优化固态发酵基质组 合。
[0058] 表1固态发酵基质正交试验水平表
[0060] 以麸皮为主要基质，按L934正交表，设计豆饼粉、玉米碎粒、米糠四因素三水平正 交试验设计，获得Fusariumsp.YCEF005、Pyrenochaetasp. 2YCEF053 的最佳基质组合。 对于Fusariumsp.YCER)05,如图3所示，最佳基质组合是：麸皮50%、豆饼粉10%、米糠 20%、玉米碎粒20%。对于Pyrenochaetasp.2YCEF053最佳基质组合是：鼓皮60%、显饼 粉10%、米糠10%、玉米碎粒20%。
[0061] 表2YCER)05正交试验方差分析
[0065]同时，本发明设计了分别以纯麸皮和和本实施例中得到的最佳基质组合作为培养 基，对YCEF005和YCEF053进行了发酵效果测定，YCEF005最佳基质组合为麸皮50 %、豆饼 粉10%、米糠20%、玉米碎粒20%，YCER)53的最佳基质组合为麸皮60%、豆饼粉10%、 米糠10%、玉米碎粒20%。培养基初始含水量50% (质量百分比），接种量20% (质量 百分比），25°C静置培养7d，测定培养基中的核算含量，结果表明，优化过的发酵基质，BP: YCEF005最佳基质组合为麸皮50 %、豆饼粉10 %、米糠20 %、玉米碎粒20 %的发酵效果优于 纯麸皮；YCEF053的最佳基质组合为麸皮60%、豆饼粉10%、米糠10%、玉米碎粒20 %的发 酵效果也优于纯麸皮。
[0066] 表4纯麸皮和最佳基质培养基发酵效果比较
[0067]
[0068] (3)外加营养组分优化
[0069] 碳源是组成培养基的主要成分之一，碳源物质用于构成菌体细胞和各种代谢产 物，为机体提供生理活动所必需能量。常用的碳源包括各种能迅速利用的单糖、多糖及缓慢 利用的淀粉等多糖。本研究经筛选得到的蔗糖，较有利于烟草内生真菌菌株生长而且蔗糖 较廉价易得，作为碳源用于发酵具有可行性。
[0070] 氮源主要用于构成菌体细胞物质和含氮的代谢产物，氮源对菌体的生长发育有着 重要的作用。微生物对不同的氮源具有不同的利用能力，无机氮源的成分单一，质量稳定， 能被微生物快速利用，但当它作为唯一氮源培养微生物时，培养基会出现生理酸性或生理 碱性；有机氮源除了含丰富的蛋白质、肤类、游离氨基酸外，还含有少量的糖类、脂肪、无机 盐、生长因子等，是微生物发酵的理想营养物质。因此，本研究选择适宜的无机氮（硝酸铵 和硝酸钠）、有机氮（蛋白脉）配合使用，有利于烟草内生真菌的的生长繁殖。
[0071] 微量元素的供给微生物在生长繁殖和合成目的产物的过程中，都是需要无机盐和 微量元素作为生理活性物质的组成或合成十的调节产物，如磷是构成细胞、核酸和蛋白质 的必要元素，又是许多酶辅酶、高能磷酸键的组成部分，培养基中溶鳞过少不利于菌体的生 长和次级代谢产物的合成，同样溶鳞过多许多代谢产物的合成也会受到抑制。同时，磷酸盐 能够很好的维持发酵过程的酸碱平衡，使内生真菌在发酵过程稳定生长。
[0072] 添加营养组分由于营养更佳充足，会得到更佳的发酵效果。本发明设计了外加营 养对菌丝生物量的影响：在筛选出的固态培养基质中分别添加的营养组分（表4)，每个处 理3个重复，考察外加营养组分对菌丝生物量的影响。如碳源选择常见的葡萄糖，蔗糖和 麦芽糖；氮源分有机氮源和无机氮源，其中有机氮源选择蛋白胨和尿素，无机氮源选择硝酸 铵，硫酸铵和硝酸钠；磷酸盐选择磷酸氢二钾和磷酸二氢钾；镁离子选择硫酸镁；钙离子选 择硫酸钙和碳酸钙。
[0073] 表4外加营养组分
[0074]
[0075] 本发明基于外加营养单因素实验筛选得到的各类营养组分，按均匀试验设计8因 素6水平的24组试验，每个处理3个重复。
[0076]用于固态发酵的麸皮、米糠、豆饼粉、玉米碎来源便利、价格低廉，营养丰富，含有 淀粉质、纤维素和半纤维素等碳水化合物以外，还含有多种维生素和金属离子。麸皮作为微 生物生长的碳源（其中的B族维生素和生物素以及镁、磷、铁、钙等金属离子也是微生物必 需的生长因子）。同时，麸皮又能使培养基松散，从而改善通风状态，也有利于微生物生长。 本研究经过筛选，最终以麸皮作为烟草内生真菌固态发酵的主要原料，配合米糠、豆饼、玉 米碎粒按一定的比例组成固态发酵的基质，成本低，内生真菌生长的生物量大。
[0077] 测定每个培养基组合发酵产物的A260结果，得到图5结果，表明在最佳发酵基质 组合上，单因素试验确定外加碳源、氮源、磷酸盐、钙盐和镁盐对YCER)05、YCER)53生长的 影响，确定了外加营养组分的种类。以得到A260比值高的为选择依据，YCEF005外加营养 组分为蔗糖、蛋白胨、硝酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸钙；YCEF053发酵外加营养组分为 蔗糖、蛋白胨、硝酸钠、磷酸二氢钾、硫酸钙、硫酸镁。也就是说，YCEF005的固体发酵培养基 包括基质和外加营养组分以及水，其中基质包括60%麸皮、10%豆饼粉、10%米糠和10% 玉米碎粒（百分比为质量百分比），外加营养组分包括蔗糖、蛋白胨、硝酸铵、磷酸二氢钾、 硫酸镁、硫酸钙，水的含量为基质质量的50%，三者混匀高压灭菌后得到该固体发酵培养 基。YCEF053的固体发酵培养基包括基质和外加营养组分以及水，其中基质包括50%麸皮、 10%豆饼粉、20%米糠和20%玉米碎粒（百分比为质量百分比），外加营养组分包括蔗糖、 蛋白胨、硝酸钠、磷酸二氢钾、硫酸钙、硫酸镁，水的含量为基质质量的50%，三者混匀高压 灭菌后得到该固体发酵培养基。
[0078] 实施